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腺相关病毒大鼠静脉注射方法及中枢神经系统转导效果评估的方法与技巧

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DOI：

10.3791/55994

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2017年8月25日

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1Department of Pharmacology, Toxicology, and Neuroscience, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Molecular & Integrative Physiology, University of Kansas Medical Center

本文内容

摘要

介绍了在大鼠中实现中枢神经系统大范围基因递送的方法。本示例的目的是模拟一种影响整个脊髓的疾病。通过广泛的转导，可实现仅通过一次外周给药，便将治疗性蛋白递送至中枢神经系统。

摘要

腺相关病毒（AAV）载体是神经科学领域中用于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）、光遗传学、cre-lox靶向等研究的关键试剂。本文旨在为研究人员通过尾静脉注射AAV在大鼠中实现广泛的中枢神经系统（CNS）基因转移提供指导。广泛性的基因表达对于具有弥散性病理特征的疾病研究尤为重要，而大鼠模型因其体型较大且生理特征比小鼠更接近人类，具有重要研究价值。在本示例应用中，通过大范围神经元转导模拟影响整个脊髓的神经退行性疾病——肌萎缩侧索硬化症（ALS）。高效的广泛性中枢神经系统转导还可用于临床前研究中治疗性蛋白因子的递送。注射后经过数周的表达期，对转导效果进行评估。对于绿色荧光蛋白（GFP）对照载体，可通过基础成像程序快速、可靠地估算小脑中的GFP表达量。对于由与ALS相关的43 kDa反式激活应答DNA结合蛋白（TDP-43）诱导的运动功能障碍表型，则通过逃避反射和转棒实验进行评分。除疾病建模和基因治疗外，本文所述的大范围基因靶向技术还具有多种潜在应用。该方法的进一步推广将有助于加快神经科学与神经遗传学领域的假设验证进程。

引言

重组腺相关病毒（AAV）载体是中枢神经系统（CNS）研究中不可或缺的工具，因其在体内转导神经元的效率极高。AAV载体具有高度的多功能性，可用于研究不同的目的基因和蛋白亚型、不同组织、不同宿主物种以及不同的给药途径。例如，如Foust et al. 和 Duque et al. 首次报道（参见Gombash et al. (2014) 的JOVE论文），可通过外周静脉注射这一相对无创的方式将AAV给予小鼠，从而实现对整个中枢神经系统神经元的转导。1,2,3 这种基因递送方法也已应用于大鼠，可高效表达绿色荧光蛋白（GFP）或与肌萎缩侧索硬化（ALS）相关的43 kDa反式激活应答DNA结合蛋白（TDP-43）。4,5,6,7,8,9 使用大鼠进行研究具有重要意义，因为与小鼠相比，大鼠的生理和代谢参数更接近人类，且已有多种专为大鼠设计的行为学和毒理学检测方法。此外，越来越多的转基因大鼠品系正在被开发出来，可用于AAV基因转移研究。

本文详细介绍了在大鼠中进行广泛性中枢神经系统（CNS）基因转导的方法，以及对结果进行快速、可靠定量的手段。通过在脊髓内广泛表达TDP-43，实现大范围CNS转导，以模拟大鼠中肌萎缩侧索硬化症（ALS）的症状表型。该方法采用尾静脉注射TDP-43载体至年轻成年大鼠体内，如Jackson et al.6,8,9 所述。数周后，采用两种方法评估TDP-43诱导的运动功能障碍：逃避反射和转棒实验，如Dayton et al. 和 Jackson et al.5,6,7,9 所采用的方法。对于对照组GFP载体，在死后分析中，通过计算小脑的荧光区域面积作为转导效率的指标，如Jackson et al.6,8 所述。小脑分析已被证实是评估外周基因递送后中枢神经系统转导程度的一种快速且可靠的指标，可适用于多种尝试实现外周至中枢基因转移的方法。

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方案

所有操作均遵循相应的美国国立卫生研究院（NIH）指南。所有实验程序均经路易斯安那州立大学什里夫波特健康科学中心动物护理与使用委员会批准的动物实验方案许可。本实验采用6周龄的雌性Sprague-Dawley大鼠。

1. 确定所需载体的剂量/体积

  1. 称重待注射的大鼠，并根据病毒载体原液的滴度（浓度）确定每只动物所需的病毒载体用量。使用既往在大鼠中枢神经系统中已证实可实现高效表达的载体剂量（参见 Jackson et al.6）。
    注意：对于 AAV9 TDP-43 或 AAV9 GFP，典型剂量为每千克体重 3 × 1013 - 1 × 1014 个病毒基因组。6 周龄的年轻成年大鼠体重约为 150 g。
  2. 为进行系统性比较，所有动物应按每千克体重给予等量的剂量。确保注射体积不超过推荐的标准注射体积（250 g 大鼠为 250 - 500 µL）。对年轻成年大鼠的典型注射体积为 200 μL。

