利用高级共聚焦显微镜技术研究DNA损伤位点的蛋白质-蛋白质相互作用及动力学

摘要

激光显微照射是研究活细胞中DNA修复的有用工具。本文展示了利用UVA激光诱导多种DNA损伤的方法学途径。我们优化了一种局部显微照射方法，能够维持正常的细胞周期；因此，经照射的细胞可正常进行有丝分裂。

摘要

使用激光进行局部微照射是研究活细胞中与DNA修复相关过程的有用工具。本文介绍了一种方法学策略，用于分析蛋白质在DNA损伤位点随时间的动力学变化，或在局部微照射染色质上的蛋白质-蛋白质相互作用。我们还展示了如何利用Fucci细胞系统识别细胞周期的各个阶段，以研究细胞周期依赖性的蛋白质在DNA损伤处的动力学行为。本文还提供了使用两种紫外激光（355 nm和405 nm）诱导不同类型DNA损伤的方法学描述。只有经405 nm半导体激光微照射的细胞能够正常进行有丝分裂，并且不产生环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）。我们还展示了如何在特定时间点固定微照射后的细胞，以对内源性目标蛋白质进行免疫检测。在DNA修复研究中，我们进一步描述了生物物理方法的应用，包括在具有自发性DNA损伤灶的细胞中进行光漂白后荧光恢复（FRAP）和荧光寿命成像显微技术（FLIM）。此外，我们还展示了FLIM-FRET（荧光共振能量转移）在蛋白质-蛋白质相互作用实验研究中的应用。

引言

DNA损伤会导致出现多种DNA损伤位点，包括环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）、8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷以及单链或双链断裂^1,2。γ射线是一种能量最高、穿透力最强的电离辐射形式，因此广泛应用于放射治疗³。另一方面，由紫外激光实验诱导的DNA损伤可模拟生物体对紫外线的自然暴露。UVA显微辐照作为一种显微技术，是研究单个活细胞中DNA损伤的实验工具。该技术最早在40年前被用于揭示染色体区域的组织结构^4,5。该技术的应用高度依赖共聚焦显微镜的功能特性或现代纳米显微技术的技术限制。为诱导DNA损伤，可在紫外辐照前使用5-溴脱氧尿苷（BrdU）或Hoechst 33342对细胞进行预致敏处理。Bártová 等⁶此前已描述了预致敏步骤，而近期我们对该显微辐照技术进行了优化，以避免细胞死亡或凋亡的发生。例如，使用405 nm紫外激光（无需Hoechst 33342预致敏）主要诱导产生53BP1阳性的双链断裂（DSBs），而环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）的形成则相对较少。相反，预致敏步骤与紫外显微辐照结合使用时，可同时诱导产生极高水平的CPDs和DSBs^7,8。该方法难以用于单一DNA修复通路的研究。

通过微辐照技术，可以在活细胞中分析蛋白质在DNA损伤位点的招募、动力学行为及相互作用。Luijsterburg 等人曾发表该方法的一个应用实例，用于研究异染色质蛋白1βet al.⁹；我们最近首次发现多能性因子Oct4以及与卡哈尔体相关的蛋白coilin会被招募至紫外线诱导的DNA损伤位点^6,10。这些DNA损伤位点上的蛋白质动力学也可通过荧光漂白后恢复技术（FRAP, Fluorescence Recovery After Photobleaching）^11,12,13或荧光共振能量转移技术（FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer）^14,15进行研究。这些方法有助于揭示蛋白质在DNA损伤位点的简单扩散行为或蛋白质之间的相互作用。用于进一步表征蛋白质的有用工具是荧光寿命成像显微技术（FLIM, Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy），或其与FRET技术的结合形式（FRET-FLIM）¹⁶。这些方法可用于研究稳定或瞬时表达荧光标记目标蛋白的活细胞中的生物学过程¹⁷。此处展示了一个示例：GFP标记的p53蛋白及其在DNA损伤应答中起重要作用的相互作用蛋白mCherry标记的53BP1的荧光指数衰减时间（τ）^18,19。参数τ即荧光寿命，由FLIM计算获得，其数值取决于特定的荧光染料、结合状态及其所处的细胞微环境。因此，该方法能够揭示蛋白质亚群之间的差异，以及它们在例如DNA损伤后的结合能力与功能特性。

