通过成像荧光质量中心对高尔基体蛋白进行定量定位

摘要

高尔基体驻留蛋白的精确定位对于理解高尔基体的细胞功能至关重要。然而，传统的光学显微镜无法分辨高尔基体的亚结构。本文介绍了一种基于常规显微镜的超分辨率方法，用于定量确定蛋白质在高尔基体内的亚定位。

摘要

高尔基体复合物由一系列平行堆叠的膜性扁囊组成，可进一步分为不同的亚高尔基区，包括顺式高尔基体（cis-Golgi）、中间高尔基体（medial-Golgi）、反式高尔基体（trans-Golgi）以及反式高尔基体网络（trans-Golgi network）。高尔基体的细胞功能取决于其驻留蛋白的特征性分布。传统光学显微镜的空间分辨率过低，无法分辨亚高尔基结构或扁囊。因此，免疫金标电子显微镜是实现高尔基体蛋白亚区定位的首选方法。然而，该技术及仪器超出了大多数细胞生物学实验室的能力范围。本文介绍我们近期开发的一种超分辨率方法——基于质心成像的高尔基体蛋白定位法（GLIM），可用于系统性且定量地定位高尔基体蛋白。GLIM基于标准的荧光标记流程以及常规的宽场或共聚焦显微镜。该方法包括显微系统色位移像差的校准、图像采集以及采集后的分析。待测蛋白的亚高尔基定位以定位商值进行定量表达。GLIM具有四个主要优势：快速、基于常规方法和工具、定位结果为定量数据，并可在高尔基体轴向上实现约30 nm的实际分辨率。本文详细描述了使用GLIM方法定位待测高尔基体蛋白的具体实验流程。

引言

高尔基体在哺乳动物细胞中对蛋白质和脂质的分泌/内吞运输（以下简称货物）起着至关重要的作用^1,2,3在高尔基体中，货物不仅被分选至各种亚细胞区室，还通过多种类型的糖基化进行修饰。哺乳动物的高尔基复合体由许多侧向连接的高尔基堆组成，每个高尔基堆通常包含4至11个紧密相邻且扁平的膜性囊泡，称为潴泡。这些依次堆叠的高尔基潴泡从一端到另一端可进一步分为 顺式，内侧和 转-池。在 转高尔基体堆的-侧 转- 大多数膜囊发育成一种称为管状网状膜网络的结构 转高尔基体网络（TGN）⁴在分泌途径中，源自内质网（ER）的货物在其高尔基堆的入口处进入 顺式侧，然后依次通过内侧和 转-池。货物最终从高尔基体的 转-高基氏体或反式高尔基网络靶向质膜、内体或分泌颗粒。

货物如何通过高尔基体堆栈以及高尔基体如何维持其囊泡结构的分子与细胞机制至今仍不明确，目前仍存在激烈争论¹。该领域的一个难点在于，高尔基体囊泡只能通过电子显微镜（EM）才能分辨，因为光学显微镜的分辨率（约 200 nm）不足以分辨单个高尔基体囊泡（囊泡厚度和间距均< 100 nm）。因此，高尔基体亚结构中驻留蛋白和转运货物的定位通常依赖免疫金标记电镜（immuno-gold EM）来确定。然而，免疫金标记电镜技术难度极高，超出了大多数细胞生物学实验室的能力范围。尽管电子显微镜本身的分辨率可达亚纳米级别，但免疫金标记电镜的实际分辨率受到抗体复合物（一抗加二抗）和金颗粒尺寸的严重限制，分辨率可能劣于 20 nm。此外，电镜图像来源于二维超薄切片，而非高尔基体的三维整体视图，这可能导致错误结论，具体取决于二维切片的相对位置和取向⁵。例如，仅凭一张电镜单层切片无法可靠区分囊泡与小管的正交截面，因为两者均可呈现相同的圆形膜轮廓。近年来兴起的超分辨率显微技术，如三维结构照明显微镜（3D-SIM）、受激辐射损耗显微镜（STED）、光激活定位显微镜（PALM）和随机光学重建显微镜（STORM），使得在光学显微镜下分辨高尔基体亚结构成为可能⁶。然而，这些技术至少存在四个显著缺陷，严重限制了其在细胞生物学中对高尔基体研究的应用：1）当前的超分辨率技术需要昂贵且特殊的硬件配置，大多数细胞生物学实验室难以具备；2）某些超分辨率技术需要特殊的荧光标记方案；3）尽管在最佳条件下这些技术声称可达到 20–110 nm 的空间分辨率，但在实际样品中获得的分辨率往往远低于此；4）与常规显微镜相比，这些超分辨率技术在多色、三维或活细胞成像方面，无论是单独还是组合应用，仍然面临困难。或许最重要的是，免疫金标记电镜和超分辨率显微技术所提供的均为定性而非定量的定位数据。

