利用放射状水迷宫评估创伤性脑损伤小鼠模型中的空间记忆障碍

摘要

本文介绍一种无需游泳的小鼠特异性认知功能检测方案。该方法可有效区分由控制性皮质撞击诱导的创伤性脑损伤小鼠与假手术对照组小鼠。

摘要

尽管近年来小鼠模型在科学研究中的使用日益增加，研究人员仍在继续使用最初为大鼠设计并验证的认知任务。径向水踏（RWT）迷宫空间记忆测试（专为小鼠设计，且无需游泳）此前已被证明能够成功区分受控皮层冲击诱导的创伤性脑损伤（TBI）小鼠与假手术对照组。本文提供该实验任务的详细操作方案。RWT迷宫利用了小鼠倾向于避开开阔区域、偏好紧贴装置边缘移动的自然行为特性（即触壁行为）。迷宫墙壁上设有九个位于装置底面以上的逃生孔，小鼠通过视觉线索训练以识别通向迷宫外的正确逃生孔。迷宫中注入一英寸深的冷水，足以促使小鼠产生逃生动机，但水深不足以使其需要游泳。获取阶段仅需四天训练，第五天进行记忆保持测试，第十二天进行长期记忆测试。本文报告的结果表明，RWT迷宫是评估TBI小鼠模型空间记忆缺陷时，替代经大鼠验证的、基于游泳的认知测试的一种可行方案。

引言

记忆障碍是创伤性脑损伤（TBI）患者最常见的症状之一^1,2。因此，准确识别和评估TBI动物模型中类似的记忆缺陷，对于我们理解该疾病及其管理至关重要。本文介绍了一种利用放射状水踏（Radial Water Tread, RWT）迷宫检测TBI小鼠模型空间记忆的实验方案。该装置此前已被证明可用于评估由可控皮层撞击（controlled cortical impact, CCI）诱导的TBI小鼠模型中的认知缺陷³，并可能作为经大鼠验证的基于游泳的认知测试的一种替代方法。

转基因小鼠模型的多样性和可及性日益增加，导致近年来在科学研究中使用小鼠的比例超过了大鼠⁴。尽管如此，研究人员仍在沿用最初为大鼠设计并验证的行为学和认知任务。目前用于评估小鼠认知功能的最常用实验，如莫里斯水迷宫（MWM）和巴恩斯圆形迷宫，均是专门针对大鼠的本能行为特征而设计的^5,6。鉴于这两种物种之间存在的遗传、神经行为学和认知差异⁴，小鼠在这些任务中表现持续较差也就不足为奇了^7,8。

在基于游泳的认知测试（如MWM）中，物种间测试能力的差异尤为令人关注。尽管大鼠和小鼠均擅长游泳，但研究人员已发现若干小鼠品系在基于游泳的认知任务中表现明显较差^{9,10,11,12,13}。即使在野生型动物中，大鼠的表现通常也优于小鼠^7,8。虽然这可能被解释为物种间空间记忆能力的特异性差异，但采用旱地迷宫进行的类似后续测试却未发现认知表现存在物种依赖性差异⁸。这一结果可能由多种与认知无关的因素导致，包括物种间在游泳能力或搜索策略上的差异。事实上，对小鼠在MWM中特有搜索策略的因子分析表明，非认知因素（特别是趋触性及被动性行为[i.e.，漂浮]）在MWM表现中所起的作用可能比空间学习更为显著¹⁴。

在此，我们展示了一种认知测试方法的应用，该方法利用小鼠的本能行为，无需游泳，用于检测创伤性脑损伤（TBI）的闭合性颅脑损伤（CCI）小鼠模型中的空间记忆障碍。虽然RWT迷宫（图1A-B）最初被设计为莫里斯水迷宫（MWM）与巴恩斯圆形迷宫的新型混合体，但其特别旨在利用小鼠固有的趋壁行为^15,16。该装置由一个直径32英寸的镀锌钢盆构成，盆壁上均匀分布有九个钻孔。孔的中心位于盆底上方2-1/4英寸处，孔径大小适配常用1-1/2英寸ABS排水管用SPG x SJ接头。其中八个出口从外部用橡胶塞封堵，堵塞深度为1英寸；第九个出口则通过一个90°的丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（ABS）弯头连接至一个不透明的塑料箱，测试结束后可方便地从中取出小鼠。在短暂的习得阶段，训练小鼠利用沿迷宫边缘布置的独特视觉线索来定位该逃生箱。测试时，向迷宫中注入1英寸深的冷水（12–14 °C），水温足够低以促使小鼠产生逃避动机，但水深不足以使其需要游泳。

RWT迷宫是一种低成本、低维护的MWM替代方案，已成功应用于老年小鼠、转基因小鼠^15,17,18,19以及CCI诱导的TBI小鼠模型³。本文所述方案提供了一种简单有效的方法，用于检测空间记忆障碍，且无需伤前训练，还可根据研究实验室的具体需求进行简便修改。

