使用径向水痕迷宫评估外伤性脑损伤小鼠模型中的空间记忆障碍

Summary

在这里，我们提出了一个不需要游泳的认知的小鼠特异性测试方案。该测试可用于成功地区分受控皮质冲击引起的创伤性脑损伤小鼠与假手术对照。

Abstract

尽管近来在科学研究中使用小鼠模型的增加，研究人员继续使用最初设计和验证大鼠使用的认知任务。以前已经显示了空间记忆的径向水胎（RWT）迷宫测试（专为小鼠而设计，不需要游泳），以成功区分受控的皮层撞击诱导的TBI小鼠和假手术对照。在这里，介绍了此任务的详细协议。 RWT迷宫利用小鼠自然倾向避免开放区域，有利于拥抱设备的两侧（thigmotaxis）。迷宫的墙壁上装有九个放置在设备地板上的逃生孔，老鼠训练使用视觉线索来定位引出迷宫的逃生孔。迷宫充满了一英寸的冷水，足以激发逃脱，但不够深，要求鼠标游泳。收购期仅需四次天，在第5天进行记忆保留测试，并在第12天进行长期记忆测试。这里报告的结果表明，RWT迷宫是评估空间中大鼠验证的，基于游泳的认知测试的可行替代方案TBI小鼠模型的记忆缺陷。

Introduction

记忆障碍是由创伤性脑损伤^{（TBI）1，2}名患者报告的最常见的症状之一。因此，准确识别和评估TBI动物模型中的类似记忆缺陷对于我们对这种状况及其管理的理解至关重要。在这里，我们提出了一个使用径向水胎（RWT）迷宫测试TBI鼠标模型中的空间记忆的协议。以前显示该装置可以评估受控皮层影响（CCI）诱导的TBI ^3的小鼠模型中的认知缺陷，并且代表了大鼠验证的，基于游泳的认知测试的潜在替代方案。

转基因小鼠模型的日益多样化和可用性已经导致科研⁴使用小鼠大鼠上最近有所增加。尽管有这种转变，研究人员继续依靠行为最初为老鼠使用设计和验证的认知任务。目前用于评估在小鼠中的认知中最常见的测试，Morris水迷宫（MWM）和巴恩斯圆形迷宫，是专门设计，以利用大鼠^5,6发现本能的行为。考虑到这两个物种⁴之间存在的遗传，神经行为和认知的差异，这是不足为奇的小鼠上这些任务^7,8始终表现不佳。

测试能力方面的物种依赖性差异特别涉及基于游泳的认知测试，如MWM。虽然大鼠和小鼠是基于游泳认知任务^9,10显着表现不佳精通游泳，研究人员已经确定了几个小鼠品系^{， 11，12，13。}即使是在野生型动物，老鼠通常优于小鼠^7,8。虽然这可以解释为空间记忆中的物种特异性差异，但使用干地迷宫的类似随访测试显示认知表现没有物种依赖性差异⁸ 。与认知无关的一些因素可以解释这一发现，包括游泳能力或搜索策略中的物种依赖性差异。事实上，MWM中小鼠特异性搜索策略的因素分析表明，非空间因素（特别是Thigomotaxis和被动[ 即浮动]）可能在MWM表现中起到比空间学习更重要的作用¹⁴ 。

在这里，我们展示了使用认知测试来设计来利用它小鼠的直觉行为，不需要游泳，测量CCI诱导的TBI小鼠模型中的空间记忆障碍。虽然RWT迷宫（ 图1 的A-B）被设想为在MWM和Barnes圆形迷宫的新颖混合型，它是专为采取的行为thigmotactic本能给小鼠^15,16优势。该设备包括一个32英寸直径的镀锌钢桶，其中九个均匀分布的出口孔已经钻孔。孔位于浴缸底部的2-1 / 4英寸处，并且尺寸适合普通可用的1-1 / 2英寸ABS DWV SPG x SJ陷阱适配器。八个出口被外部盖住，并且用橡皮塞挡住1英寸的深度。第九个通过90°丙烯腈丁二烯苯乙烯（ABS）弯头连接到不透明的塑料盒上，测试后可以从中轻松取出鼠标。在一个过程中短暂采集期间，老鼠训练使用迷宫内的独特视觉线索找到这个逃生箱。在测试过程中，迷宫充满了一英寸冷水（12-14°C），足够的足够强大的逃逸能力，但不足以使鼠标游泳。

在RWT迷宫表示一种低成本，低维护的替代MWM，并已在老年和转基因小鼠^{15，17，18，19}成功地使用，和CCI诱导的TBI ³的小鼠模型。这里概述的方案代表了一种测量空间记忆障碍的简单有效的方法，不需要进行伤前训练，可以轻松修改以适应研究实验室的特殊需要。