为了部分解决上述问题，我们近期开发了一种基于常规光学显微镜的方法，称为通过质心成像实现高尔基体蛋白定位（Golgi protein localization by imaging centers of mass, GLIM），可系统性且定量地将高尔基体蛋白定位至相当于免疫胶体金电镜的分辨率水平⁷。该方法中，通过使用诺考达唑（nocodazole）处理培养的哺乳动物细胞，使高尔基体分散为高尔基体迷你堆（Golgi mini-stacks），诺考达唑是一种微管去聚合药物。大量研究表明，诺考达唑诱导形成的高尔基体迷你堆（下文简称高尔基体迷你堆）在结构组织和细胞功能方面均与天然高尔基体堆高度相似^8,9,10,11。通过GLIM方法可获得待测蛋白的定位商值（localization quotient, LQ），该数值表示蛋白在高尔基体内的亚区室定量定位信息。LQ的数值可进行相互比较，目前已建立包含25种以上高尔基体标志蛋白的LQ数据库。

在GLIM中，高尔基体小堆通过内源性或外源性表达的GM130、GalT-mCherry和待测蛋白（x）进行三重标记。GM130和GalT-mCherry分别为cis-和trans-高尔基体标志物^12,13，提供参考点。三色荧光信号——红色（R）、绿色（G）和远红（B）——被人为显示为红、绿、蓝三色。采用荧光质心（以下简称“中心”）以实现亚像素分辨率。高尔基体轴定义为GM130质心指向GalT-mCherry质心的向量。高尔基体小堆被建模为围绕高尔基体轴具有无限旋转对称性的圆柱结构。因此，高尔基体小堆可进一步简化为沿高尔基体轴的一维结构。待测蛋白x的LQ定义为d_x/d₁，其中d_x表示蛋白x质心到GM130质心的距离，d₁表示GalT-mCherry质心到GM130质心的距离。若蛋白x的质心偏离轴线，则使用其在轴上的投影距离进行计算。GLIM中的变量，包括高尔基体轴、轴向角、d_x、d₁、角α和角β，在图1中进行了示意图说明。LQ与高尔基体轴向角无关，因为细胞内高尔基体小堆的取向是随机的。

高尔基体小堆在图像中呈现不均匀性。我们制定了三个标准来为GLIM选择可分析的高尔基体小堆。1）信噪比标准，即每个通道中高尔基体小堆的总强度与背景标准差（SD）之比≥30。该标准旨在确保质心定位的准确性，因为质心定位精度依赖于高尔基体小堆的信噪比。2）轴向角度或距离标准，要求d₁≥70 nm。d₁随高尔基体轴向角度的增大而减小。当轴向角度接近90°（即垂直方向）时，d₁趋近于0，导致小堆无法分辨。d₁≥70 nm可有效排除接近垂直的高尔基体小堆。3）共线性标准，要求|tan α|或|tan β|≤0.3。该标准确保一个小堆的三个中心点足够共线，以满足我们对高尔基体小堆建立的一维模型。所有光学显微镜均存在色差问题，这会严重扭曲红色、绿色和远红荧光中心的相对位置。显微镜系统的色差通过成像110 nm的三标（红、绿、远红荧光）微球进行实验校准。对于每个微球图像，以红色中心定义为微球的真实位置，并通过一阶多项式函数拟合绿色和远红荧光中心的色位移。高尔基体小堆的中心位置需经由该多项式函数校正绿色和远红通道中的色位移。