方案

所有实验操作和动物处理均遵循美国国立卫生研究院以及华盛顿大学动物护理与使用委员会发布的动物护理指南。

1. 手术

1. 将小鼠置于含5%异氟烷的诱导箱中麻醉，直至失去意识。通过观察呼吸频率降低以及脚趾受捏压后无回缩反射来确认麻醉效果。
2. 手术全程通过鼻罩维持2–2.5%异氟烷麻醉。持续监测呼吸频率，确保小鼠保持无意识状态。
3. 将小鼠俯卧于加热垫上，并使用耳杆将其头部固定在立体定位仪中，确保头部稳固且水平。
4. 使用脱毛膏去除头皮毛发，并用生理盐水彻底冲洗头皮。
5. 用碘伏和70%乙醇交替清洗手术区域进行消毒。
6. 在头皮部位皮下注射利多卡因和布比卡因（1 mg/kg）。
7. 使用手术剪沿中线作纵向切口，分离皮肤以暴露颅骨。
8. 使用5 mm环钻锯在左侧额顶叶皮层进行开颅，中心点位于前囟后方2.5 mm、中线左侧2.5 mm处。小心移除骨片以暴露脑组织。
9. 将撞击装置设定为撞击速度6 m/s，停留时间200 ms。
10. 调整撞击装置位置，使3 mm凸面撞击头轻轻接触脑表面，位置为前囟后方2.5 mm、中线左侧2.55 mm。回撤撞击头后下移1 mm（撞击深度）。准备就绪后触发装置，产生所需撞击。
11. 用组织胶将无菌聚丙烯圆片粘附于皮层并覆盖开颅区域，然后缝合切口。
12. 将小鼠移出麻醉状态，并腹腔注射布伦诺啡（0.5 mg/kg）。
13. 将小鼠置于由加热垫保温的清洁笼中恢复。 应在接下来24小时内密切观察小鼠是否出现疼痛或痛苦迹象。
    注意：假手术对照组应接受与上述相同处理，但省略步骤1.8–1.9。

2. 径向水迷宫构建

1. 在直径为32英寸的镀锌钢浴盆的圆周上，等间距钻出9个出口孔，孔的尺寸需足够容纳1-1/2英寸的ABS排水管SPG转SJ弯头接头。将这些出口孔的中心位置定在浴盆底部上方约2-1/4英寸处。
2. 将1-1/2英寸的ABS排水管SPG转SJ弯头接头安装到每个出口孔中，并用附带的锁紧螺母固定。
3. 使用橡胶塞从装置外部封住九个出口中的八个。剩下的未封住的出口将作为逃生通道。哪个出口被指定为逃生通道并无影响。
4. 在剩余出口的外端连接一个90°的ABS弯头。该90°弯头的作用是防止受试对象从迷宫内部通过视觉识别正确的逃生路径。
5. 使用任何可消毒且尺寸约为30 cm × 15 cm × 15 cm的不透明盒子制作逃生箱。在盒子侧面靠近底部的位置开一个孔，孔的大小应足以容纳90°的ABS弯头。
6. 将逃生箱连接到90° ABS弯头的末端。
7. 将逃生箱略微抬高（低于一英寸），使其高于地面。这样可在逃生箱下方留出足够空间，以便放置电加热垫或其他热源。
8. 打印并覆膜至少5种不同的视觉线索。使用简单、高对比度的图像，确保在装置内部能够清晰分辨。推荐使用黑白剪贴画形状（如三角形、正方形、圆形）。
9. 使用磁铁将视觉线索固定在装置内壁上。线索应沿装置内壁圆周方向大致等距分布。

