植物防御素在植物抵御病原体过程中发挥着重要作用。为了有效利用这些抗真菌肽作为抗真菌剂，了解其作用机制（MOA）至关重要。本文描述了一种活细胞成像方法，用于研究这些肽作用机制中的关键方面。
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本文内容
摘要
摘要
小分子富含半胱氨酸的防御素是存在于所有植物中的一类最大的宿主防御肽家族。许多植物防御素表现出强烈的 体外 对多种真菌病原体具有抗真菌活性，因此在转基因作物中作为抗真菌剂具有潜在应用价值。为了充分挖掘植物防御素在病害防控中的潜力，阐明其作用机制（MOA）至关重要。随着先进显微技术的发展，活细胞成像已成为研究植物防御素抗真菌作用机制动态过程的有力工具。本文介绍了一种基于共聚焦显微镜的活细胞成像方法，结合两种荧光标记的植物防御素（MtDef4 和 MtDef5）与活体荧光染料，实现对MtDef4和MtDef5进入真菌细胞过程的实时可视化与分析。该方法能够提供丰富的信息，包括这些多肽的内化动力学、进入方式及其亚细胞定位。结合其他细胞生物学工具，这些技术为深入理解此类多肽作用机制的动态特征与复杂性提供了关键见解，并可用于比较这些多肽对不同真菌的作用机制。
引言
植物已进化出一套复杂的先天免疫系统，以防御微生物植物病原体1它们表达多种由基因编码的宿主防御肽，具有潜在的抗菌活性。2事实上，这些肽中的许多都表现出抗菌活性 体外3防御素是植物界中最大的宿主防御肽类之一4这些富含半胱氨酸的阳离子肽在微摩尔浓度下即对真菌和卵菌病原体表现出强烈的生长抑制活性，是抵御这些病原体的第一道防御屏障之一。5,6由于防御素具有强效的抗真菌活性，可在农业生物技术应用中用于培育抗病作物。在转基因作物的温室和田间试验中，组成型过表达多种植物防御素已被证明可增强其抗病性。6阐明这些抗真菌肽的作用机制（MOA）对于充分发掘其作为作物保护有效工具的潜力至关重要。然而，这些植物防御素的作用机制目前尚不明确。现有证据表明，它们表现出不同的作用机制5,6,7,8某些防御素在胞外作用于真菌，靶向特定的细胞壁/....
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方案
1. 用荧光染料标记防御素
- 选择一种对防御素在活细胞内的抗菌特性、摄取和定位影响最小的荧光染料。
注意：选择最佳荧光染料需根据具体的实验目标而定。还应考虑荧光染料的光谱特性、化学性质、光稳定性、大小和电荷。 - 使用商业供应商提供的适当多肽标记试剂盒，用所选荧光染料对防御素进行标记。或者，可通过化学方法合成荧光染料标记的防御素。在本研究中，使用商业试剂盒按照制造商的说明书将MtDef5防御素标记DyLight550，而TAMRA标记的MtDef4防御素则由商业机构化学合成。
注意：建议使用化学合成的荧光标记肽（尤其是长度为50个或更少氨基酸的短肽），因为可将荧光染料连接至肽的N端或C端残基，以确保对其抗菌活性的影响最小。合成含有三个以上二硫键的长肽具有挑战性。在此情况下，建议使用合适的市售肽标记试剂盒，选择最佳荧光染料对肽进行标记。 - 测试 体外 测定标记防御素的抗菌活性，并确定其对目标真菌的最小抑菌浓度（MIC）。
注意：本研究中，测定了 DyLight550-MtDef5 和 TMR-MtDef4 对 Neurospora crassa 和 Fusarium graminearum.
2. 真菌培养与培养基
- 将分生孢子从一个 N. crassa 将菌种接种至含Vog....
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结果
通过活细胞成像技术追踪并比较了来自Medicago truncatula的两种防御素MtDef4和MtDef5在真菌细胞中的内化过程及亚细胞定位。TMR-MtDef4为化学合成，MtDef5则用Dylight550标记（Dylight550-MtDef5）。将分生孢子与任一防御素及膜特异性染料FM4-64共同孵育。图1显示，TMR-MtDef4在N. crassa中的运输途径与在F. graminearum中不同。在N. crassa中，FM4-64不与防御素共定位，而是标记了包裹防御素的液泡膜；而在F. graminearum中，TMR-MtDef4未定位于任何特定的膜结合细胞器内，而是弥散分布于细胞质中（图1）。
对用本实验所用的荧光标记防御.......
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讨论
本研究描述了一种可靠的活细胞成像方法，该方法利用荧光标记的抗真菌防御素，用于研究这些肽进入真菌细胞的内化动力学，并确定其亚细胞靶标。该方法是一种强大的工具，可实现对防御素与真菌细胞之间相互作用在时间和空间上的动态可视化。
已有多种方法用于研究植物防御素在真菌细胞内的内化过程及细胞内定位。这些方法通常先将经防御素处理的细胞固定，再进行免疫定位、电子显微镜观察或X射线断层扫描15,24,25。此外，大多数此类技术仅限于在特定时间点对细胞进行成像，而无法通过延时成像对同一活细胞进行实时监测，以观察防御素刺激下发生的动态变化。能够实时可视化、分析并比较防御素抗真菌作用过程中真菌细胞内发生的动态事件，使该技术具有高效性和吸引力。此外，该技术有助于更深入地理解肽段在细胞内的动态定位如何随时间影响单个真菌细胞的形态发生过程。
该方法的一个重要方面是利用荧光.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢唐纳德·丹佛斯植物科学中心整合显微技术平台负责人 R. Howard Berg 博士在共聚焦显微镜使用方面提供的指导与帮助。作者声明无利益冲突。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| FM4-64 染料 | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 抗体标记试剂盒 | Thermo Scientific | 84530 | |
| 玻璃底细胞培养皿 | Mat TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Mira 布 | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X 共聚焦显微镜 | Leica | ||
| ImageJ 软件 | FiJi | 用于图像分析 | |
| Imaris 软件 | Bitplane | 用于图像分析 |
参考文献
- Jones, J. D. G., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).
- Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions. Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).
- Van Der ....
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重印与许可