在标准条件下，通过GLIM技术可沿高尔基体轴向实现约30 nm的分辨率。重要的是，该方法为定量绘制任何高尔基体蛋白的空间分布提供了一种系统性的策略。GLIM可在常规显微镜（如宽场或共聚焦显微镜）上进行，结合常用的荧光标记方案即可完成。成像与数据处理最快可在一小时内完成。利用GLIM，我们已直接证实了分泌性货物蛋白在高尔基体从cis侧向trans侧的渐进式转运过程⁷。

方案

注意：以下是使用GLIM逐步测定HeLa细胞中高尔基体定位酶酪氨酸蛋白硫酸转移酶1（TPST1）的EGFP标记蛋白的LQ值的实验方案。

1. 荧光标记高尔基体迷你堆的制备

1. 准备玻璃盖玻片
   1. 在生物安全柜中，将 0.3 mL 无菌 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）分装至 24 孔板的一个孔中。
   2. 用蘸有 70% 乙醇的软纸巾轻轻擦拭一片 Φ 12 mm No.1.5 玻璃盖玻片，以去除其表面的杂质。使用尖头镊子将盖玻片短暂浸泡于 70% 乙醇中，然后转移至 24 孔板中，并使其沉入含有无菌 DMEM 的孔底。
      注意：玻璃盖玻片通常通过火焰灭菌。然而，经火焰处理的盖玻片在后续操作中容易破裂。70% 乙醇浸泡法可有效灭菌且不会损伤盖玻片。
   3. 盖上盖子，将 24 孔板置于 37 °C CO₂ 培养箱中，待用。
2. 接种细胞
   1. 在含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基（以下简称完全培养基）中，于 37 °C、5% CO₂ 的 CO₂ 培养箱中培养 HeLa 细胞（下文简称细胞）。此处无需添加抗生素。
   2. 当细胞融合度达到约 80% 时，吸除培养基。向培养瓶中加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C CO₂ 培养箱中孵育 2 分钟。加入 1 mL 完全培养基，用移液器轻柔吹打，使细胞从瓶壁脱落。
   3. 将脱落的细胞转移至无菌离心管中，以 500 × g 离心 2 分钟以收集细胞沉淀。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL 完全培养基中。
   4. 吸除含灭菌玻璃盖玻片的 24 孔板孔中的培养基，向孔中接种约 1 × 10⁵ 个细胞。用完全培养基补足孔内液体体积至 0.5 mL。置于 37 °C、5% CO₂ 的 CO₂ 培养箱中孵育，培养至细胞融合度约 80%。
3. 转染细胞
   注意：细胞铺展良好有利于成像分散的高尔基体小堆结构。
   1. 使用转染试剂，按照制造商提供的方案，将约 80% 融合度的细胞与 80 ng GalT-mCherry⁷ 和 320 ng TPST1-EGFP（见材料表）质粒 DNA 共转染。于 37 °C CO₂ 培养箱中孵育。转染 4–6 小时后更换培养基。约 12 小时后细胞即可用于后续实验。
4. 诺考达唑处理以生成高尔基体小堆结构
   1. 通过将 10 mg 诺考达唑粉末溶解于 1 mL 二甲基亚砜中，配制 33 mM 诺考达唑储存液。分装储存液，长期保存于 -20 °C。
   2. 将 1 µL 诺考达唑储存液（33 mM）加入 1 mL 37 °C 的完全培养基中（终浓度为 33 µM）。高速离心以去除不溶性颗粒。
