需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

由脐带血来源的诱导多能干细胞形成软骨细胞样细胞团

10.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/55988

⸱

2017年6月19日

 ,  , 
1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Division of Rheumatology, Seoul St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 2Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary's Hospital, Institute of Medical Science, College of Medicine, The Catholic University of Korea

本文内容

摘要

本文提出了一种从脐带血单个核细胞来源的人诱导性多能干细胞进行软骨细胞分化的方法。

摘要

人体关节软骨缺乏自我修复能力，因此软骨退变的治疗并非采用根治性手段，而是以保守治疗为主。目前，人们正致力于通过再生医学方法修复受损软骨 离体 扩增的软骨细胞或骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）。然而，这些细胞的存活率有限且稳定性较差，限制了其在软骨重建中的应用。人诱导性多能干细胞（hiPSCs）因其在再生医学应用中的潜力而受到科学界关注。凭借无限的自我更新能力和多向分化潜能，hiPSCs 已被视为软骨修复的一种新型替代细胞来源。然而，获得大量高质量的软骨形成细胞团仍是其临床应用的主要挑战。在本研究中，我们采用胚胎体（EB）来源的外生长细胞进行软骨向分化。通过 PCR 以及阿利新蓝、甲苯胺蓝染色和针对 I 型与 II 型胶原蛋白（分别为 COL1A1 和 COL2A1）抗体的免疫染色，证实了软骨形成的成功。本文提供了一种详细的实验方法，用于将脐带血单个核细胞来源的 iPSCs（CBMC-hiPSCs）分化为软骨形成细胞团。

引言

人诱导多能干细胞（hiPSCs）的应用代表了一种针对多种疾病进行药物筛选和机制研究的新策略。从再生医学的角度来看，hiPSCs 还有望成为修复愈合能力有限的受损组织（如关节软骨）的潜在细胞来源1,2。

天然关节软骨的再生几十年来一直是一项挑战。关节软骨是一种覆盖在骨端的白色柔软组织，可保护骨骼免受摩擦损伤。然而，当其受损后再生能力有限，几乎无法实现自我修复。因此，针对软骨再生的研究已持续数十年。

此前， 体外 向软骨细胞系分化通常使用骨髓间充质干细胞或从膝关节分离的原代软骨细胞进行3由于具有软骨形成潜能，骨髓间充质干细胞（BMSCs）和天然软骨细胞在软骨生成中具有多种优势，支持其在该领域的应用。然而，由于其增殖能力有限且表型不稳定，这些细胞在关节软骨缺损修复中面临诸多局限性。 体外 培养条件下，这些细胞在传代3-4次后 tends to 逐渐丧失其自身特性，最终影响其分化能力4此外，在获取原代软骨细胞时，不可避免地会对膝关节造成额外损伤。

与骨髓间充质干细胞（BMSCs）或原代软骨细胞不同，hiPSCs 可无限扩增 体外在适当的培养条件下，人诱导多能干细胞（hiPSCs）作为软骨分化替代来源具有巨大潜力。然而，改变hiPSCs的内在特性仍具挑战性。5此外，它需要多个复杂的步骤 体外 将hiPSCs定向诱导为特定细胞类型的步骤。尽管存在这些复杂性，由于hiPSCs具有强大的自我更新能力以及分化为靶向细胞（包括软骨细胞）的潜能，仍推荐使用hiPSCs6.

软骨分化通常采用三维培养系统，例如团块培养或微团培养，使用类似间充质干细胞（MSC）的前体细胞。如果使用人诱导多能干细胞（hiPSCs），则生成类MSC前体细胞的方案与现有方案有所不同。一些研究团队采用hiPSCs的单层培养，直接将其表型转化为类MSC细胞7。然而，大多数研究利用拟胚体（EBs）产生具有MSC特征的外延生长细胞8,9,10,11。