本文概述了本实验室用于研究微照射染色质位点处特定时间的蛋白质招募、动力学、扩散以及蛋白质-蛋白质相互作用的先进显微技术的方法学框架。文中提供了在活细胞中诱导局部DNA损伤的逐步操作方法，并描述了适用于研究由紫外激光诱导的局部DNA损伤位点处DNA损伤相关事件的各种方法学。

方案

1. 细胞系的培养

1. HeLa 细胞系衍生的细胞系
   注意：使用 HeLa 宫颈癌细胞：可选用稳定表达 GFP 标记组蛋白 H2B 的 HeLa 细胞，或 HeLa-Fucci 细胞（在 G1 期和早期 S 期表达 RFP-Cdt1，在 S/G2-M 期表达 GFP-geminin）图1).
   1. 培养所有HeLa衍生细胞系时，使用添加了10%胎牛血清和适当抗生素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），在含5% CO₂的湿润环境中37 °C培养₂每周更换培养基 2 至 3 次。
   2. 移除培养基，用1x PBS冲洗细胞 使用 PBS 去除含有胰蛋白酶抑制剂的血清残留。此步骤应在室温下的生物安全柜中进行。
   3. 加入1 mL预热的胰蛋白酶-EDTA溶液覆盖细胞层，并将细胞置于37 °C环境中。消化细胞至细胞层完全分散（通常3 - 5 min）。
   4. 加入3 mL预热的完全培养基以终止胰蛋白酶-EDTA的消化作用，并通过轻柔吹打数次使培养基分散均匀。
      注意：该操作必须在生物安全柜中进行，以保护操作人员免受污染物危害，并维持最佳的细胞培养条件。
   5. 使用自动细胞计数器或血球计数板对细胞进行计数。将细胞悬液稀释至 1 × 10⁵ 细胞/mL，移取5 mL至新培养皿中。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养。₂.
2. 小鼠胚胎干细胞（mESCs）D3细胞系的培养
   1. 在涂有0.2%明胶的细胞培养皿中培养小鼠胚胎干细胞（mESCs），并使用mESC维持培养基。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养。₂.
      注意：建议将mESC培养/维持培养基分装为50 mL等份，于2–8 °C保存，最多可保存2周。mESC培养基的组成为：75 mL ES细胞专用胎牛血清（FBS）、5 mL 青霉素G和链霉素、5 mL 非必需氨基酸（10 mM）（终浓度0.1 mM）、50 µL 小鼠白血病抑制因子（mLIF；100 µg/mL）（终浓度10 ng/mL）、430 µL MTG（1-巯基甘油；以DMEM稀释1:100）（终浓度100 µM），并用高糖DMEM培养基定容至500 mL。
   2. 吸弃培养皿中的 mESC 培养基，并用 1x PBS 洗涤细胞一次 PBS
   3. 加入0.5 mL胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育至细胞开始从培养皿脱落。随后，用2 mL添加了15%胎牛血清的mESC培养基洗涤细胞，以灭活胰蛋白酶。
   4. 使用移液器将剩余细胞从培养皿上吹打下来。
      注意：获得单细胞非常重要，因为细胞团块会促进细胞分化。
   5. 将细胞以1:10比例接种至明胶包被的培养皿中，使用mESC维持培养基培养。
      注意：若mESC细胞密度过低，则生长状态不佳；若密度过高，则会促进分化。
   6. 确保每两天将小鼠胚胎干细胞（mESCs）从一个培养皿按1:4比例传代至四个新培养皿，以维持其未分化状态。使用倒置显微镜在100倍镜下观察mESC集落。 或 200X 放大倍数，以及是否存在自发性 mES细胞分化，进行Western blot检测以评估Oct4蛋白的耗竭情况。
      注意：通过优化的细胞传代，可避免mESCs的自发分化 体外 可以减少。

