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方法文章

活细胞成像技术研究抗真菌植物防御素进入真菌细胞的方式及其亚细胞定位

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DOI：

10.3791/55995

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2017年12月24日

 ,  , 
1Donald Danforth Plant Science Center, 2Department of Biology, Kutztown University of Pennsylvania

本文内容

摘要

植物防御素在植物抵御病原体过程中发挥着重要作用。为了有效利用这些抗真菌肽作为抗真菌剂，了解其作用机制（MOA）至关重要。本文描述了一种活细胞成像方法，用于研究这些肽作用机制中的关键方面。

摘要

小分子富含半胱氨酸的防御素是存在于所有植物中的一类最大的宿主防御肽家族。许多植物防御素表现出强烈的 体外 对多种真菌病原体具有抗真菌活性，因此在转基因作物中作为抗真菌剂具有潜在应用价值。为了充分挖掘植物防御素在病害防控中的潜力，阐明其作用机制（MOA）至关重要。随着先进显微技术的发展，活细胞成像已成为研究植物防御素抗真菌作用机制动态过程的有力工具。本文介绍了一种基于共聚焦显微镜的活细胞成像方法，结合两种荧光标记的植物防御素（MtDef4 和 MtDef5）与活体荧光染料，实现对MtDef4和MtDef5进入真菌细胞过程的实时可视化与分析。该方法能够提供丰富的信息，包括这些多肽的内化动力学、进入方式及其亚细胞定位。结合其他细胞生物学工具，这些技术为深入理解此类多肽作用机制的动态特征与复杂性提供了关键见解，并可用于比较这些多肽对不同真菌的作用机制。

引言

植物已进化出一套复杂的先天免疫系统，以防御微生物植物病原体1它们表达多种由基因编码的宿主防御肽，具有潜在的抗菌活性。2事实上，这些肽中的许多都表现出抗菌活性 体外3防御素是植物界中最大的宿主防御肽类之一4这些富含半胱氨酸的阳离子肽在微摩尔浓度下即对真菌和卵菌病原体表现出强烈的生长抑制活性，是抵御这些病原体的第一道防御屏障之一。5,6由于防御素具有强效的抗真菌活性，可在农业生物技术应用中用于培育抗病作物。在转基因作物的温室和田间试验中，组成型过表达多种植物防御素已被证明可增强其抗病性。6阐明这些抗真菌肽的作用机制（MOA）对于充分发掘其作为作物保护有效工具的潜力至关重要。然而，这些植物防御素的作用机制目前尚不明确。现有证据表明，它们表现出不同的作用机制5,6,7,8某些防御素在胞外作用于真菌，靶向特定的细胞壁/质膜定位的鞘脂类分子，破坏膜完整性并激活细胞毒性通路9,10,11然而，最近已发现可转位进入真菌细胞的抗真菌防御素12,13,14某些防御素可结合膜上的生物活性磷脂，形成寡聚复合物并使质膜通透化15,16,17因此，植物防御素的作用机制（MOA）在某些方面已得到阐明。然而，植物防御素的作用机制可能涉及一系列尚未被识别并整合到综合性模型中的复杂事件。特别是，我们对这些肽类分子的细胞靶标仍存在重大认知空白。

随着显微技术的最新进展以及新型荧光探针的开发，活细胞成像技术现已被广泛用于研究抗菌肽（AMPs）的作用机制（MOA）。这些技术补充了免疫定位、电子显微镜、原子力显微镜或X射线断层扫描等常用方法18，后者主要用于分析抗真菌肽对真菌细胞形态和生长的影响，包括细胞壁完整性、细胞生长/分枝模式的改变，以及质膜通透性和杀伤效应的研究。然而，这些研究大多局限于在肽处理后的某一时间点对细胞进行成像，而未对同一细胞进行时间序列的活细胞成像以监测其对防御素刺激的动态变化。近年来，将荧光标记的肽与共聚焦显微镜下的活细胞成像相结合，实现了对AMP–微生物相互作用动态过程的实时可视化。无论是天然纯化的还是化学合成的抗真菌肽，均可标记荧光染料（例如，DyLight、罗丹明、BODIPY或Alexa Fluor系列染料），并通过时间序列活细胞成像直接观察其与细胞的相互作用过程。这些标记肽的应用显著加深了我们对其作用机制多个方面的理解，包括进入模式、亚细胞定位、胞内转运过程以及在活体真菌细胞内的抗真菌作用位点18。

最近，多项研究表明，包括植物防御素在内的多种抗真菌肽能够被活体真菌细胞内化12,14,19,20。这些防御素的作用机制（MOA）可能涉及与细胞内靶标的相互作用。我们近期报道了植物防御素 MtDef4 在两种子囊菌（Neurospora crassa 和 Fusarium graminearum）中的抗真菌作用。研究表明，MtDef4 在这些真菌中通过不同的途径进入细胞，并实现亚细胞定位14。该研究采用了化学合成的四甲基罗丹明（TAMRA）标记的 MtDef4，并结合活细胞荧光染料（膜特异性染料 FM4-64、膜通透性染料 SYTOX Green、细胞死亡报告染料碘化丙啶）以及代谢抑制剂。这些分析揭示了 MtDef4 内化过程的动力学特征、其细胞内转运机制以及亚细胞作用靶标14。