常使用多种类型的生长因子来诱导软骨形成。通常单独或联合使用BMP和TGFβ家族蛋白。此外，其他因子如GDF5、FGF2和IGF1也可用于诱导分化。12,13,14,15TGFβ1 已被证明能够以剂量依赖的方式促进间充质干细胞的软骨形成16与另一种同种型TGFβ3相比，TGFβ1通过增强前软骨间充质细胞的凝聚来诱导软骨形成，而TGFβ3则通过显著促进间充质细胞增殖来诱导软骨形成。17然而，研究人员使用 TGFβ3 的频率高于 TGFβ17,10,18,19BMP2 在人关节软骨细胞中增强与软骨形成基质成分相关的基因表达 体外 条件20BMP2 与 TGFβ 蛋白联合使用可上调间充质干细胞中对软骨形成至关重要的基因表达21还已证明，BMP2通过Smad和MAPK通路协同增强TGFβ3的作用效果。22.

本研究中，将CBMC-hiPSCs在低吸附培养皿中使用EB培养基聚集形成拟胚体（EB）。通过将拟胚体接种至明胶包被的培养皿中，诱导其长出外延细胞。利用外延细胞通过团块培养法进行软骨向分化。联合使用BMP2和TGFβ3成功诱导细胞凝聚，并促进细胞外基质（ECM）蛋白的积累，从而形成软骨团块。本研究提出了一种利用CBMC-hiPSCs进行软骨向分化的简单且高效的方案。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本方案已获得韩国天主教大学机构审查委员会的批准（KC12TISI0861）。用于重编程的脐带血单个核细胞（CBMCs）直接取自首尔圣玛丽医院脐带血库。

1. 从诱导多能干细胞诱导软骨形成分化

  1. CBMC-iPSC 的生成
    1. 使用我们先前研究中所述的方案生成 CBMC-hiPSCs23。
    2. 将血细胞收集至 15 mL 圆锥形离心管中，并使用血细胞计数板进行计数。
    3. 准备 3 × 105 个细胞，在室温下以 515 × g 离心 5 分钟。用抽吸法弃去上清液，并将细胞重悬于 0.5 mL 血细胞培养基中。
    4. 将细胞转移至未包被的 24 孔板的一个孔中，并按照生产商的建议加入仙台病毒混合物。
    5. 将培养板在 30 °C 下以 1,150 × g 离心 30 分钟。
    6. 离心后，在 37 °C、5% CO2 条件下过夜（O/N）培养细胞。
    7. 次日，将转导后的细胞转移至基质包被的孔中。在 30 °C 下以 1,150 × g 离心培养板 30 分钟。
    8. 离心后，弃去上清液，加入 1 mL iPSC 培养基，并在 37 °C、5% CO2 条件下过夜维持细胞。
    9. 将贴壁细胞在 37 °C 和 5% CO2 条件下维持培养，每日更换新鲜 iPSC 培养基。
      注：转导后第 14–21 天可见克隆形成。
  2. EB 的生成
    1. 将 hiPSCs 在 37 °C 和 5% CO2 条件下维持培养，每日更换新鲜 Essential 8（E8）培养基。
    2. 在经玻连蛋白包被的 100 mm 培养皿中，用 E8 培养基接种 2 × 106 个 hiPSCs。
    3. 从培养皿中移除 E8 培养基，并用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。
    4. 加入 1 mL 1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 2 分钟。