Protocol

所有程序和动物处理均按照国家卫生研究院和华盛顿大学动物护理与使用委员会颁布的动物护理指南进行。

手术

1. 在诱导盒中麻醉5％异氟烷的老鼠，直到无意识。通过降低呼吸频率和在趾部夹紧后不存在撤回反射来确认麻醉。
2. 在手术过程中，通过鼻锥保持2-2.5％的麻醉。在整个手术过程中监测呼吸频率，以确保鼠标无意识。
3. 将鼠标放在加热垫上，并使用耳杆将鼠标放置在立体定向装置中，确保头部牢固且平整。
4. 使用脱毛霜从头皮上去除头发。用盐水彻底冲洗头皮。
5. 用交替碘和70％乙醇洗涤清洁手术部位。
6. Administe在头皮皮下注射利多卡因和布比卡因（1mg / kg）。
7. 用手术剪刀做纵向中线切口，并收回皮肤以露出头骨。
8. 使用5毫米环钻预制件在左前额叶皮质上进行开颅手术，中心点在正前方2.5 mm处，中线左侧2.5 mm。小心地取出骨头露出大脑。
9. 将冲击器设备设置为6 m / s和200 ms驻留时间的速度。
10. 定位冲击器装置，直到3毫米凸出的撞击尖端轻轻地接触大脑后方2.5英寸后2.55毫米的中线。将冲击头缩回，并降低1 mm（冲击深度）。准备好后，启动设备，产生所需的影响。
11. 用无菌聚丙烯盘覆盖开颅手术，用组织粘合剂胶合到皮肤，并缝合切口。
12. 从麻醉中取出鼠标，并给予Bupr的IP注射（0.5mg / kg）。
13. 让鼠标在一个干净的笼子里恢复，加热垫加热。在接下来的24小时内，应该监测老鼠的疼痛或痛苦的迹象。
    注意:假手术控制应该得到与上述相同的治疗，省略步骤1.8-1.9。

径向水踏面迷宫建筑

1. Bore 9个出口孔，足够大以容纳1-1 / 2英寸ABS DWV SPG x SJ陷阱适配器，围绕32英寸直径镀锌钢桶的圆周等间隔。将这些出口孔围在浴缸地板的大约2-1 / 4英寸处。
2. 将1-1 / 2英寸ABS DWV SPG x SJ陷阱适配器安装到每个出口孔中，并使用附带的环形螺母固定。
3. 使用橡胶塞子，九口八口从设备外部出口。最后的未封顶出口将作为逃生路线。将退出指定为逃生路线无关紧要。
4. 安装90°ABS肘至剩余出口的外端。 90°弯曲用于防止测试对象从迷宫内部目视确定正确的逃生路线。
5. 从任何能够消毒的不透明盒子构成逃生箱，大小约为30厘米x 15厘米x 15厘米。在地板的正上方，在盒子的侧面切开一个孔，足够大以容纳90°的ABS弯头。
6. 将逃生箱安装在90°ABS弯头的末端。
7. 略微提升地板表面上方的逃生箱（小于一英寸）。这允许将电加热垫或其他加热源放置在逃逸箱下面的充足空间。
8. 打印和层压至少5个独特的视觉线索。使用简单，高对比度的图像，可以很容易地从设备中辨别出来。建议使用黑白剪贴画形状（三角形，正方形，圆形）。
9. 使用磁铁，将视觉线索粘贴到内壁仪器。围绕设备周围的距离应大致相等。