本文介绍了一种利用共聚焦显微镜进行活细胞成像的实验方案。该方案结合荧光标记的多肽与活细胞荧光染料，用于研究植物防御素与真菌之间的相互作用，特别是防御素在真菌细胞中的转位途径及其细胞内作用靶点。

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方案

1. 用荧光染料标记防御素

  1. 选择一种对防御素在活细胞内的抗菌特性、摄取和定位影响最小的荧光染料。
    注意：选择最佳荧光染料需根据具体的实验目标而定。还应考虑荧光染料的光谱特性、化学性质、光稳定性、大小和电荷。
  2. 使用商业供应商提供的适当多肽标记试剂盒，用所选荧光染料对防御素进行标记。或者，可通过化学方法合成荧光染料标记的防御素。在本研究中，使用商业试剂盒按照制造商的说明书将MtDef5防御素标记DyLight550，而TAMRA标记的MtDef4防御素则由商业机构化学合成。
    注意：建议使用化学合成的荧光标记肽（尤其是长度为50个或更少氨基酸的短肽），因为可将荧光染料连接至肽的N端或C端残基，以确保对其抗菌活性的影响最小。合成含有三个以上二硫键的长肽具有挑战性。在此情况下，建议使用合适的市售肽标记试剂盒，选择最佳荧光染料对肽进行标记。
  3. 测试 体外 测定标记防御素的抗菌活性，并确定其对目标真菌的最小抑菌浓度（MIC）。
    注意：本研究中，测定了 DyLight550-MtDef5 和 TMR-MtDef4 对 Neurospora crassa 和 Fusarium graminearum.

2. 真菌培养与培养基

  1. 将分生孢子从一个 N. crassa 将菌种接种至含Vogel培养基的斜面试管中21 在室温光照条件下孵育5天。
  2. 培养 F. graminearum 含完全培养基（CM）平板上的 PH-1 菌株22 在28 ºC下培养5天。为产生分生孢子，接种4块（直径10 mm）5天大的菌落菌块于 F. graminearum 将PH-1接种于50 mL羧甲基纤维素（CMC）培养基（15 g羧甲基纤维素、1 g酵母提取物、0.5 g MgSO₄·7H₂O、0.5 g K₂HPO₄、0.5 g NaCl、0.2 g NH₄Cl、0.1 g CaCl₂·2H₂O，溶于1 L蒸馏水，pH调至7.0）中40.7 H2O，1 g NH₄Cl4一氧化氮3，以及 1 g KH2PO4在28 ºC、180 rpm条件下，于旋转摇床中培养4-7天。

3. 准备 的 分生孢子悬浮液

  1. F. graminearum 分生孢子悬液
    1. 涡旋混合 F. graminearum 液体培养并收集分生孢子：将1.5 mL真菌培养液通过两层滤膜材料（如Miracloth）过滤 转移到2 mL微量离心管中。在微量离心机中以13,226 × g离心2分钟。
    2. 弃去上清液，加入1 mL无菌水洗涤沉淀。
    3. 在微量离心机中以13,226 x g离心孢子悬液2分钟。弃上清液，将沉淀重悬于1 mL 2X SFM（合成真菌培养基）中。23.
    4. 使用血细胞计数板在光学显微镜下对分生孢子进行计数。
    5. 将分生孢子悬液调整至105 分生孢子/mL 与 2X SFM
  2. N. crassa 分生孢子悬液
    1. 转移少量培养物（培养5天） N. crassa 使用接种环将样品转移至含有2 mL Vogel液体培养基的微量离心管中。
    2. 涡旋振荡分生孢子悬液，并通过滤材过滤至新的微量离心管中。
    3. 在微量离心机中以最大速度离心分生孢子悬浮液2分钟。弃去上清液，将分生孢子沉淀重悬于1 mL Vogel液体培养基中。
    4. 使用血细胞计数板在光学显微镜下对分生孢子进行计数。
    5. 将分生孢子悬液调整至105 分生孢子/mL，使用Vogel液体培养基。

