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方法文章

使用 madSTORM 对 T 细胞进行高度多重化的超分辨率成像

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DOI：

10.3791/55997

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2017年6月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cellular & Molecular Biology, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Laboratory of Single Molecule Biophysics, National Heart, Lung, and Blood, Institute, National Institutes of Health

本文内容

摘要

我们展示了一种利用荧光标记抗体的连续结合与洗脱，以单分子精度对异质纳米结构内多种分子进行成像的方法。

摘要

使用单分子定位显微镜对细胞内异质性结构进行成像，一直受到定位精度不足和多重成像能力有限的限制。通过使用荧光纳米金刚石基准标记物，我们描述了在单分子定位显微镜中实现高精度所必需的漂移校正与图像对齐步骤。此外，本文介绍了一种新的多重成像策略——madSTORM，该方法通过荧光抗体的顺序结合与洗脱，实现对同一细胞内多种分子的同时检测。我们以活化的T细胞为例，展示了madSTORM在可视化膜结合多蛋白结构——T细胞受体微簇体中不同组分空间分布的应用。同时，还讨论了madSTORM作为可视化多蛋白结构通用工具的广泛应用前景。

引言

已开发出多种超分辨率显微技术，以突破光学显微镜的衍射极限（约200 nm）。其中一类技术称为单分子定位显微技术（SMLM），包括光激活定位显微技术（PALM）和随机光学重建显微技术（STORM）。SMLM技术的共同点在于使用可在“开启”（荧光）状态和“关闭”（暗态/光开关）状态之间切换的荧光染料，从而实现对单个分子荧光信号的逐次定位1,2,3。

由于与市售染料和显微镜的兼容性良好，直接随机光学重建显微技术（dSTORM）已成为一种被广泛采用的单分子定位显微术（SMLM）4。dSTORM通常可实现约10 nm的定位精度，该精度定义为计算衍射极限点扩散函数（PSF）中心位置的不确定性。然而，尽管定位算法估算出的精度较高5,6,7，单个分子实际位置的准确测定仍受到多种因素的限制。首先，在图像采集过程中显微镜载物台的机械移动会显著增加定位精度的不确定性。由于SMLM图像是通过数千帧时间序列图像获得的，载物台在纳米尺度上的移动会严重影响最终超分辨率图像的精度8。为校正图像采集过程中的载物台移动，通常通过基于回归拟合图像自身分箱后的定位结果（互相关法）或来自基准标记物的连续定位结果（基准校正法）来估计载物台漂移1,9。然而，这些方法需要针对每组图像堆栈优化多个参数，且无法校正短时间尺度的载物台移动，例如机械振动。金纳米颗粒和多色荧光微球已被用作SMLM中的基准标记物，但它们光稳定性较差，经漂移校正后所达到的精度明显低于madSTORM中使用的氮空位中心荧光纳米金刚石（FNDs）10。

除了衍射极限外，光学显微镜还受到光谱范围的进一步限制。要同时可视化多个靶标，需要使用光谱不重叠的荧光探针，这通常将基于荧光的光学显微镜限制在6种颜色以内，而单分子定位显微镜（SMLM）则限制在2至3种颜色4,11,12。此外，非线性色差会导致多色图像错位，必须使用多色基准标记物进行复杂的图像对齐处理8,13。为了克服这些限制，以往的研究采用重复光漂白或化学淬灭依次结合的荧光染料的方法来成像多个靶标14,15,16,17,18,19。尽管这些方法可以突破显微镜的光谱限制，但已知荧光漂白是一种具有毒性的过程20，长时间的漂白或淬灭可能引起非预期的副作用，例如交联结构的丢失。此外，荧光探针的累积可能导致样品中结合位点的空间位阻，阻碍大规模多重检测以及表位的有效靶向。为避免此类空间干扰，最近一项研究利用自由扩散蛋白片段的随机交换实现了多重成像21。虽然该方法能够实现细胞结构的高密度标记，但需要复杂的生物化学制备以分离肽段，无法精确定位单个分子位置，且难以利用商业化的探针实现大规模多重检测。本文提供了一项详细的视频实验方案，描述了用于多重、抗体尺寸受限的dSTORM（madSTORM）成像中荧光抗体的顺序结合与洗脱过程，并介绍了使用荧光纳米金刚石实现精确漂移校正与图像对齐的方法。