2. 细胞转染

1. 在进行实验前48小时，将细胞接种于带网格的显微镜培养皿（直径35 mm）中，以便根据细胞在培养皿上的坐标定位经微辐照的细胞。
   注意：本示例中，微辐照为第一个实验步骤，免疫染色为第二个步骤（图2A）。
   1. 接种时，HeLa来源的细胞系使用5 × 10⁴ 个细胞/mL的浓度（D3 mES细胞则使用1 × 10⁴ 个细胞/mL）。每皿加入最多2 mL完全培养基。在培养和微辐照过程中，将细胞维持在37 °C、5% CO₂ 的恒温环境或培养舱中。
   2. 使用自动细胞计数器对细胞进行计数。
      注意：请勿使用过高的细胞浓度。特别是对于密集生长的D3 mESC克隆，高细胞密度会阻碍免疫染色后对局部微辐照细胞的识别。
2. 按以下方法准备质粒DNA和所选转染试剂。将2–3 µg选定的质粒DNA（详见材料表）溶于150 µL 1× PBS中，配制溶液A；将3.5 µL转染试剂溶于150 µL 1× PBS中，配制溶液B。通过轻柔吹打确保每种溶液充分混匀。
   注意：每种细胞系和特定质粒的DNA与转染试剂的最佳比例需通过实验经验确定。
3. 在对瞬时转染的活细胞进行观察前24小时，将溶液A与溶液B混合，避免涡旋。室温孵育15–20分钟。以逐滴方式将此完全转染混合液（300 µL，如步骤2.2所述）均匀分散至显微镜培养皿中生长的细胞层上。
4. 将细胞在37 °C、5% CO₂ 条件下孵育4–6小时，随后更换为新鲜培养基，并在标准条件下继续培养。
   注意：若使用405 nm激光，无需用任何试剂对细胞进行预致敏；但若使用355 nm激光，则需用10 µM 5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）对细胞进行预致敏^7,8。预致敏时间取决于细胞类型及细胞周期长度。对于HeLa细胞，应在局部微辐照前16–20小时加入BrdU；对于mESC，则应在微辐照前6–8小时加入BrdU。