2. 准备工作台

  1. 准备所有必需的耗材：每只动物配备一张石蜡膜（约 5 × 5 cm）、一个酒精消毒片、2–3 块纱布垫、移液器吸头和微量移液器。
  2. 用 70% 乙醇清洁操作台面以准备操作区域。放置加热垫并将温度设为低档（约 37 °C），在加热垫上方放置实验台垫。
  3. 准备气体麻醉剂（异氟烷），确保手术过程中有充足的氧气和气体麻醉供应。用 70% 乙醇清洁诱导室和麻醉面罩，并将麻醉面罩放置在实验台垫上。

3. 准备载体

  1. 将载体在室温下解冻，并为每只动物标记一个无菌的微量离心管。
  2. 用移液器将步骤1.1中确定体积的AAV加入相应的管中，并用乳酸林格液或生理盐水将体积补足至所需的注射体积（此处为200 μl）。
  3. 短暂涡旋震荡样品1–2秒，然后短暂离心5秒，使样品沉至管底。
  4. 将大鼠所需的全部注射体积从管中移出，滴加到一片石蜡膜上。
  5. 在1 mL注射器上安装一根30号针头。
  6. 将针头斜面朝下插入石蜡膜上的载体液滴中，缓慢回拉注射器活塞，直至所有病毒液体进入针头和注射器内。注意避免吸入气泡，此操作可通过练习逐步熟练掌握。

4. 准备大鼠

  1. 将氧气流量调至 1 L/min，并将异氟烷麻醉剂浓度设为 5%。通过检查所有连接软管和三通阀的方向，确保麻醉气体正常流入诱导室。
  2. 将大鼠放入气体麻醉诱导室中约 3 分钟，直至大鼠失去反应。
  3. 通过夹捏脚趾判断麻醉深度是否足够：夹捏后脚部或腿部应无任何运动。
  4. 将异氟烷麻醉剂浓度降至 2%，以维持麻醉状态，并调整三通阀，使麻醉气体流向麻醉面罩。
  5. 将大鼠的鼻子放入麻醉面罩中，并调整大鼠体位，使其侧卧。
  6. 定位尾部侧静脉。
    注：以尾巴背侧顶端为 12 点钟方向，两条侧静脉大约位于 10 点和 2 点钟位置。当大鼠侧卧时，侧静脉应朝上。
  7. 用酒精消毒片擦拭注射区域。注射部位位于尾部长度的下三分之二处。

5. 注射载体

  1. 用一根手指紧握尾部注射区域稍上方的部位，手指正对侧尾静脉，以使静脉扩张。
  2. 针尖斜面朝上，将针头与可见的尾静脉对齐，并保持同向。
  3. 刺穿尾静脉上方的皮肤时，需格外小心，避免伤及另一只手所持的尾部及压迫尾静脉。
  4. 松开对尾静脉的压力，以恢复正常的血流。
  5. 将针头推进静脉内。为确认针头已刺入尾静脉，可轻轻回抽活塞。若针头位于静脉内，血液将流入针管。
    1. 根据需要调整针头位置。随后，为固定针头，将位于注射部位上方的手移至注射部位下方，并将注射器末端紧贴尾部。
  6. 缓慢将载体注入尾部（约 20 µL/s）。
    注意：随着载体流经静脉，静脉颜色可能变淡。若发现注射部位出现肿泡、皮肤变白或推注时阻力增大，则提示溶液可能已注入血管外。通过练习可尽量减少血管外暴露。
  7. 完成载体注射后，将针头从大鼠体内拔出，并用纱布按压注射部位 30 - 60 秒，以帮助止血。

6. 清理

  1. 关闭异氟烷麻醉和氧气。监测大鼠直至其恢复意识，然后将其放回笼中。
  2. 将所有针头小心放入锐器容器中。将可能被腺相关病毒（AAV）污染的其他一次性材料丢弃至适当的生物危害容器中。用70%乙醇清洁工作台面。