径向水踏面迷宫方案

注意:水迷宫测试应仅在手术部位愈合后（术后约1周）开始。

1. 准备测试
   1. 允许小鼠在开始测试前至少30分钟适应测试室。
   2. 使用70％乙醇喷雾消毒设备。
   3. 用大约1英寸的冷（12-14℃）水填充设备。
   4. 将电加热垫或其他加热源直接放在逃生箱下面。在整个测试期间保持逃生箱的黑暗和温暖。
   5. 在设备上放置一个明亮的光源。
      注意:如果使用从设备本身研究动物可能可见的灯，请注意确保灯泡处于同一波段每天都有一个意见灯本身可能代表了老鼠用于定位逃生箱的另一种视觉提示，并且每天都会大幅度地移动它可能会使结果复杂化。
2. 测试协议
   1. 将尾巴轻轻地从鼠笼中取出鼠标，放在设备的中央。
   2. 一旦动物进入装置，开始计时。
   3. 一旦动物找到正确的出口，并且已经找到/进入逃生箱，停止计时并记录找到正确路径所需的秒数。
   4. 如果动物试图爬上一个终止孔，10秒后不会自动重入迷宫，用手将动物引回到迷宫的中心。
   5. 如果动物未能在3分钟（180秒）内找到逃生箱的正确路径，则将该试验评定为失败记录为180秒。用手小心地将动物引导到正确的路径。
   6. 允许小鼠留在逃生箱中1分钟，试用休息。
   7. 一分钟的休息已经过去了，从逃生箱中取出动物并返回家中笼子。
   8. 彻底消毒逃生箱，并用70％乙醇喷雾出口，以防止鼠标使用嗅觉线索找到正确的逃生路线。此步骤不应超过几秒钟。
   9. 将鼠标放回迷宫进行下一次试验。
   10. 重复步骤3.2.1-3.2.9，直到鼠标完成了三次试验，并已经定位或被引导到逃生箱三次。
   11. 最后1分钟休息后，将鼠标移回家中的笼子。
   12. 在动物之间排放并更换设备中的水，以确保整个测试过程中温度一致。
   13. 对要测试的每只鼠标重复步骤3.2.1-3.2.12。
   14. 第二天重复准备步骤3.2.1-3.2.5。特别注意确保视觉线索保留在测试日之间保持一致的位置。
   15. 使用上述日常测试方案测试动物，每天进行三次试验，持续四天（训练期），第五天进行最后三次记忆保留试验。第十二个三年试验（长期记忆保留）可以在第十二天给予。
   16. 在第五天和第十二天之间不要进行任何测试。
3. 分析
   1. 如果在任何两天的时间内，如果一只老鼠在180秒以内无法完成迷宫（ 即连续6次测试全部得分为180秒），请考虑由测试条件导致的鼠标不足，并从分析中删除。
   2. 计算每个受试者完成迷宫的平均延迟时间，通过对其当天的三次日常试验进行平均化来测试日期。
   3. 使用标准t检验在第五天测试和长期记忆测试日期比较组获得记忆保留的组差异。如果m比较两组比较，应采用单因素方差分析，然后进行适当的事后分析（如Tukey检验）跟踪所获得的任何显着性。
   4. 通过反复测量方差分析获得收购期（第1-4天）的组差异。

Results

RWT迷宫（ 图1 ）用于研究随机分配接受受控皮质冲击诱导的TBI或假手术的小鼠中损伤依赖性空间记忆缺陷。使用电磁驱动的皮质冲击产生损伤，其具有3mm的凸尖，并且以下损伤参数:6m / s的冲击速度，1mm的穿透深度和200ms的接触时间。小鼠从手术后35天开始接受认知测试，并进行了四天的培训（收购期），然后在第5天进行记忆保留测试，并在第12天进行长期记忆测试，如上所述协议。 图2显示了在TBI小鼠和假手术对照之间完成迷宫时间延迟的清晰组差异。对这里提供的数据的分析显示，与TBI小鼠相比，假手术对照的潜伏期显着降低在第5天和第12天（ 图2 ）。没有受试者满足被认为不足以被测试条件激励的标准，因此没有将小鼠从分析中移除。

Discussion

这里介绍的RWT迷宫协议成功地区分了CCI诱导的TBI小鼠和假手术对照，代表了可行的，以鼠标为中心的替代MWM和Barnes圆形迷宫。而在这里报道的结果只会讲的使用在TBI小鼠模型中RWT迷宫，该设备已成功应用于老年人和转基因模型，其中应力诱导基于游泳测试导致违规使用MWM不切实际^15,17国产^{，18，19。}不合规或运动缺陷是潜在研究问题的其他小鼠模型也可能受益于这种认知任务。

除了以前讨论的设计优点之外，RWT迷宫的优点之一是在构造和使用方面都是简单的。该装置本身使用rel容易地构造低成本的材料，可以消毒，而不会损坏其组件，使其成为特定无病原体（SPF）设施的理想选择。收购期限仅需四天，无需伤前训练。每日测试涉及到最少的时间承诺（约10分钟/动物），在掌握之前需要很少的经验。由于RWT迷宫的建造和使用简单，所以理想的实验室受到...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
35加仑热浸钢圆桶	家得宝	互联网#206638142	需要：1
1-1/2英寸。ABS DWV SPG x SJ 陷阱适配器	Home Depot	Internet #100344703，商店 SKU #188956	需要：9
1-3/4 英寸 x 1-7/16 英寸。黑色橡胶塞	子 家得宝	互联网 #100114974 商店 SKU #755844	需要：8
1-1/2 英寸。ABS DWV 90度轮毂x轮毂弯头	家得宝	互联网#100346663 商店SKU #188603	所需：1
HDX 10加仑存储手提袋	家得宝	互联网#202523587 商店SKU #258804 商店 SO SKU #258804	所需：1
冲击 一个用于CCI	Leica Biosystems	39463920	所需：1
游标立体定位器，带手动微调驱动立体定位仪器，适用于小动物	Leica Biosystems	39463001	：1