   3. 吸除孔中培养基，加入 0.5 mL 含 33 µM 诺考达唑的完全培养基。于 37 °C CO₂ 培养箱中孵育 3 小时。随后进行免疫荧光标记（第 1.5 节）。
5. 免疫荧光标记
   注意：操作过程中需避光，以防止 GalT-mCherry 和 TPST1-EGFP 荧光淬灭。
   1. 准备免疫荧光标记试剂
      1. 配制 4% 多聚甲醛溶液：将 4%（w/v）多聚甲醛粉末溶于热的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）中，并通过 0.45 µm 滤膜过滤。溶液可于 -20 °C 保存。
         注意：多聚甲醛具有毒性、致癌性，并可引起皮肤刺激。操作时应穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
      2. 配制荧光稀释缓冲液（FDB）：将 5%（v/v）FBS 和 2%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）溶于 1× PBS 中。通过 0.45 µm 滤膜过滤后，于 -20 °C 保存。
      3. 将 5.35 g NH₄Cl 粉末溶于 1 L 水中，配制 100 mM NH₄Cl 溶液，并于室温保存。
      4. 将 10%（w/v）皂苷粉末溶于水中，配制 10% 皂苷溶液， 分装后于 -20 °C 保存。
   2. 固定
      1. 用 0.5 mL 1× PBS 溶液冲洗孔一次，加入 0.5 mL 4% 多聚甲醛溶液，室温孵育 20 分钟。用 0.5 mL 1× PBS 冲洗两次，再用 0.5 mL 100 mM NH₄Cl 冲洗两次，最后再用 0.5 mL 1× PBS 冲洗两次。细胞可在 4 °C 避光条件下于 1× PBS 中保存过夜。
   3. 荧光标记
      1. 将 1 µL 小鼠抗 GM130 一抗稀释于含 0.1% 皂苷的 500 µL FDB 中。将 24 孔板盖子翻转，在盖子内表面滴加 10 µL 一抗混合液。
      2. 使用尖头镊子取出并转移玻璃盖玻片至抗体液滴上，确保细胞面与液滴接触。室温孵育 1 小时。
         注意：可将带有盖玻片的盖子置于避光的湿盒或密封塑料袋中。
      3. 使用尖头镊子取出盖玻片，转移回 24 孔板中，细胞面朝上，在 0.5 mL 1× PBS 中冲洗三次，总时间不少于 30 分钟。无需振荡。
      4. 将 1 µL 远红外荧光染料标记的山羊抗小鼠 IgG（二抗）稀释于含 0.1% 皂苷的 500 µL FDB 中。
      5. 清洗并擦净 24 孔板盖子的反面，在其上滴加 10 µL 远红外二抗混合液。重复步骤 1.5.3.2 至 1.5.3.3。
   4. 封片
      1. 通过混合 1 g 甘油、2.2 g 聚乙烯醇（分子量 ~ 31,000 Da）、1.2 mL 1 M Tris（pH 8）和 8.8 mL H₂O 配制封片剂。在 60 °C 水浴中不时涡旋振荡，直至完全溶解。溶液于 -20 °C 保存。
      2. 解冻封片剂，取 10 µL 滴于载玻片上。将盖玻片（细胞面朝下）覆盖于封片剂液滴上。将载玻片于 37 °C 孵育 30 分钟，或室温孵育 1 小时，使封片剂固化。用无色指甲油封固盖玻片边缘，并将载玻片于 -20 °C 保存。