7. 评估后肢逃避反射

注意：后肢功能缺陷通常在TDP-43基因转导后2至6周出现，具体时间取决于载体剂量。

  1. 在无杂物的平坦表面上，用两根手指抓住大鼠尾部靠近身体约2 cm处，轻轻提起大鼠，使其前肢悬空，同时观察大鼠腹侧面。
    1. 在基因转导后的整个实验过程中，每周执行一次该操作（例如，基因转导后最长持续12周）。
      注意：也可采用此方法评估前肢功能障碍，但根据所用载体剂量的不同，该模型中更易出现后肢功能障碍。
  2. 观察后肢10秒，记录在10秒内是否有一侧或双侧后肢向中线方向紧缩。
  3. 重复该测试共三次，每次间隔30秒。若在三次测试中，一侧或双侧后肢均出现紧缩，则表明该大鼠存在运动功能障碍。若三次测试中均出现持续性紧缩，需记录数据（手动记入笔记），注明存在单侧或双侧后肢功能障碍。

8. 在转棒上评估运动功能

  1. 设置转棒仪时，在转棒仪下方放置一个实验台垫，并将转速设置为在2分钟内从4转/分钟（rpm）匀加速至40转/分钟（转速每秒增加约0.3 rpm）。对于为期12周的实验时间进程，在基因转导后的第2、4、8和12周对实验动物进行测试。
  2. 让大鼠在测试室中适应环境20分钟。
  3. 首次训练大鼠使用转棒仪时，先将转棒仪以4 rpm的固定转速启动，然后将大鼠放置于转棒仪上。让大鼠以4 rpm的速度行走一整圈后，开始加速，继续让大鼠在转棒仪上行走直至其掉落。持续训练，直到大鼠能够稳定地持续行走至少40秒。健康年轻的成年大鼠通常可顺利通过此种方式完成训练。
    1. 若大鼠存在明显运动功能障碍，可能无法达到40秒的基线掉落潜伏期，则在开始转棒仪评分前，给予该大鼠3–5次训练尝试。
  4. 开始转棒仪测试时，将大鼠置于转棒仪上并启动加速程序。记录大鼠从转棒仪上掉落的时间，即为掉落潜伏期。若大鼠在转棒仪上持续停留超过120秒，则在此时终止测试，将大鼠从转棒仪上取下，并记录其掉落潜伏期为120秒。
  5. 重复测试共三次，总计进行三轮试验。为尽量减少疲劳效应，每次试验之间应至少间隔5分钟。取三次试验得分的平均值。无功能障碍的成年大鼠通常平均掉落潜伏期>40秒。
  6. 将大鼠放回笼中，并使用70%乙醇清洁转棒仪及其周围区域。

9. 小脑中GFP表达的定量分析

  1. 麻醉大鼠，先用磷酸盐缓冲液（PBS）灌注，再用4%多聚甲醛灌注。解剖取出脑和脊髓组织，浸泡于固定液中过夜，随后转移至30%蔗糖溶液中。待组织充分平衡后，在带冷冻台的滑动式切片机上切取50 μm厚的冠状切片4,5,6。
  2. 选择小脑蚓部（小脑的中央叶）中分布均匀的3–6个切片。对GFP进行荧光标记以最大化信号强度。一抗使用1:500稀释的GFP抗体，二抗使用1:300稀释的Alexa-488标记的二抗4,5,6。
    注：有关取样、切片和染色步骤的更多细节，请参见参考文献4,5,6。
  3. 使用显微镜配备低倍物镜，对目标区域内的每个切片进行显微摄影。采用2.5倍物镜（数值孔径N.A. 0.12）和滤光片组10（激发波长450–490 nm，发射波长515–565 nm）。保持相机设置（如曝光时间，例如2秒）在所有待分析样本间一致。保存为.TIF格式文件。
  4. 在广泛使用的Scion图像程序中打开显微照片；将同时打开两个窗口。关闭标记为"Indexed Color"的窗口。
  5. 选择"Options"，然后选择"Density Slice"；在查找表（LUT）窗口中，将以红色标示一系列灰度范围。在该窗口中，使用光标仅填充特异性GFP标记区域，当图像中开始出现非特异性背景信号时即停止。
    注：此操作将突出显微照片中待定量的荧光区域。应优化设置，以特异性捕获所有可见的荧光细胞。经过练习，该方法可精确地突出特异性荧光信号。
  6. 在测量荧光面积之前，首先确保测量单位正确（像素）。为此，点击"Analyze"，然后点击"Set Scale"；第四行应显示"Units"。从下拉菜单中选择“pixels”以像素为单位进行测量，然后点击"OK"。将分析选项切换为"Include Interior Holes"，以确保在分析中包含完整的细胞体。
  7. 测量荧光面积时，点击"Analyze"，然后点击"Measure"。要查看该数值，点击"Analyze"，然后点击"Show Results"；将弹出结果窗口。荧光面积的测量值将列在标有"Area"的标题下。
  8. 为确保各测量之间的一致性，不得更改LUT窗口中已高亮的数值。
  9. 记录所有测量值后，计算每只动物（每只动物取3–6个切片）的平均值。采用适当的统计学方法比较各组之间的转导区域面积6。