    5. 用 3 mL E8 培养基收集细胞，转移至新的 15 mL 圆锥形离心管中，在室温（RT）下以 250 × g 离心 2 分钟。
    6. 吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀，将细胞重悬于 5 mL E8 培养基中。
    7. 使用血细胞计数板计数细胞，为每个 100 mm 无菌培养皿准备 2 × 106 个细胞。将细胞重悬于 10 mL E8 与 EB 培养基（1:1）的混合液中，并加入 10 µM Rho 相关激酶（ROCK）抑制剂。
    8. 在 37 °C 和 5% CO2 条件下过夜孵育，以促进细胞聚集。
    9. 次日，通过移液收集聚集形成的 EBs，以 250 × g 离心 1 分钟，弃去上清液，并将 EBs 重悬于 10 mL 新鲜 E8 培养基中。
    10. 在新鲜 E8 培养基中扩增 EBs 5 天，每日更换培养基。为进一步促进成熟，将培养基更换为 E7 培养基，在 37 °C 和 5% CO2 条件下继续维持 5 天，每日更换新鲜 E7 培养基。
      注：E7 培养基为不含 FGF2 的 E8 培养基。
  3. 从 EBs 诱导外生长细胞
    1. 向 100 mm 培养皿中加入 6 mL 1% 明胶，在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 30 分钟。
    2. 移除明胶，并在使用前将培养皿完全干燥 2–3 小时。
    3. 将 EBs 转移至 50 mL 圆锥形离心管中，静置使 EBs 沉降至管底，小心吸除上清液，避免扰动 EBs。
    4. 用含 20% 胎牛血清（FBS）的 10 mL DMEM 重悬 EBs，转移至明胶包被的 100 mm 培养皿中，并加入 10 µM ROCK 抑制剂。
    5. 在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育并维持培养 7 天，每隔一天更换一次培养基，不添加 ROCK 抑制剂。
  4. 软骨形成细胞球体的构建
    1. 吸除培养皿中的培养基，用 PBS 洗涤细胞三次。
    2. 加入 1 mL 1 mM EDTA，在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 2 分钟。
    3. 用含 20% FBS 的 5 mL DMEM 收集细胞，转移至新的 15 mL 圆锥形离心管中。
    4. 在室温下以 250 × g 离心 2 分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于含 20% FBS 的 10 mL DMEM 中。
    5. 使用 40 µm 细胞筛过滤，去除细胞团块，收集单细胞，并使用血细胞计数板计数。
    6. 在室温下以 250 × g 离心 2 分钟，弃去上清液，将每份 3 × 105 个细胞接种于含 300 µL 软骨分化培养基（CDM）的 15 mL 圆锥形离心管中，形成单个细胞球体。
    7. 为形成细胞球体，在室温下以 680 × g 离心 5 分钟。
      注：软骨细胞球体在分化期间始终维持于 15 mL 圆锥形离心管中。
    8. 在 37 °C 和 5% CO2 条件下过夜孵育细胞。
    9. 每 2–3 天更换一次 CDM。3 天内，细胞球体将呈现扁平的球形形态。在 37 °C 和 5% CO2 条件下维持培养 21 天。