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方案

警告：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。本实验方案中使用的多种化学试剂具有毒性且可能致癌。进行实验时，请务必采取所有适当的安全措施，包括使用工程控制设备（通风橱、手套箱）和个人防护装备（护目镜、手套、实验服、长裤、封闭式鞋履）。

1. 活化T细胞的多重成像

  1. 使用 Alexa 647 抗体标记试剂盒将抗体与 Alexa-647（A647）染料直接偶联。按照试剂盒制造商提供的标记方案进行操作。
    注意：建议在此步骤之前将抗体溶液在1×PBS中透析，以提高抗体标记效率。
  2. 将带有自旋标签的抗体在20,800 rcf下离心5分钟，收集上清液以去除聚集的抗体。
  3. 荧光纳米金刚石涂层盖玻片的制备
    1. 将8孔盖玻片培养皿（见试剂/材料列表）用250 μL 0.01%多聚-L-赖氨酸（PLL）溶液在室温下孵育15分钟，吸除液体后于65 °C烘干30分钟。（烘干前无需洗涤。）
    2. 在1×PBS中配制100 nm荧光纳米金刚石（FNDs）的稀释液。在步骤1.2.7中测试不同稀释度，以确保每个视野中均有足够数量的FNDs可见（我们采用制造商提供的FNDs按1:200比例稀释）。
    3. 将稀释后的FNDs涡旋1分钟。
    4. 将FND上清液在高功率条件下超声处理30秒。
    5. 将超声处理后的FND上清液加入多聚赖氨酸（PLL）包被的8孔盖玻片腔室中，室温孵育30分钟。
    6. 用1×PBS洗涤5次，并在TIRF显微镜下使用647 nm激光激发观察FND包被的腔室。理想情况下，鉴于步骤1.2.2中FND的适当稀释度，在视野中应可见4–10个单独的FND（我们使用100倍物镜，相机像素设置为256 × 256，对应视野为61 × 61 μm），且成像视野的每个象限中至少有一个FND。如果FND呈现聚集状态（即 信号显著高于周围荧光纳米金刚石（FND）且点扩散函数大于200 nm的FND，以6,800 rcf离心1分钟，使用FND上清液重复包被步骤。
    7. 每孔加入250 μl抗CD3抗体（10 μg/mL），37 °C孵育1小时，或4 °C过夜。
    8. 吸除溶液，加入1×PBS孵育30秒。重复此洗涤步骤5次（洗涤5×）。
  4. Jurkat T细胞的激活
    1. 将1 ml Jurkat T细胞在800 rcf下离心6 min，弃上清后重悬于300 μl 1× HBS溶液中。Jurkat T细胞浓度宜为0.5–1.0 × 106 细胞/ml，离心前。 1x HBS 溶液由含 1% 牛血清白蛋白的 HEPES 缓冲盐溶液组成，具体如前所述22.
    2. 每孔加入150 μL 1x HBS溶液，37 °C孵育15分钟。
    3. 向每个孔中加入50 μL重悬的Jurkat T细胞，于37 °C孵育3分钟。
    4. 向每个孔中加入 300 μL 4% 多聚甲醛，在 37 °C 下孵育 30 分钟。
    5. 用1×PBS洗涤3次。
    6. 加入250 μL 0.1% Triton-X溶液，室温孵育5 min，以透化细胞。
    7. 用1×PBS洗涤3次。
    8. 每孔加入250 μL含1%鱼明胶的1x PBS溶液，室温孵育30分钟。
    9. 用1×PBS洗涤3次。
  5. 使用madSTORM成像活化的Jurkat T细胞
    1. 向固定细胞中加入200 μL浓度为0.1–0.5 μg/mL的标记抗体，室温孵育1小时。
    2. 用1×PBS洗涤5次。
    3. 加入1 ml STORM缓冲液，并用玻璃盖玻片覆盖反应腔，以减少与空气接触。STORM缓冲液的配方此前已有描述。10建议每次成像时配制新鲜的STORM缓冲液，并在20,800 rcf下离心2分钟以去除沉淀物。
    4. 使用647 nm激光在TIRF模式下以低功率定位视野中至少含有3个FND的染色细胞。为便于定位FND，可同时使用568 nm激光激发以增强FND信号的亮度。                        
      注意：如第2.1节所述，平均 fiducial 校正的性能随着更多FNDs的加入而提升。
    5. 增加647 nm激光功率并采集图像。我们通常在200 ms曝光、125 mW 647 nm激光、100倍TIRF物镜（1.49 NA）、100倍EM增益（16位模式下5 MHz，转换增益为1）的条件下采集10,000帧图像。我们成像系统的详细设置此前已有描述。10.
    6. 用1×TBS洗涤5次。
    7. 加入1 ml洗脱缓冲液（3.5 M MgCl₂）2，20 mM PIPES，0.1% Tween-20，pH 6.5）中，室温孵育1分钟。
    8. 重复洗脱3次。（每种抗体所需的精确洗脱条件及去除信号所需的洗脱次数必须根据所用抗体进行验证）。
    9. 用1×TBS洗涤3次，加入1 ml 1×PBS。
    10. 使用647 nm激光（高功率，125 mW）与405 nm激光（2–5 mW）进行光漂白，以激活处于暗态的A647染料。等待直至未洗脱抗体的残余信号完全被光漂白，通常需要2–5秒的激光照射。建议在洗脱和光漂白后，采用1.3.5节中的STORM设置采集样品图像（约100帧），以确认信号已完全去除。
      我们通常使用此方法去除 99.8% 的信号。建议在将每种抗体用于 madSTORM 之前，先按照之前所示方法测试其洗脱效率10.
    11. 加入250 μL 4%多聚甲醛，孵育15分钟。此步骤可防止细胞内固定分子发生逆转交联。
    12. 用1×PBS洗涤3次。
    13. 重复步骤 1.3.1–1.3.12，以实现多个靶标的连续标记。 图1 显示了使用madSTORM技术获取的活化Jurkat T细胞中多个分子的复合图像。