3. 径向水迷宫实验方案

注意：只有在手术部位愈合后（术后约一周），才应开始水迷宫测试。

1. 测试前准备。
   1. 让小鼠在开始测试前于测试室内适应至少30分钟。
   2. 使用70%乙醇喷雾对仪器设备进行消毒。
   3. 向装置中加入约1英寸深的冷水（12–14 °C）。
   4. 将电加热垫或其他加热源直接放置在逃避箱下方。在整个测试过程中，保持逃避箱内黑暗且温暖。
   5. 将一个明亮的光源置于装置上方。
      注意：如果使用可能从实验装置本身被实验动物看到的灯，需确保灯每天放置在相同位置。灯本身可能成为小鼠用于定位逃生箱的另一个视觉线索，若每天大幅移动灯的位置，可能会使实验结果复杂化。
2. 测试方案
   1. 轻轻抓住小鼠尾巴，将其从笼中取出，并放置于仪器中央。
   2. 动物一进入装置，立即开始计时。
   3. 当动物找到正确的出口并进入逃生箱后，停止计时，并记录找到正确路径所需的时间（秒）。
   4. 如果动物试图爬入一个死胡同，且在10秒内未自行重新进入迷宫，则用手将其引导回迷宫中心。
   5. 如果动物在3分钟（180秒）内未能找到通往逃生箱的正确路径，则将该次试验记为失败，并记录为180秒。用手小心引导动物走向正确的路径。
   6. 让小鼠在逃生箱中停留1分钟，作为试验间休息。
   7. 1 分钟休息时间结束后，将动物从逃生箱中取出并放回其饲养笼中。
   8. 用70%乙醇喷雾彻底消毒逃生箱及出口，以防止小鼠利用嗅觉线索找到正确的逃生路径。此步骤应不超过几秒钟。
   9. 将小鼠放回迷宫以进行下一次试验。
   10. 重复步骤 3.2.1 至 3.2.9，直至小鼠完成共计三次试验，并且已找到或被引导至逃生箱三次。
   11. 最后一次1分钟休息后，将小鼠放回其原居住笼中。
   12. 在动物之间排出并更换装置中的水，以确保测试过程中温度保持一致。
   13. 对每只待测小鼠重复步骤 3.2.1–3.2.12。
   14. 次日，重复执行步骤 3.2.1–3.2.5。需特别注意确保测试期间视觉提示在各测试日之间保持位置一致。
   15. 使用上述每日测试方案，每天进行三次试验，持续四天（训练期），第五天进行最后一次三次试验以检测记忆保持。可在第十二天进行第六次三次试验（长期记忆保持）。
   16. 在第5天至第12天之间不得进行任何检测。
3. 分析
   1. 若小鼠在任意连续两天内均未能在180 s内完成迷宫即， 总共连续6次试验均得分为180秒时，视为小鼠对测试条件动机不足，应从分析中剔除。
   2. 根据每日的三次试验，计算每个受试者在各测试日期完成迷宫的平均潜伏期。
   3. 使用标准t检验比较第五天测试和长期记忆测试时各组之间的记忆保持差异。若比较两个以上组别，则应采用单因素方差分析（ANOVA），并在发现显著差异时进行相应的事后检验（如Tukey检验）。
   4. 获得获取阶段（第1-4天）的组间差异 通过 重复测量方差分析

结果

采用RWT迷宫（图1）研究随机分配接受控制性皮层冲击诱导的创伤性脑损伤（TBI）或假手术的小鼠中与损伤相关的空间记忆缺陷。损伤通过电磁驱动的皮层冲击装置产生，使用直径为3 mm的凸形探头，并设定以下损伤参数：撞击速度6 m/s，穿透深度1 mm，接触时间200 ms。小鼠在术后第35天开始进行认知测试，先进行为期四天的训练（获得期），随后在第5天进行记忆保持测试，第12天进行长期记忆测试，具体流程如上述方案所述。图2显示，随着时间推移，TBI小鼠与假手术对照组在完成迷宫所需潜伏期上表现出明显的组间差异。对本研究数据的分析表明，在第5天和第12天，假手术对照组的潜伏期均显著短于TBI小鼠（图2）。所有受试动物均未达到因测试条件导致动机不足的排除标准，因此未从分析中剔除任何小鼠。

讨论

本文介绍的RWT迷宫方案能够有效区分CCI诱导的TBI小鼠与假手术对照组，是一种可行的、以小鼠为中心的替代方案，可用于替代MWM和Barnes圆形迷宫。尽管本文报告的结果仅涉及RWT迷宫在TBI小鼠模型中的应用，但该装置已成功应用于老年小鼠和转基因小鼠模型，在这些模型中，基于游泳的测试会因应激导致的不配合而使MWM的使用变得不切实际^15,17,18,19。其他可能存在不配合行为或运动功能缺陷的研究小鼠模型也可能从这一认知任务中获益。

除了前述的设计优势外，RWT迷宫的一个优点在于其构造和使用均十分简便。该装置本身可使用相对低成本的材料轻松构建，并且能够进行消毒而不会损坏其组件，因此非常适合无特定病原体（SPF）设施使用。获取期仅需四天的测试，无需进行伤前训练。每日测试所需时间投入较少（约每只动物10分钟），且操作者在掌握该方法前...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 加仑热浸镀锌钢制圆管	家得宝	网站编号 #206638142	需求数量：1
1-1/2 英寸 ABS 排水、排污、通风系统 SPG 转 SJ 地漏接头适配器	家得宝	网站编号 #100344703，门店 SKU #188956	需求数量：9
1-3/4 英寸 × 1-7/16 英寸黑色橡胶塞	家得宝	网站编号 #100114974，门店 SKU #755844	需求数量：8
1-1/2 英寸 ABS 排水、排污、通风系统 90 度承口转承口弯头	家得宝	网站编号 #100346663，门店 SKU #188603	需求数量：1
HDX 10 加仑储物箱	家得宝	网站编号 #202523587，门店 SKU #258804，门店 SO SKU #258804	需求数量：1
Impact One CCI 用立体定位冲击器	徕卡生物系统	39463920	需求数量：1
带手动微调驱动装置的小动物立体定位仪	徕卡生物系统	39463001	需求数量：1