2. 用于色偏校正的荧光微球制备

1. 盖玻片清洗
   1. 将一片 25 mm 的 1.5 号玻璃盖玻片小心放置在塑料架上。
   2. 将带有盖玻片的塑料架转移至装有 300 mL 1 M NaOH 的 400 mL 烧杯中，在浴式超声仪（35 瓦）中超声处理 15 分钟。随后在装有 300 mL 去离子水的 400 mL 烧杯中短暂冲洗塑料架。再将塑料架转移至装有 300 mL 99% 乙醇的 400 mL 烧杯中，在浴式超声仪中超声处理 15 分钟。最后在装有 300 mL 去离子水的 400 mL 烧杯中短暂冲洗塑料架。
   3. 重复步骤 2.1.2 两次。
   4. 在装有 300 mL 去离子水的 400 mL 烧杯中，将带有盖玻片的塑料架浸泡冲洗 10 分钟，重复此步骤两次。将塑料架转移至 60 °C 烘箱中，干燥盖玻片 1 小时。将干燥后的盖玻片储存于无尘的培养皿中。
2. 在玻璃盖玻片上固定荧光微球
   1. 将 110 nm 多色荧光微球用含 0.1 µg/µL BSA 的 1× PBS 缓冲液稀释 80 倍。短暂涡旋混匀以分散微球聚集体。使用移液器吸头将 60 µL 稀释后的微球溶液均匀涂布于已清洗的 Φ 25 mm 1.5 号玻璃盖玻片（见步骤 2.1）上。在避光条件下，将盖玻片置于连接真空泵的干燥器中干燥，随后将盖玻片用 50 µL 封片剂封固于载玻片上（见步骤 1.5.4.2）。

3. 图像采集

注意：GLIM 需要高信噪比（SNR）的图像，以实现高精度的质心计算。图像可通过常规显微镜获取，例如激光扫描共聚焦显微镜、转盘共聚焦显微镜或宽场显微镜。可使用配备平复消色差物镜和低噪声图像传感器（如电荷耦合器件（CCD）或科学级互补金属氧化物半导体（sCMOS））的宽场显微镜。图像传感器的参数应进行调整，以确保低读出噪声和高动态范围。显微镜必须配备适用于绿色、mCherry 和远红荧光染料的最佳荧光滤光片组合，且荧光串扰必须可忽略不计。理想情况下，成像系统应在 x、y 和 z 轴方向达到奈奎斯特采样率，这通常要求体素的 x、y 和 z 尺寸分别小于 100、100 和 200 nm。体素的 x 和 y 尺寸始终相等，称为像素尺寸（pixel_size）。像素尺寸可通过将相机传感器尺寸除以系统放大倍数计算得出。

1. 成像多色微珠
   1. 在每次成像会话开始和结束时，分别在绿色、红色和远红通道中对多色微珠进行成像。
      注意：此处图像是通过一台常规的宽场落射荧光显微镜（倒置式）获取的，该显微镜配备100倍NA 1.4平场复消色差物镜、电动载物台、200瓦金属卤化物光源和16位科学级CMOS相机。绿色通道滤光镜组的激发滤光片（带通）、二向色镜（长通）和发射滤光片（带通）的波长分别为465–495 nm、505 nm和515–555 nm；红色通道滤光镜组的对应波长分别为528–553 nm、565 nm和578 –633 nm；远红通道滤光镜组的对应波长分别为590–650 nm、660 nm和663–738 nm。采集过程中，体素在x、y和z轴上的尺寸分别为64 nm、64 nm和200 nm。
   2. 选择一个微珠密度适中的视野。
   3. 在绿色、红色和远红通道（分别记为channel_G、channel_R、channel_B）中采集三维图像堆栈。在最佳焦平面的上方和下方各采集3个层面（每堆栈共7个层面）。将三个堆栈分别保存为三个TIFF文件。
      注意：各通道的曝光时间根据经验确定，以最大化动态范围、避免像素饱和并最小化光漂白。其他参数，如滤光片以及体素在x、y和z方向的尺寸，均按上述方式选定。
2. 成像高尔基体迷你堆
   1. 使用转染了TPST1-EGFP和GalT-mCherry并完成荧光标记（第1.5节）的载玻片，寻找表达TPST1-EGFP且GalT-mCherry表达水平为低或中等的细胞。按照步骤3.1.3所述方法采集三维图像堆栈。