2. 多重图像堆栈的漂移校正与对齐

  1. madSTORM 图像堆栈的漂移校正
    1. 使用 ImageJ 打开图像。建议在导入 ImageJ 前将图像文件转换为 TIFF 格式。使用矩形选区（ROI）选择单个荧光纳米金刚石（FND）。播放时间序列，确保该 FND 在图像堆栈的每一帧中均可见。利用 ThunderSTORM 插件中的“运行分析”（Run Analysis）功能对 FND 进行定位。对于 2.1.5 节所述的平均基准校正方法，关键在于每一图像帧中仅对单个 FND 进行定位即 已鉴定峰的数量应等于帧数。
    2. 如果在每一帧中均无法识别出FND，则需选择另一个FND。若单帧中出现多个峰，则移除与先前各峰偏离最大的峰。
    3. 对图像堆栈中的每个FND重复步骤2.1.2。请注意，某些FND不应纳入漂移校正过程，以便作为评估漂移校正精度的独立参照，具体操作如步骤2.1.7所述。
    4. 为实现更快但精度较低的漂移校正，可使用 ThunderSTORM 中包含的互相关或标志点校正算法对 FND 图像进行校正。通常，互相关校正的参数设置为 100 个 bins、5 倍放大倍数和 0.1 的轨迹平滑因子；标志点校正的参数设置为最大距离 10、最小标志点可见性比率 0.1 和轨迹平滑因子 0.01。互相关和标志点校正将生成一个校正文件，可用于其他 FND 图像以测试漂移校正的精度。
    5. 对于更严格、更精确的漂移校正，请使用先前所述的平均标志点校正（AFC）算法10该过程无需参数优化，且定位精度高于SMLM定位算法的预测值。然而，平均漂移校正要求至少使用4个荧光纳米珠（FNDs），并且FNDs需在图像堆栈的每一帧中均能被定位。AFC漂移校正的性能随着FNDs数量的增加而提升，因为大量被定位的FNDs可降低某一帧中异常峰值带来的畸变影响。
    6. 使用 ThunderSTORM 对图像堆栈中的所有点扩散函数进行定位，方法如前所述10我们通常采用的参数设置为：像素尺寸100 nm，每A/D计数的光电子数4.28，基底水平A/D计数100，EM增益100，点扩散函数（PSF）：积分高斯定位，拟合半径5像素，最大似然拟合方法，初始sigma值1.3像素。
    7. 将从FNDs获得的漂移校正因子应用于整个图像堆栈的定位数据。目视检查最终图像，以确保漂移校正正确无误。图2）。应使用未参与AFC过程的FND对所得的漂移校正因子进行独立测试，以评估漂移校正的精确程度。经漂移校正后的独立FND的精度应接近于步骤2.1.6中所采用的定位算法计算出的平均精度/不确定度值。
    8. 对依次标记的抗体的 madSTORM 图像堆栈重复执行步骤 2.1.1–2.1.7。需注意，在每组 madSTORM 图像堆栈中定位同一组 FNDs 对后续的图像对齐步骤至关重要。
  2. madSTORM 图像的配准
    1. 计算每幅madSTORM图像中漂移校正后FND的质心位置。具体方法为：先求出每个定位FND在x轴和y轴方向的平均位置，再对每幅madSTORM图像中所有FND的平均x轴和y轴位置进行平均。该步骤的详细算法此前已有描述10使用荧光纳米金刚石（FND）标记物的质心位置对连续的madSTORM图像进行对齐。为执行对齐，通过从第二幅madSTORM图像中FND的质心位置减去第一幅图像中的对应位置，计算两幅定位madSTORM图像之间的偏移量。然后将该偏移量从第二幅madSTORM图像的所有定位点坐标中减去。
    2. 我们建议使用第一张 madSTORM 图像作为参考图像，并在第一张与第三张、第一张与第四张之间重复此配准步骤， 等等。 通过测量未参与配准过程的荧光纳米金刚石（FNDs）之间的偏移量来测试配准精度。较大的偏移量可能表明在计算连续madSTORM图像的质心位置时使用了不同的FNDs集合。
    3. 若是如此，应使用同一组FND重复步骤2.2.1–2.2.2以完成校准。
      注意：提供了用于 AFC 漂移校正和对准流程的自定义代码。

