本文提出了一种从脐带血单个核细胞来源的人诱导性多能干细胞进行软骨细胞分化的方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
人体关节软骨缺乏自我修复能力，因此软骨退变的治疗并非采用根治性手段，而是以保守治疗为主。目前，人们正致力于通过再生医学方法修复受损软骨 离体 扩增的软骨细胞或骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）。然而，这些细胞的存活率有限且稳定性较差，限制了其在软骨重建中的应用。人诱导性多能干细胞（hiPSCs）因其在再生医学应用中的潜力而受到科学界关注。凭借无限的自我更新能力和多向分化潜能，hiPSCs 已被视为软骨修复的一种新型替代细胞来源。然而，获得大量高质量的软骨形成细胞团仍是其临床应用的主要挑战。在本研究中，我们采用胚胎体（EB）来源的外生长细胞进行软骨向分化。通过 PCR 以及阿利新蓝、甲苯胺蓝染色和针对 I 型与 II 型胶原蛋白（分别为 COL1A1 和 COL2A1）抗体的免疫染色，证实了软骨形成的成功。本文提供了一种详细的实验方法，用于将脐带血单个核细胞来源的 iPSCs（CBMC-hiPSCs）分化为软骨形成细胞团。
引言
人诱导多能干细胞（hiPSCs）的应用代表了一种针对多种疾病进行药物筛选和机制研究的新策略。从再生医学的角度来看，hiPSCs 还有望成为修复愈合能力有限的受损组织（如关节软骨）的潜在细胞来源1,2。
天然关节软骨的再生几十年来一直是一项挑战。关节软骨是一种覆盖在骨端的白色柔软组织，可保护骨骼免受摩擦损伤。然而，当其受损后再生能力有限，几乎无法实现自我修复。因此，针对软骨再生的研究已持续数十年。
此前， 体外 向软骨细胞系分化通常使用骨髓间充质干细胞或从膝关节分离的原代软骨细胞进行3由于具有软骨形成潜能，骨髓间充质干细胞（BMSCs）和天然软骨细胞在软骨生成中具有多种优势，支持其在该领域的应用。然而，由于其增殖能力有限且表型不稳定，这些细胞在关节软骨缺损修复中面临诸多局限性。 体外 培养条件下，这些细胞在传代3-4次后 tends to 逐渐丧失其自身特性，最终影响其分化能力4此外，在获取原代软骨细胞时，不可避免地会对膝关节造成额外损伤。
与骨髓间充质干细胞（BMSCs）或原代软骨细胞不同，hiPSCs 可无限扩增
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本方案已获得韩国天主教大学机构审查委员会的批准（KC12TISI0861）。用于重编程的脐带血单个核细胞（CBMCs）直接取自首尔圣玛丽医院脐带血库。
1. 从诱导多能干细胞诱导软骨形成分化
- CBMC-iPSC 的生成
- 使用我们先前研究中所述的方案生成 CBMC-hiPSCs23。
- 将血细胞收集至 15 mL 圆锥形离心管中，并使用血细胞计数板进行计数。
- 准备 3 × 105 个细胞，在室温下以 515 × g 离心 5 分钟。用抽吸法弃去上清液，并将细胞重悬于 0.5 mL 血细胞培养基中。
- 将细胞转移至未包被的 24 孔板的一个孔中，并按照生产商的建议加入仙台病毒混合物。
- 将培养板在 30 °C 下以 1,150 × g 离心 30 分钟。
- 离心后，在 37 °C、5% CO2 条件下过夜（O/N）培养细胞。
- 次日，将转导后的细胞转移至基质包被的孔中。在 30 °C 下以 1,150 × g 离心培养板 30 分钟。
- 离心后，弃去上清液，加入 1 mL iPSC 培养基，并在 37 °C、5% CO2 条件下过夜维持细胞。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本研究通过诱导EB来源的外延细胞，利用已证实具有高多能性的CBMC-hiPSCs生成软骨形成细胞团。软骨分化诱导使用具有高多能性的CBMC-hiPSCs进行11本方案的简单示意图如图所示 图1A分化前，iPSC 克隆进行了扩增（图1B）。扩增的iPSCs被组装成EB以启动分化（图1C）。将生成的拟胚体接种至明胶包被的培养皿中，以诱导其向外生长细胞（图1D）。随后，收集长出的细胞并用于生成软骨形成小球。经过21天的分化后，获得微小的珠状软骨形成小球，并用于进一步表征（图1E）。样品的质量 体外-通过多种检测方法证实了成软骨细胞球的生成。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案成功地从脐带血单个核细胞（CBMCs）生成了人诱导多能干细胞（hiPSCs）。我们利用含有山中因子的仙台病毒载体将CBMCs重编程为hiPSCs24。在分化实验中使用了三个案例，所有实验均成功地通过该方案生成了软骨形成细胞团。已有大量研究报道了将hiPSCs分化为软骨细胞的方案25,26,27,28。然而，仍需进一步研究以确认CBMC-hiPSCs是否可作为软骨再生与修复的候选细胞来源。
已使用来源于多种体细胞类型的 hiPSCs 验证了软骨形成能力11,25,26,<.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何披露信息。
致谢
本工作获得了韩国医疗技术研究开发项目（Korea Healthcare Technology R&D项目，卫生福利部 & 家庭事务，大韩民国（HI16C2177）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 塑料器皿 | |||
| 100 mm 培养皿 | TPP | 93100 | |
| 6 孔板 | TPP | 92006 | |
| 50 mL 离心管 | SPL | 50050 | |
| 15 mL 离心管 | SPL | 50015 | |
| 10 mL 一次性移液管 | Falcon | 7551 | |
| 5 mL 一次性移液管 | Falcon | 7543 | |
| 12 孔板 | TPP | 92012 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 描述 |
| E8 培养基材料 | |||
| DMEM/F12，含 HEPES | Life Technologies | 11330-057 | E8 培养基 (500 mL) |
| 碳酸氢钠 | Life Technologies | 25080-094 | E8 培养基 (浓度：543 μg/mL) |
| 亚硒酸钠 | Sigma Aldrich | S5261 | E8 培养基 (浓度：14 ng/mL) |
| 人转铁蛋白 | Sigma Aldrich | T3705 | E8 培养基 (浓度：10.7 μg/mL) |
| 碱性 FGF2 | Peprotech | 100-18B | E8 培养基 (浓度：100 ng/mL) |