4. 图像分析

1. 获取荧光微珠的中心位置
   1. 在 ImageJ 中打开一组由三个 TIFF 文件组成的微珠图像（文件>图像>开放。
   2. 在最佳对焦层面的通道中，取相邻3个层面的平均值_R 通过图像>堆叠>Z 投影。输入部分编号 "开始切片" 和 "停止切片"，以及可选方案中的 "投影类型"，选择 "平均强度".
   3. 使用图像中不含微珠的区域绘制感兴趣区域（ROIs） "多边形选择"在 "分析>设置测量参数"，仅检查 "平均灰度值" 和 "标准差"然后执行 "分析>测量" 以获取 ROI 的平均值和标准差。
   4. 计算背景强度为 "均值+6×标准差"_. 减去具有相应背景强度值的图像 "过程>数学>减去"，输入与此通道对应的背景强度值。
   5. 重复步骤 4.1.2 至 4.1.4，针对通道进行操作_G 和通道_B 使用相同的起始和终止切片以及相同的背景感兴趣区域（ROI）来获取图像堆栈。注意，步骤 4.1.3 中使用的 ROI 可复制到通道_G 和通道_B 图像_.
   6. 合并三张已减去背景的图像（图像>颜色>合并通道）通过选择通道_R 红色通道_G 绿色和通道_B 呈蓝色。将获得由三个通道组成的单个复合图像。
   7. 启动 ROI 管理器（分析）>工具>ROI 管理器）。围绕单个微珠绘制一个方形感兴趣区域（ROI），确保每个 ROI 内仅包含一个微珠。通过按下将 ROI 添加到 ROI 管理器中 "t" 在键盘上重复此过程，并尽可能添加多个感兴趣区域（ROIs）。
   8. 在 "分析>设置测量参数"，仅检查 "质心".
   9. 选择通道_R，在 ROI Manager 中，点击 "测量" 以获取中心点；将显示两列，分别对应感兴趣区域（ROI）中心点的 x 和 y 坐标 "结果" 窗口。将两列数据复制并粘贴到电子表格中。
   10. 重复步骤 4.1.9 以处理通道_G 和通道_B.
   11. 将中心坐标的数值按以下顺序排列在单个电子表格中：x_R，y_R，x_G，y_G，x_B和 y_B. 将电子表格保存为 ".csv" 格式化为 "beads.csv"文件名中不要留空格。
2. 选择并测量高尔基体小堆
   1. 安装两个宏（附在 补充材料) 在 ImageJ 中， "大高尔基体 ROI 检查" 和 "宏输出 3 通道数据" 由插件>安装"清除 ROI 管理器和结果窗口。
   2. 打开一组由三个TIFF文件组成的高尔基体小堆栈图像（文件>图像>开放。
   3. 重复步骤 4.1.2 - 4.1.5，并保存三幅背景扣除后的图像以供后续使用。记录该通道的背景标准差（SD）_R，通道_G 和通道_B 如SD所示_R，SD_G 和 SD_B，分别用于后续使用。
   4. 复制步骤 4.2.3 中生成的三幅已减去背景的图像（Ctrl+Shift+D）。
   5. 在 "过程>图像计算器"首先加入减去背景的通道_G 引导_R 图像。将得到的图像添加到已减去背景的通道中_B 图像。将所得图像，加入 "图像>调节>阈值"，选择 "设置" 输入 "1" 作为 "最低阈值水平". 按压后 "应用"得到一张黑白二值图像。
   6. 在 "分析>分析颗粒"，输入尺寸范围以 "大小（像素²）". 输入 "50-无穷大"检查 "排除边缘区域" 和 "添加到管理器"包含高尔基体小堆的 ROI 现已添加至 ROI 管理器。
      注意：必须通过实验确定合适的尺寸范围，以排除通常较小的噪声信号。
   7. 合并三张已减去背景的图像（图像>颜色>合并通道）通过在步骤 4.2.3 中选择通道_R 红色通道_G 绿色和通道_B 呈蓝色。生成由三个通道组成的单个复合图像。
   8. 运行宏 "大高尔基体 ROI 检查" 通过选择 "插件> 大高尔基体 ROI 检查"在交互式对话框中，目视检查每个ROI，决定保留或删除。选择在所有三个通道中均包含单个对象的ROI。
      注意：运行此工具后，被拒绝的 ROI 将从 ROI 管理器中移除。
   9. 仅检查 "面积", "平均灰度值" 和 "质心" 在 "分析>设置测量参数". 通过启动宏工具获取数据 "宏输出 3 通道数据" （插件）> 宏输出 3 通道数据
      注意：通道中 ROI 的面积、平均强度及中心点（x 和 y）_R，通道_G 和通道_B 显示在 "结果" 窗。
   10. 将中心点的 x 和 y 坐标复制到电子表格中，并按以下顺序排列：x_R，y_R，x_G，y_G，x_B和 y_B. 将电子表格另存为 ".csv" 文件（微栈.csv）。文件名中不得包含空格。随后进行中心的色偏校正（第4.3节）和LQ计算（第4.4节）。
3. 中心的色位移校正
   1. 安装 Matlab 编译器运行时（MCR）。