2. 通过染色法对软骨形成细胞团进行表征

  1. 软骨形成包埋
    1. 包埋前，在58 °C下准备并熔化石蜡。
    2. 在1.5 mL离心管中，用1 mL 4%多聚甲醛于室温固定细胞团块2小时。
      注意：多聚甲醛具有高毒性。避免接触眼睛、皮肤或黏膜。配制时应尽量减少暴露，并避免吸入。
    3. 将一层纱布放入包埋盒中，用移液器转移已固定的团块。将纱布折叠覆盖团块后，盖上包埋盒盖。
    4. 在100 mL 70%乙醇（EtOH）中进行两次脱水，每次10分钟。随后依次在80%和95% EtOH中各洗涤10分钟完成脱水。
    5. 将团块转移至100% EtOH中10分钟。更换新鲜EtOH重复此步骤三次。
    6. 进行"透明"处理：先用100 mL EtOH与二甲苯按1:1比例混合的溶液处理10分钟，再用1:2比例的混合液处理10分钟。随后将团块在100%二甲苯中孵育两次，每次10分钟，以彻底清除残留的EtOH。
    7. 进行石蜡浸润：将团块依次置于二甲苯与石蜡的混合液中。整个石蜡浸润过程在58 °C下进行。先将团块置于100 mL二甲苯与石蜡按2:1比例混合的溶液中孵育30分钟。
    8. 更换为100 mL二甲苯与石蜡按1:1比例混合的溶液，孵育30分钟。
    9. 更换为100 mL二甲苯与石蜡按1:2比例混合的溶液，孵育30分钟。
    10. 最终浸润步骤：将团块转移至第一缸100%石蜡中，孵育2小时。
    11. 将团块转移至第二缸100%石蜡中，在58 °C下过夜孵育（O/N）。
    12. 次日，用镊子轻轻将团块转移至模具中。从石蜡分配器向模具中加入石蜡，并在4 °C下固化30分钟。
    13. 切片厚度为7 µm，将切片转移至载玻片上。让载玻片干燥过夜，并在室温下保存至使用前。
  2. 载玻片预处理
    1. 将载玻片依次通过100 mL 100%、90%、80%和70% EtOH进行脱蜡，每步5分钟。
    2. 将载玻片放入玻璃罐中，用自来水冲洗5分钟。
  3. 阿利新蓝染色
    1. 将载玻片置于50 mL 1%阿利新蓝溶液中孵育30分钟。
      注：阿利新蓝用3%乙酸溶液稀释，使用乙酸调节pH至2.5。
    2. 将载玻片放入玻璃罐中，用自来水冲洗2分钟。
    3. 用去离子水（DW）冲洗载玻片，并用核固红溶液复染2分钟。
    4. 将载玻片放入玻璃罐中，用自来水冲洗1分钟。
    5. 2.3.5) 继续进行步骤2.6中的脱水和封片操作。
  4. 甲苯胺蓝染色
    1. 将载玻片置于50 mL甲苯胺蓝溶液中孵育4分钟。
    2. 将载玻片放入玻璃罐中，用自来水冲洗5分钟。
    3. 继续进行步骤2.6中的脱水和封片操作。
  5. 免疫组织化学染色
    1. 将载玻片置于3% H2O2中孵育15分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。
    2. 将200 µL一抗（抗COL1A1和COL2A1抗体）用含1%牛血清白蛋白（BSA）和5%正常山羊血清（NGS）的Tris缓冲盐水（TBS）按1:100稀释后加至载玻片上，在4 °C下过夜孵育（O/N）。
    3. 次日，将载玻片放入玻璃罐中，用含0.1%吐温20（TBST）的TBS溶液洗涤三次，每次50 mL，每次5分钟。
    4. 将200 µL二抗（山羊抗兔IgG抗体，用含1% BSA和5% NGS的TBS按1:200稀释）加至载玻片上，在室温下孵育40分钟。
    5. 将载玻片放入玻璃罐中，用50 mL TBST洗涤三次，每次5分钟。
    6. 为进行信号放大，将HRP标记的链霉亲和素溶液加至载玻片上，孵育10分钟。
    7. 将载玻片放入玻璃罐中，用50 mL TBST洗涤三次，每次5分钟。
    8. 配制DAB-过氧化物酶底物溶液，每张载玻片加200 µL，孵育1分钟。
    9. 将载玻片放入玻璃罐中，用自来水冲洗5分钟。
    10. 用迈耶苏木精复染1分钟。
    11. 用去离子水（DW）冲洗载玻片。
    12. 继续进行步骤2.6中的脱水和封片操作。
  6. 脱水与封片
    1. 将载玻片依次通过100 mL 70%、80%、90%和100% EtOH进行脱水，每步30秒。
    2. 将载玻片浸入两缸二甲苯中，每缸1分钟。
    3. 在盖玻片上加入50 µL封片液，然后将载玻片置于其上。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本研究中，我们通过诱导CBMC-hiPSCs来源的拟胚体（EBs）形成外延细胞，进而生成软骨形成细胞团。采用经证实具有高多能性的CBMC-hiPSCs诱导软骨分化11本方案的简要示意图如图所示 图1A. 诱导分化前，iPSC集落进行扩增（图1B）。扩增的iPSCs被组装成EB以启动分化（图1C）。生成的类胚体被接种于明胶包被的培养皿上，以诱导其生长出细胞集落（图1D）。随后，收集迁移出的细胞并用于生成软骨形成细胞团。经过21天的分化后，获得微小珠状的软骨形成细胞团，并用于进一步表征（图1E）。样品的质量 体外-通过多种检测方法证实了成软骨诱导形成的细胞团。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本方案成功地从脐带血单个核细胞（CBMCs）生成了人诱导多能干细胞（hiPSCs）。我们利用含有山中因子的仙台病毒载体将CBMCs重编程为hiPSCs24。在分化实验中使用了三个案例，所有实验均成功地通过该方案生成了软骨形成细胞团。已有大量研究报道了将hiPSCs分化为软骨细胞的方案25,26,27,28。然而，仍需进一步研究以确认CBMC-hiPSCs是否可作为软骨再生与修复的候选细胞来源。