| 人胰岛素 | Life Technologies | 12585-014 | E8 培养基 (浓度：20 μg/mL) |
| 人 TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | E8 培养基 (浓度：2 ng/mL) |
| 抗坏血酸 | Sigma Aldrich | A8960 | E8 培养基 (浓度：64 μg/mL) |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| 纤连蛋白 | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK 抑制剂 | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 描述 |
| 质量控制材料 | |||
| 18 mm 盖玻片 | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% 多聚甲醛 | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| 吐温 X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| 牛血清白蛋白 | Vector Lab | SP-5050 | |
| 抗 SSEA4 抗体 | Millipore | MAB4304 | |
| 抗 Oct4 抗体 | Santa Cruz | SC9081 | |
| 抗 TRA-1-60 抗体 | Millipore | MAB4360 | |
| 抗 Sox2 抗体 | Biolegend | 630801 | |
| 抗 TRA-1-81 抗体 | Millipore | MAB4381 | |
| 抗 Klf4 抗体 | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 抗体 | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG (H+L) 抗体 | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36934 | |
| 4% 多聚甲醛 | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| 吐温 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| 牛血清白蛋白 | Vector Lab | SP-5050 | |
| 抗胶原蛋白 II 抗体 | abcam | ab34712 | 1:100 |
| 阿利新蓝 | Sigma Aldrich | A3157-10G | |
| 快绿 FCF | Sigma Aldrich | F7252-25G | |
| 番红 O | Sigma Aldrich | 090m0039v | |
| 核固红 | Americanmastertech | STNFR100 | |
| 二甲苯 | Duksan | 115 | |
| 乙醇 | Duksan | 64-17-5 | |
| 迈耶苏木精溶液 | wako pure chemical industries | LAK7534 | |
| DAP | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
| 载玻片，涂层 | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| 氯仿 | Sigma Aldrich | 366919 | |
| 异丙醇 | Millipore | 109634 | |
| 乙醇 | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid 第一链 cDNA 合成试剂盒 | Thermo Scientfic | K1622 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 描述 |
| 软骨分化材料 | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | 软骨分化培养基组分 (500 mL) |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | P4333 | 软骨分化培养基组分 (浓度：1%) |
| 抗坏血酸 | Sigma Aldrich | A8960 | 软骨分化培养基组分 (浓度：64 μg/mL) |
| MEM 非必需氨基酸溶液 (100x) | Life Technologies | 11140-050 | 软骨分化培养基组分 (浓度：100 mM) |
| rhBMP-2 | R&D | 355-BM-050 | 软骨分化培养基组分 (浓度：100 ng/mL) |
| 重组人 TGF-β3 | R&D | 243-B3-002 | 软骨分化培养基组分 (浓度：10 ng/mL) |
| KnockOut 血清替代物 | Life Technologies | 10828-028 | 软骨分化培养基组分 (浓度：1%) |
| ITS+ 预混液 | BD | 354352 | 软骨分化培养基组分 (浓度：1%) |
| 水溶性地塞米松 | Sigma Aldrich | D2915-100MG | 软骨分化培养基组分 (浓度：10-7 M) |
| GlutaMAX 补充剂 | Life Technologies | 35050-061 | 软骨分化培养基组分 (浓度：1%) |
| 丙酮酸钠溶液 | Sigma Aldrich | S8636 | 软骨分化培养基组分 (浓度：1%) |
| L-脯氨酸 | Sigma Aldrich | P5607-25G | 软骨分化培养基组分 (40 μg/mL) |
参考文献
- van Osch, G. J., et al. Cartilage repair: past and future--lessons for regenerative medicine. J Cell Mol Med. 13 (5), 792-810 (2009).
- Ahmed, T. A., Hincke, M. T. Strategies for articular cartilage lesion repair and functional restoration. Tissu....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