   2. 在专用工作文件夹中安装以下文件：my_train.exe 和 my_test.exe。复制并粘贴 "beads.csv" 和 "微堆叠.csv" 同一文件夹中的文件
   3. 启动 "命令提示符" 的 Windows 并通过输入以下命令转到工作文件夹 " cd 工作文件夹路径".
   4. 使用微珠中心生成色位移校准文件。输入以下命令 "my_train.exe 珠粒.csv 校准.mat 1"一个名为 "校准.mat" 在工作文件夹中创建。忽略生成的其他文件。
   5. 通过输入以下命令来校正高尔基体迷你堆中心的色差位移 "my_test.exe 微栈.csv 校正后的微型堆叠.csv 校准.mat 1".
      注意：一个名为 "校正后的微型堆叠.csv" 在工作文件夹中创建。它包含经过色差校正的中心坐标，按 x 顺序排列_G，y_G，x_B 和 y_B忽略其他生成的文件。请注意，红色通道被定义为无色差，因此 x_R 和 y_R 与原始数据相同。
4. LQ值的计算
   1. 启动数据分析软件，按以下顺序复制并粘贴来自步骤 4.2.3 的平均灰度值、面积、背景标准差（置于第 1 行），以及高尔基体迷你堆在通道中的色位移校正后的 x 和 y 坐标_R 将数据作为 A 到 E 列输入工作表中。同样，将通道的相应数据进行转移_G 和通道_B 分别加入 F 至 J 列和 K 至 O 列。
   2. 添加八列新列 P 至 W，命名为 "通道R的积分强度", "通道G的积分强度", "通道B的积分强度"，d1，dx，ABS(tan a)，ABS(tan b) 和 LQ。
      1. 右键单击相应列的顶部，然后选择 "设置列值" 计算每一列的数值。对于 P 列，输入 "Col(A)Col(B)"；对于 Q 列，输入 "Col(F)Col(G)"；对于R列，输入 "Col(K)Col(L)"；对于S列，输入 "pixel_size*Distance(列(D), 列(E), 列(N), 列(O))" 其中 "像素大小" 是像素的大小，单位为 nm；对于 T 列，输入 "pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2 + Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2 - Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))))"；对于 U 列，输入 "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2 + Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2 - Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2 * Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O)) * Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))))))"；对于第五列，输入 "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2 + Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2 - Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2) / (2 * Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J)) * Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))))))"；对于W列，输入 "Col(T)/Col(S)".
   3. 根据所述的三个标准对高尔基体小堆进行筛选 引言.
      1. 在数据分析软件中，前往 "工作表>工作表查询" 并选择列变量以 "如果" 测试。为各列分配以下别名：I1、I2、I3、d1、A 和 B "通道R的积分强度", "通道G的积分强度", "通道B的积分强度"，d1，ABS(tan a) 和 ABS(tan b)，分别。在 "如果条件" 盒子，输入 "I1>=30*cell(1,3) 与 I2>=30*cell(1,8) 且 I3>=30*cell(1,13) 且 d1>=70 且 (A<=0.3 或 B<=0.3)".
      2. 选择 "提取到新工作表"，点击 "应用"可分析的高尔基体小堆的 A 至 W 列被提取到一个新的工作表中。
   4. 在新工作表中，右键单击 W 列顶部，选择 "柱状图统计>打开对话框"检查 "N 总数", "平均值", "平均值的标准误", "直方图"随后展示LQs的统计分析结果。

