通过成像荧光质量中心对高尔基体蛋白进行定量定位

摘要

高尔基体驻留蛋白的精确定位对于理解高尔基体的细胞功能至关重要。然而，传统的光学显微镜无法分辨高尔基体的亚结构。本文介绍了一种基于常规显微镜的超分辨率方法，用于定量确定蛋白质在高尔基体内的亚定位。

摘要

高尔基体复合物由一系列平行堆叠的膜性扁囊组成，可进一步分为不同的亚高尔基区，包括顺式高尔基体（cis-Golgi）、中间高尔基体（medial-Golgi）、反式高尔基体（trans-Golgi）以及反式高尔基体网络（trans-Golgi network）。高尔基体的细胞功能取决于其驻留蛋白的特征性分布。传统光学显微镜的空间分辨率过低，无法分辨亚高尔基结构或扁囊。因此，免疫金标电子显微镜是实现高尔基体蛋白亚区定位的首选方法。然而，该技术及仪器超出了大多数细胞生物学实验室的能力范围。本文介绍我们近期开发的一种超分辨率方法——基于质心成像的高尔基体蛋白定位法（GLIM），可用于系统性且定量地定位高尔基体蛋白。GLIM基于标准的荧光标记流程以及常规的宽场或共聚焦显微镜。该方法包括显微系统色位移像差的校准、图像采集以及采集后的分析。待测蛋白的亚高尔基定位以定位商值进行定量表达。GLIM具有四个主要优势：快速、基于常规方法和工具、定位结果为定量数据，并可在高尔基体轴向上实现约30 nm的实际分辨率。本文详细描述了使用GLIM方法定位待测高尔基体蛋白的具体实验流程。

引言

高尔基体在哺乳动物细胞中对蛋白质和脂质的分泌/内吞运输（以下简称货物）起着至关重要的作用^1,2,3在高尔基体中，货物不仅被分选至各种亚细胞区室，还通过多种类型的糖基化进行修饰。哺乳动物的高尔基复合体由许多侧向连接的高尔基堆组成，每个高尔基堆通常包含4至11个紧密相邻且扁平的膜性囊泡，称为潴泡。这些依次堆叠的高尔基潴泡从一端到另一端可进一步分为 顺式，内侧和 转-池。在 转高尔基体堆的-侧 转- 大多数膜囊发育成一种称为管状网状膜网络的结构 转高尔基体网络（TGN）⁴在分泌途径中，源自内质网（ER）的货物在其高尔基堆的入口处进入 顺式侧，然后依次通过内侧和 转-池。货物最终从高尔基体的 转-高基氏体或反式高尔基网络靶向质膜、内体或分泌颗粒。

货物如何通过高尔基体堆栈以及高尔基体如何维持其囊泡结构的分子与细胞机制至今仍不明确，目前仍存在激烈争论¹。该领域的一个难点在于，高尔基体囊泡只能通过电子显微镜（EM）才能分辨，因为光学显微镜的分辨率（约 200 nm）不....

方案

注意：以下是使用GLIM逐步测定HeLa细胞中高尔基体定位酶酪氨酸蛋白硫酸转移酶1（TPST1）的EGFP标记蛋白的LQ值的实验方案。

1. 荧光标记高尔基体迷你堆的制备

1. 准备玻璃盖玻片
   1. 在生物安全柜中，将 0.3 mL 无菌 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）分装至 24 孔板的一个孔中。
   2. 用蘸有 70% 乙醇的软纸巾轻轻擦拭一片 Φ 12 mm No.1.5 玻璃盖玻片，以去除其表面的杂质。使用尖头镊子将盖玻片短暂浸泡于 70% 乙醇中，然后转移至 24 孔板中，并使其沉入含有无菌 DMEM 的孔底。
      注意：玻璃盖玻片通常通过火焰灭菌。然而，经火焰处理的盖玻片在后续操作中容易破裂。70% 乙醇浸泡法可有效灭菌且不会损伤盖玻片。
   3. 盖上盖子，将 24 孔板置于 37 °C CO₂ 培养箱中，待用。
2. 接种细胞
   1. 在含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基（以下简称完全培养基）中，于 37 °C、5% CO₂ 的 CO₂ 培养箱中培养 HeLa 细胞（下文简称细胞）。此处无需添加抗生素。
   2. 当细胞融合度达到约 80% 时，吸....

结果

配备平场复消色差物镜的现代科研级光学显微镜（例如本实验室所使用的显微镜）表现出极小的色差（图2A）。然而，仔细检查同一荧光微珠的多色荧光图像，仍可观察到不同颜色图像之间的位移（图2B）。我们将红色通道定义为无色差，因此红色荧光的中心即为微珠的真实位置。绿色和远红荧光的相对色位移可用从红色荧光中心出发的绿色和蓝色矢量表示（图2C）。每个微珠的成像平面上的色位移通过绿色和蓝色矢量经验性地展示出来（图2D）。对于本显微镜系统，色位移并不均匀，其位移的大小和方向随x和y位置的变化而变化。色位移会显著影响GLIM的准确性，因为远红荧光中心的位移可达50 nm。因此，必须对色位移进行校正。在获取微珠中心位置后，我们.......

讨论

此前，在光学显微镜下对高尔基体蛋白定位的量化主要依赖于该蛋白图像与已知定位的高尔基体标志物图像之间的相关性或重叠程度^15,16,17。所得的相关性或重叠系数反映了待测蛋白在空间上与高尔基体标志物的接近程度。然而，该方法至少存在三个局限性。第一，相关性或重叠系数是非线性的，不能直接反映空间距离。第二，相关性程度严重依赖于显微系统的分辨率，因此两个高尔基体蛋白之间的系数并非系统无关的常数。第三，具有相同轴向定位但沿高尔基池侧向分布不同的两个高尔基体蛋白可能表现出不同的系数。因此，相关性或重叠系数并不能指示高尔基体蛋白的轴向定位。Dejgaard et al. 提出了一种替代方法，即在经诺考达唑处理的高尔基体迷你堆上对cis、trans-高尔基体标志物及目标蛋白进行三重标记，类似于GLIM方法。在每个高尔基体迷你堆中，获取三个信号最强像素点的位置，并将待测蛋白的相对位置计算为距离比值

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
荧光微球。商品名：TetraSpeck beads	Invitrogen	T7279	作为多色微球用于校正显微镜的色差位移
玻璃盖玻片 Φ 12 mm（No. 1.5）	Menzel	CB00120RAC
玻璃盖玻片 Φ 25 mm（No. 1.5）	Menzel
DMEM	Capricon	DMEM-HPA-P50
胰蛋白酶-EDTA
胎牛血清（FBS）	GE Hyclone	SV30160.03
诺考达唑（Nocodazole）	Merck	487928
转染试剂。商品名：Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
转染培养基。商品名：OptiMEM	Invitrogen	31985070
TPST1-EGFP	Addgene	66617	由英国布里斯托大学D. Stephens惠赠
GalT-mCherry			本实验室制备
多聚甲醛（paraformaldehyde）	Merck	1.04005.1000
皂苷（saponin）	Sigma-Aldrich	47036
聚乙烯醇（Mw ~31,000）。商品名：Mowiol-488	CALBIOCHEM	475904
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A9647
小鼠抗人GM130抗体	BD Biosciences	610823	人源GM130的一抗
远红荧光标记的山羊抗小鼠IgG。商品名：Alexa Fluor 647标记的山羊抗小鼠IgG	Invitrogen	A-21235	远红荧光标记的二抗