4. 样品制备与共聚焦显微镜观察

  1. MtDef4 defensin 在真菌细胞中的亚细胞定位
    1. 将每种分生孢子悬浮液（105 个分生孢子/mL）各 50 µL 加入 35 mm 玻璃底微孔培养皿的 10 mm 微孔中。若需观察分生孢子，可直接进入下一步；若需制备萌发菌丝，则将 N. crassa 和 F. graminearum 的分生孢子各 50 µL 加入 35 mm 培养皿中，在室温下孵育 3–6 小时以促进萌发。
    2. 向每个微孔培养皿中加入 50 µL 处于最低抑菌浓度（MIC）的荧光标记 defensin，并孵育 2.5 小时。此处使用的荧光标记 defensin（步骤 1.3）对 N. crassa 和 F. graminearum 的 MIC 均为 3 µM；TMR-MtDef4 对 N. crassa 和 F. graminearum 的 MIC 分别为 1 µM 和 12 µM。
    3. 在培养皿中加入 2 µL 膜特异性染料 FM4-64（终浓度：5 µM），孵育 30 分钟后立即置于共聚焦显微镜下进行成像。
    4. 选择白光激光器（WLL）。使用 488 nm 和 550 nm 的两种激光源分别激发 TMR-MtDef4 和 FM4-64 染料。TMR-MtDef4 的荧光检测范围为 580–700 nm，FM4-64 染料的检测范围为 690–800 nm。
      注：共聚焦显微镜操作应在暗室中进行。
  2. MtDef5 defensin 内化过程的时间序列成像
    1. 将 N. crassa 和 F. graminearum 的分生孢子悬浮液（105 个分生孢子/mL）各 50 µL 加入 35 mm 玻璃底微孔培养皿的 10 mm 微孔中。该微孔未经包被，底部为 No. 1.5 盖玻片。若需观察分生孢子，可直接进入下一步；若需观察萌发菌丝，则在室温下孵育分生孢子 3–6 小时后再进行显微观察。
    2. 开启白光激光器（WLL）。选择 550 nm 激光线以激发此处使用的荧光标记 defensin（步骤 1.3）和 FM4-64，激光强度设为 1.00%，并激活相应的检测器。此处使用的荧光标记 defensin（步骤 1.3）的荧光检测范围为 560–600 nm，FM4-64 染料的检测范围为 690–800 nm。
      注：活细胞成像时应使用低激光强度，高激光强度可能对活体真菌细胞造成损伤。
    3. 将微孔培养皿置于显微镜载物台上。先使用 10× 物镜定位细胞，再切换至 100×/1.44 油镜以获得更高放大倍数。
      注：在进入下一步前，应预先设置扫描模式为 xyzt 模式（Z-层扫与时间序列模式的组合）、Z 轴位置、缩放倍数、图像采集频率等参数。
    4. 向每个微孔培养皿中加入 50 µL 处于 MIC（3 µM）的荧光标记 defensin（步骤 1.3）以及 2 µL 膜特异性染料 FM4-64（终浓度 5 µM），随后启动时间序列成像。在微孔培养皿内放置少量湿润的滤纸片以防止蒸发。图像采集频率为每 3 分 30 秒一次，总时长为 2 小时 30 分钟。
      注：若在将微孔培养皿置于显微镜后才加入 defensin 和荧光染料，可能导致目标区域失焦。因此，在向微孔中加入 defensin 和荧光染料后，需重新对目标区域进行调焦，这可能导致图像采集延迟。
    5. 所有共聚焦成像均使用共聚焦显微镜完成，实验在室温下的暗室中进行。

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结果

通过活细胞成像技术追踪并比较了来自Medicago truncatula的两种防御素MtDef4和MtDef5在真菌细胞中的内化过程及亚细胞定位。TMR-MtDef4为化学合成，MtDef5则用Dylight550标记（Dylight550-MtDef5）。将分生孢子与任一防御素及膜特异性染料FM4-64共同孵育。图1显示，TMR-MtDef4在N. crassa中的运输途径与在F. graminearum中不同。在N. crassa中，FM4-64不与防御素共定位，而是标记了包裹防御素的液泡膜；而在F. graminearum中，TMR-MtDef4未定位于任何特定的膜结合细胞器内，而是弥散分布于细胞质中（图1）。

对用本实验所用的荧光标记防御...

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讨论

本研究描述了一种可靠的活细胞成像方法，该方法利用荧光标记的抗真菌防御素，用于研究这些肽进入真菌细胞的内化动力学，并确定其亚细胞靶标。该方法是一种强大的工具，可实现对防御素与真菌细胞之间相互作用在时间和空间上的动态可视化。

已有多种方法用于研究植物防御素在真菌细胞内的内化过程及细胞内定位。这些方法通常先将经防御素处理的细胞固定，再进行免疫定位、电子显微镜观察或X射线断层扫描15,24,25。此外，大多数此类技术仅限于在特定时间点对细胞进行成像，而无法通过延时成像对同一活细胞进行实时监测，以观察防御素刺激下发生的动态变化。能够实时可视化、分析并比较防御素抗真菌作用过程中真菌细胞内发生的动态事件，使该技术具有高效性和吸引力。此外，该技术有助于更深入地理解肽段在细胞内的动态定位如何随时间影响单个真菌细胞的形态发生过程。

该方法的一个重要方面是利用荧光...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢唐纳德·丹佛斯植物科学中心整合显微技术平台负责人 R. Howard Berg 博士在共聚焦显微镜使用方面提供的指导与帮助。作者声明无利益冲突。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
FM4-64 染料Life TechnologiesT13320
DyLight 550 抗体标记试剂盒Thermo Scientific84530
玻璃底细胞培养皿Mat TeKP35G-1.5-10-C
Mira 布EMD Millipore Corp475855-1R
SP8-X 共聚焦显微镜Leica
ImageJ 软件FiJi用于图像分析
Imaris 软件Bitplane用于图像分析

参考文献

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