结果

配备平场复消色差物镜的现代科研级光学显微镜（例如本实验室所使用的显微镜）表现出极小的色差（图2A）。然而，仔细检查同一荧光微珠的多色荧光图像，仍可观察到不同颜色图像之间的位移（图2B）。我们将红色通道定义为无色差，因此红色荧光的中心即为微珠的真实位置。绿色和远红荧光的相对色位移可用从红色荧光中心出发的绿色和蓝色矢量表示（图2C）。每个微珠的成像平面上的色位移通过绿色和蓝色矢量经验性地展示出来（图2D）。对于本显微镜系统，色位移并不均匀，其位移的大小和方向随x和y位置的变化而变化。色位移会显著影响GLIM的准确性，因为远红荧光中心的位移可达50 nm。因此，必须对色位移进行校正。在获取微珠中心位置后，我们...

讨论

此前，在光学显微镜下对高尔基体蛋白定位的量化主要依赖于该蛋白图像与已知定位的高尔基体标志物图像之间的相关性或重叠程度^15,16,17。所得的相关性或重叠系数反映了待测蛋白在空间上与高尔基体标志物的接近程度。然而，该方法至少存在三个局限性。第一，相关性或重叠系数是非线性的，不能直接反映空间距离。第二，相关性程度严重依赖于显微系统的分辨率，因此两个高尔基体蛋白之间的系数并非系统无关的常数。第三，具有相同轴向定位但沿高尔基池侧向分布不同的两个高尔基体蛋白可能表现出不同的系数。因此，相关性或重叠系数并不能指示高尔基体蛋白的轴向定位。Dejgaard et al. 提出了一种替代方法，即在经诺考达唑处理的高尔基体迷你堆上对cis、trans-高尔基体标志物及目标蛋白进行三重标记，类似于GLIM方法。在每个高尔基体迷你堆中，获取三个信号最强像素点的位置，并将待测蛋白的相对位置计算为距离比值

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
荧光微球。商品名：TetraSpeck beads	Invitrogen	T7279	作为多色微球用于校正显微镜的色差位移
玻璃盖玻片 Φ 12 mm（No. 1.5）	Menzel	CB00120RAC
玻璃盖玻片 Φ 25 mm（No. 1.5）	Menzel
DMEM	Capricon	DMEM-HPA-P50
胰蛋白酶-EDTA
胎牛血清（FBS）	GE Hyclone	SV30160.03
诺考达唑（Nocodazole）	Merck	487928
转染试剂。商品名：Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
转染培养基。商品名：OptiMEM	Invitrogen	31985070
TPST1-EGFP	Addgene	66617	由英国布里斯托大学D. Stephens惠赠
GalT-mCherry			本实验室制备
多聚甲醛（paraformaldehyde）	Merck	1.04005.1000
皂苷（saponin）	Sigma-Aldrich	47036
聚乙烯醇（Mw ~31,000）。商品名：Mowiol-488	CALBIOCHEM	475904
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A9647
小鼠抗人GM130抗体	BD Biosciences	610823	人源GM130的一抗
远红荧光标记的山羊抗小鼠IgG。商品名：Alexa Fluor 647标记的山羊抗小鼠IgG	Invitrogen	A-21235	远红荧光标记的二抗