已使用来源于多种体细胞类型的 hiPSCs 验证了软骨形成能力11,25,26,<...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何披露信息。

致谢

本工作获得了韩国医疗技术研究开发项目（Korea Healthcare Technology R&D项目，卫生福利部 & 家庭事务，大韩民国（HI16C2177）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
塑料器皿
100 mm 培养皿TPP93100
6 孔板TPP92006
50 mL 离心管SPL50050
15 mL 离心管SPL50015
10 mL 一次性移液管Falcon7551
5 mL 一次性移液管Falcon7543
12 孔板TPP92012
名称公司目录编号描述
E8 培养基材料
DMEM/F12，含 HEPESLife Technologies11330-057E8 培养基 (500 mL)
碳酸氢钠Life Technologies25080-094E8 培养基 (浓度：543 μg/mL)
亚硒酸钠Sigma AldrichS5261E8 培养基  (浓度：14 ng/mL)
人转铁蛋白Sigma AldrichT3705E8 培养基 (浓度：10.7 μg/mL)
碱性 FGF2Peprotech100-18BE8 培养基  (浓度：100 ng/mL)
人胰岛素Life Technologies12585-014E8 培养基 (浓度：20 μg/mL)
人 TGFβ1Peprotech100-21E8 培养基 (浓度：2 ng/mL)
抗坏血酸Sigma AldrichA8960E8 培养基  (浓度：64 μg/mL)
DPBSLife Technologies14190-144
纤连蛋白Life TechnologiesA14700
ROCK 抑制剂Sigma AldrichY0503
名称公司目录编号描述
质量控制材料
18 mm 盖玻片SuperiorHSU-0111580
4% 多聚甲醛Tech & InnovationBPP-9004
吐温 X-100BIOSESANG9002-93-1
牛血清白蛋白Vector LabSP-5050
抗 SSEA4 抗体MilliporeMAB4304
抗 Oct4 抗体Santa CruzSC9081
抗 TRA-1-60 抗体MilliporeMAB4360
抗 Sox2 抗体Biolegend630801
抗 TRA-1-81 抗体MilliporeMAB4381
抗 Klf4 抗体Abcamab151733
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 抗体Molecular ProbeA11029
Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG (H+L) 抗体Molecular ProbeA11037
DAPIMolecular ProbeD1306
Prolong gold 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36934
4% 多聚甲醛Tech & InnovationBPP-9004
吐温 20BIOSESANGT1027
牛血清白蛋白Vector LabSP-5050
抗胶原蛋白 II 抗体abcam ab347121:100
阿利新蓝Sigma AldrichA3157-10G
快绿 FCFSigma AldrichF7252-25G
番红 OSigma Aldrich090m0039v
核固红AmericanmastertechSTNFR100 
二甲苯Duksan115 
乙醇Duksan64-17-5
迈耶苏木精溶液wako pure chemical industriesLAK7534
DAPVECTOR LABORATORIESSK-4100
载玻片，涂层Hyun Il Lab-MateHMA-S9914
TrizolInvitrogen15596-018
氯仿Sigma Aldrich366919
异丙醇Millipore109634
乙醇Duksan64-17-5
RevertAid 第一链 cDNA 合成试剂盒Thermo ScientficK1622
名称公司目录编号描述
软骨分化材料
DMEMLife Technologies11885软骨分化培养基组分 (500 mL)
青霉素-链霉素Life TechnologiesP4333软骨分化培养基组分 (浓度：1%)
抗坏血酸Sigma AldrichA8960软骨分化培养基组分 (浓度：64 μg/mL) 
MEM 非必需氨基酸溶液 (100x)Life Technologies11140-050软骨分化培养基组分 (浓度：100 mM)
rhBMP-2R&D355-BM-050软骨分化培养基组分 (浓度：100 ng/mL)
重组人 TGF-β3R&D243-B3-002软骨分化培养基组分 (浓度：10 ng/mL)
KnockOut 血清替代物Life Technologies10828-028软骨分化培养基组分 (浓度：1%)
ITS+ 预混液BD354352软骨分化培养基组分 (浓度：1%)
水溶性地塞米松 Sigma AldrichD2915-100MG软骨分化培养基组分 (浓度：10-7 M)
GlutaMAX 补充剂Life Technologies35050-061软骨分化培养基组分 (浓度：1%)
丙酮酸钠溶液Sigma AldrichS8636软骨分化培养基组分 (浓度：1%)
L-脯氨酸Sigma AldrichP5607-25G软骨分化培养基组分 (40 μg/mL)