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结果

采用连续洗脱与染色方法，对活化的Jurkat T细胞中的微簇及其他结构生成多重madSTORM图像（图1，需核对图像对齐情况）。每幅伪彩图像代表一轮madSTORM成像，其数据采集步骤为1.1.1至1.3.13。如前所述10，应持续监测视野中是否存在前一轮未完全洗脱抗体的残余信号，以避免多重靶标之间的信号串扰。此外，由于不同抗体的洗脱效率存在差异，连续多重成像的顺序应按照抗体洗脱效果从优到劣进行排列，以最大程度减少表位因空间位阻而被封闭。最终的madSTORM图像（图1）已利用第2节所述的AFC和FND定位标记，对漂移和图像对齐进行了校正。

使用FND对来自单个独立FND（图2A，2B）和活化的...

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讨论

madSTORM 中的顺序多重化、漂移校正和图像对齐步骤可实现对细胞内异质结构的精确、高通量可视化10。此外，madSTORM 避免了多色 STORM 所存在的局限性，例如色差以及非远红染料的光切换/发射性能不佳等问题9,12。由于洗脱步骤显著降低了依次结合的抗体带来的空间位阻干扰，madSTORM 可用于对细胞样本进行多轮重复成像，突破以往技术仅能实现 6 至 10 轮多重成像的限制9,15,21。此外，顺序洗脱与染色步骤不仅限于单分子定位显微镜（SMLM），也可应用于共聚焦显微镜、结构光照明显微镜（SIM）和双光子显微镜等其他成像技术。然而，由于 madSTORM 是一种顺序免疫染色技术，其应用受限于针对各目标分子的可用抗体。每种抗体均需经过严格验证，以确保其特异性、标记效率及可洗脱性...

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

我们感谢吴旭峰提供STORM显微镜的使用权限。本研究得到了美国国家癌症研究所（NCI）癌症研究中心和国家心肺血液研究所（NHLBI）院内研究计划的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
8孔盖玻片培养皿Lab-tek155409
0.1% 聚-L-赖氨酸溶液Sigma-AldrichP8920
NV-100 nm 荧光纳米金刚石AdamasRed FND
抗-CD3ε 抗体BD Biosciences555329
牛血清白蛋白，第五组分KSE Scientific98-100P
Triton-XSigma-AldrichT9284
10% 多聚甲醛EMS15712致癌物
淡水鱼皮明胶Sigma-AldrichG7041
Alexa 647 抗体标记试剂盒Thermo FisherA20186
六水合氯化镁Sigma-Aldrich138924
PIPESSigma-AldrichP6757
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
2-巯基乙醇Sigma-AldrichM7154高毒，对空气敏感
半胱胺Sigma-Aldrich30070高毒
环辛四烯 98%Sigma-Aldrich138924高毒，对空气敏感
10x PBSKD MedicalRGF-3210
10x TBSKD MedicalRGF-3385

参考文献

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