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结果

根据所使用的AAV TDP-43剂量，TDP-43诱导的运动功能障碍应在2至6周内出现（图1）。尾静脉注射失败将导致部分或无功能障碍；AAV必须进入血液循环才能产生效应。成功注射AAV GFP后，GFP将在脑和脊髓中表达，且表达水平依赖于载体剂量。当使用强重组启动子——即巨细胞病毒-鸡β-肌动蛋白杂合启动子（又称CAG启动子）驱动表达时，中枢神经系统（CNS）以及肝脏、心脏等多个其他组织中均可实现高效表达。4,5,10 在大鼠中枢神经系统中，使用AAV9或AAV PHP.B载体时，主要表现为神经元的转导，胶质细胞的转导则极为稀疏且零星分布。4,8 由于在大鼠中采用大规模方法未观察到性别间转导效率的差异，通常选择体...

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讨论

已针对腺相关病毒（AAV）载体测试了多种递送途径：脑实质内、脑室内、鞘内、静脉、鼻内、肌肉内等。每种途径均有其特定的优势与局限性。在成年大鼠中通过尾静脉注射AAV是一种可靠的方法，可实现中枢神经系统（CNS）稳定且一致的转导。这种外周注射方法避免了将注射套管插入中枢神经系统组织，因此具有最小侵入性。该技术最大的优势在于能够高效实现中枢神经系统的基因表达。其他实际优势还包括操作速度快（每只动物从开始到结束约10分钟），以及尾静脉注射技术难度较低，易于快速掌握。当然，其主要缺点是需要大量高滴度的病毒载体，若AAV制备物的滴度低于1 × 1013 拷贝基因组/mL，则可能难以实施。随着病毒载体靶向能力的进一步优化，鉴于该方法通过外周途径递送基因，具有相对非侵入性的特点，未来可能在临床基因治疗中具备应用前景。另一方面，更直接的脑脊液内注射在临床前和临床研究中可能具有两项优势：病毒载体分布范围更局限，以及所需病毒剂量更低。

在色素较深的大鼠中，尾静脉可能更难识别，因此可采用其他给药途径，例如眶后注射或隐静脉静脉注射。眶后注射针对的是密集的毛细血管床，因此类似于静脉注射。...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由肌萎缩侧索硬化症协会、Karyopharm Therapeutics公司、Meira GTx公司以及Thomas Lawson为肌萎缩侧索硬化症研究提供的慈善捐赠资助，我们对此表示感谢。我们感谢Elysse Orchard和Donna Burney提供的建议与培训。JAS获得了Lied基金会和美国国立卫生研究院资助GM103418的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
规格PelouzeSP5
纳尔吉恩桶Thermo Scientific120140004000 mL
微量离心管USA Scientific1615-5500
乳酸林格氏液Baxter Healthcare0338-0114-04
小型涡旋振荡器Fisher Scientific128101
离心机Eppendorf22624415
实验室封口膜BemisPM996
1 mL 注射器BD309626附带 25g 针头。
注射时更换为 27–30g 针头
30g 针头BD305106
异氟烷Piramal Healthcare66794-013-25异氟烷 USP 250 mL
麻醉面罩Kopf Instruments906
纱布Henry Schein100-25242" × 2" (5 cm × 5 cm)
移液器吸头USA Scientific1111-0816
微量移液器Gilson4642080
气体麻醉蒸发器SurgiVet4214322Classic T3
气体麻醉废气清除装置SurgiVet32373B10Enviro-PURE
加热垫Sears17280
实验台垫VWR56617-006
转棒仪Panlab/Harvard Apparatus76-07724 只大鼠 / 4 只小鼠
70% 乙醇Decon Laboratories, Inc.2401140 proof
70% 异丙醇VWR89108-160
Scion ImageScion Corporation
GFP 标签多克隆抗体InvitrogenA11122一抗 — 1:500 稀释
AlexaFluor 488InvitrogenA11070二抗 — 1:300 稀释
Axioskop 40 显微镜Zeiss

参考文献

  1. Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
  2. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
  3. Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037(2014).
  4. Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).
  5. Dayton, R., et al. Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis. Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).
  6. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036(2015).
  7. Jackson, K., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
  8. Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B. Front. Mol. Neurosci. 9, 116(2016).
  9. Jackson, K., et al. Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats. BMC Neuroscience. 17 (1), 69(2016).
  10. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
  11. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. Gene vector "magic bullet": targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter. Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).
  12. van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. Gas embolism: pathophysiology and treatment. Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).

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