参考文献

  1. van Osch, G. J., et al. Cartilage repair: past and future--lessons for regenerative medicine. J Cell Mol Med. 13 (5), 792-810 (2009).
  2. Ahmed, T. A., Hincke, M. T. Strategies for articular cartilage lesion repair and functional restoration. Tissue Eng Part B Rev. 16 (3), 305-329 (2010).
  3. Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
  4. Solchaga, L. A., Penick, K., Goldberg, V. M., Caplan, A. I., Welter, J. F. Fibroblast growth factor-2 enhances proliferation and delays loss of chondrogenic potential in human adult bone-marrow-derived mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1009-1019 (2010).
  5. Guzzo, R. M., Drissi, H. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Chondrocytes. Methods Mol Biol. 1340, 79-95 (2015).
  6. Drissi, H., Gibson, J. D., Guzzo, R. M., Xu, R. H. Derivation and Chondrogenic Commitment of Human Embryonic Stem Cell-Derived Mesenchymal Progenitors. Methods Mol Biol. 1340, 65-78 (2015).
  7. Nejadnik, H., et al. Improved approach for chondrogenic differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 11 (2), 242-253 (2015).
  8. Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
  9. Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
  10. Ko, J. Y., Kim, K. I., Park, S., Im, G. I. In vitro chondrogenesis and in vivo repair of osteochondral defect with human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (11), 3571-3581 (2014).
  11. Nam, Y., Rim, Y. A., Jung, S. M., Ju, J. H. Cord blood cell-derived iPSCs as a new candidate for chondrogenic differentiation and cartilage regeneration. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 16(2017).
  12. Hotten, G. C., et al. Recombinant human growth/differentiation factor 5 stimulates mesenchyme aggregation and chondrogenesis responsible for the skeletal development of limbs. Growth Factors. 13 (1-2), 65-74 (1996).
  13. Murphy, M. K., Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. TGF-beta1, GDF-5, and BMP-2 stimulation induces chondrogenesis in expanded human articular chondrocytes and marrow-derived stromal cells. Stem Cells. 33 (3), 762-773 (2015).
  14. Shintani, N., Siebenrock, K. A., Hunziker, E. B. TGF-ss1 enhances the BMP-2-induced chondrogenesis of bovine synovial explants and arrests downstream differentiation at an early stage of hypertrophy. PLoS One. 8 (1), e53086(2013).
  15. Fukumoto, T., et al. Combined effects of insulin-like growth factor-1 and transforming growth factor-beta1 on periosteal mesenchymal cells during chondrogenesis in vitro. Osteoarthritis Cartilage. 11 (1), 55-64 (2003).
  16. Worster, A. A., Nixon, A. J., Brower-Toland, B. D., Williams, J. Effect of transforming growth factor beta1 on chondrogenic differentiation of cultured equine mesenchymal stem cells. Am J Vet Res. 61 (9), 1003-1010 (2000).
  17. Knippenberg, M., et al. Differential effects of bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-beta1 on gene expression of collagen-modifying enzymes in human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 15 (8), 2213-2225 (2009).
  18. Jang, Y., et al. Centrifugal gravity-induced BMP4 induces chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells via SOX9 upregulation. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 184(2016).
  19. Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Res Ther. 6, 144(2015).
  20. Tao, H., et al. Biological evaluation of human degenerated nucleus pulposus cells in functionalized self-assembling peptide nanofiber hydrogel scaffold. Tissue Eng Part A. 20 (11-12), 1621-1631 (2014).
  21. Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Reger, R. L., Prockop, D. J. Comparison of effect of BMP-2, -4, and -6 on in vitro cartilage formation of human adult stem cells from bone marrow stroma. Cell Tissue Res. 320 (2), 269-276 (2005).
  22. Shen, B., Wei, A., Tao, H., Diwan, A. D., Ma, D. D. BMP-2 enhances TGF-beta3-mediated chondrogenic differentiation of human bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells in alginate bead culture. Tissue Eng Part A. 15 (6), 1311-1320 (2009).
  23. Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J Vis Exp. (118), (2016).
  24. Kim, Y., et al. The Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Blood Cells: An Efficient Protocol Using Serial Plating of Reprogrammed Cells by Centrifugation. Stem Cells Int. 2016, 1329459(2016).
  25. Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
  26. Toh, W. S., et al. Differentiation and enrichment of expandable chondrogenic cells from human embryonic stem cells in vitro. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3570-3590 (2009).
  27. Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Derivation of chondrogenically-committed cells from human embryonic cells for cartilage tissue regeneration. PLoS One. 3 (6), e2498(2008).
  28. Nakagawa, T., Lee, S. Y., Reddi, A. H. Induction of chondrogenesis from human embryonic stem cells without embryoid body formation by bone morphogenetic protein 7 and transforming growth factor beta1. Arthritis Rheum. 60 (12), 3686-3692 (2009).
  29. Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
  30. Rim, Y. A., Park, N., Nam, Y., Ju, J. H. Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients. J Vis Exp. (116), (2016).
  31. Pfaff, N., et al. Efficient hematopoietic redifferentiation of induced pluripotent stem cells derived from primitive murine bone marrow cells. Stem Cells Dev. 21 (5), 689-701 (2012).
  32. Xu, H., et al. Highly efficient derivation of ventricular cardiomyocytes from induced pluripotent stem cells with a distinct epigenetic signature. Cell Res. 22 (1), 142-154 (2012).
  33. Lee, S. B., et al. Contribution of hepatic lineage stage-specific donor memory to the differential potential of induced mouse pluripotent stem cells. Stem Cells. 30 (5), 997-1007 (2012).
  34. Hu, S., et al. Effects of cellular origin on differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells. JCI Insight. 1 (8), 1-12 (2016).
  35. Vonk, L. A., de Windt, T. S., Slaper-Cortenbach, I. C., Saris, D. B. Autologous, allogeneic, induced pluripotent stem cell or a combination stem cell therapy? Where are we headed in cartilage repair and why: a concise review. Stem Cell Res Ther. 6 (94), 1-11 (2015).
  36. Gomez-Leduc, T., et al. Chondrogenic commitment of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in collagen matrices for cartilage engineering. Sci Rep. 6, 32786(2016).
  37. Mareschi, K., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells: bone marrow versus umbilical cord blood. Haematologica. 86 (10), 1099-1100 (2001).
  38. Wexler, S. A., et al. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal 'stem' cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. Br J Haematol. 121 (2), 368-374 (2003).
  39. Zhang, X., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood: reevaluation of critical factors for successful isolation and high ability to proliferate and differentiate to chondrocytes as compared to mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose tissue. J Cell Biochem. 112 (4), 1206-1218 (2011).
  40. Wagner, W., et al. Replicative senescence of mesenchymal stem cells: a continuous and organized process. PLoS One. 3 (5), e2213(2008).
  41. Tarte, K., et al. Clinical-grade production of human mesenchymal stromal cells: occurrence of aneuploidy without transformation. Blood. 115 (8), 1549-1553 (2010).
  42. Chen, W. C., et al. Prediction of poor survival by cyclooxygenase-2 in patients with T4 nasopharyngeal cancer treated by radiation therapy: clinical and in vitro studies. Head Neck. 27 (6), 503-512 (2005).
  43. Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

脐带血iPSCs类胚体分化软骨诱导分化培养基阿利新蓝染色甲苯胺蓝染色II型胶原实时PCR石蜡包埋血细胞计数板计数
由脐带血来源的诱导多能干细胞形成软骨细胞样细胞团
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。