3. 局部DNA损伤的诱导及共聚焦显微镜观察

1. 将培养皿置于显微镜载物台上，记录所选细胞在培养皿中的位置；后续分析需要细胞的坐标信息图2Aa-c).
2. 在标有数字或字母的方格内找到转染的细胞图2Ad-f，Ad 中的箭头指示了在 Ae 和 Af 面板中放大的细胞位置）。使用明场显微镜获取细胞（或细胞群）的图像，并采集荧光图像以确定细胞（或细胞群）和标记方格的位置图2A).
3. 在照射前进行图像采集时，使用连接到共聚焦显微镜的白光激光器（WLL）（波长范围470–670 nm，步长1 nm）（或共聚焦显微镜上连接的其他可用激光器）。
4. 使用以下设置：512 × 512 像素分辨率，像素大小为 64 nm，扫描频率 400 Hz，双向扫描模式（双向扫描），线平均值设为 8，放大倍数为 8x 至 12x。
   注意：线平均表示对特定数量的扫描线进行多次扫描；在进入下一行之前，同一行会被重复扫描多次。对所有行进行多次扫描后，生成图像的最终帧。
5. 使用63×油镜（数值孔径为1.4）进行图像观察和采集，并依次采集荧光图像。通过相应软件的逐帧扫描模式消除两种荧光染料之间的串扰。
   注意：所有显微镜软件均支持设置所谓的顺序扫描模式。操作者可选择是否同时采集荧光染料的信息（例如，以红-绿-蓝荧光方式）或如文中所述，依次单独地逐个荧光染料进行检测。需注意以下一般信息：GFP 的最大激发/发射波长为 395/509 nm，mCherry 的最大激发/发射波长为 587/610 nm（参见此处使用的荧光染料在 图2B）。根据此信息，为所需的荧光染料选择合适的激发和发射滤光片。每台共聚焦显微镜的滤光片选择和扫描程序必须进行优化。
6. 为诱导DNA损伤，使用64线扫描模式，在“采集”模式下关闭WLL，打开外部紫外光源 "紫外激光器" 按钮），设置感兴趣区域（ROI）（在“采集”模式下），并将355 nm激光设为100%功率，或者 alternatively 使用405 nm激光源。
   注意：通常情况下，激光功率通过图像采集模式中的相应激光调节按钮进行调整。
7. 对于局部微照射，使用发射近紫外A光谱的激光器。在对细胞核内的感兴趣区域（ROI）进行微照射并捕获图像时，将图像采集模式中的背景设置为零，以调节ROI以外区域的激光强度；若细胞得到适当照射，GFP-组蛋白H2B的信号将消失，并且例如mCherry标记的PCNA蛋白会在照射后立即被招募至DNA损伤位点图2B 和 视频 1).
   注意：在共聚焦切片的 ROI 内诱导的 DNA 损伤也会出现在三维（3D）投影中（参见 3D 旋转以及 x-y、x-z、y-z 投影） 图2C 和 视频 2）。有关355 nm和405 nm激光器完整技术参数的描述，参见Stixová 等⁷
8. ROI 照射完成后，关闭外部紫外光源，关闭 ROI，打开白光光源（WLL），将扫描线切换至 8，然后选择另一个细胞进行照射。ROI 的选择需在软件的图像采集模式下使用相应的按钮完成。
   注意：mCherry-PCNA 在 DNA 损伤部位的积累峰值出现在 2 至 20 分钟之间（图2B）。为了验证外源蛋白水平的结果，在局部微照射后立即进行免疫荧光染色。根据研究需求选择照射时间间隔。
9. 验证在大多数显微照射细胞中可检测到外源蛋白的累积。为完成此验证，请使用以下步骤中的标准。
   1. 检测瞬时转染细胞中外源蛋白是否存在过表达。作为可能的解决方案，选择仅微弱表达荧光蛋白的细胞例如mCherry-PCNA 或 mCherry-53BP1
   2. 评估用于图像采集的白光光源（WLL）暴露的光毒性。
      注意：进行光毒性测试时，将转染的细胞暴露于 prolonged laser microirradiation（长时间激光微照射），并验证细胞能否如图所示进入有丝分裂。 图3A- B作为可能的解决方案，可缩短扫描时间并减少每细胞的共聚焦切片数量，通过选择最佳轴向步进（推荐0.3 µm）优化三维扫描，并将激光功率设置为最低。或者，可在培养基中溶解Trolox（6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸，一种水溶性维生素E类似物）以消除光毒性。对于与DNA损伤相关的实验，由于Trolox具有抗紫外线辐射的保护作用，不建议使用。
   3. 使用355 nm激光照射时，应使用BrdU掺入检测试剂盒中的适当BrdU检测抗体验证BrdU是否充分掺入（参见 材料表由于BrdU在细胞周期的S期被掺入DNA，因此大多数细胞必须在预致敏期间经历S期。作为可能的解决方案，需考虑细胞周期的长度，该长度具有细胞类型特异性。
   4. 分析目标DNA修复蛋白是否具有在特定细胞周期阶段识别DNA损伤的能力。 一种可能的解决方案： 为验证特定蛋白向DNA损伤位点的招募是否局限于特定细胞周期阶段（G1/S/G2），可使用HeLa-Fucci细胞。这些细胞在G1期和早期S期表达RFP-Cdt1，在S期至G2-M期表达GFP标记的geminin。 ²² (图1) .
   5. 为避免细胞凋亡和细胞死亡，应选择合适的激光光源和激光功率设置²³需注意，经辐照的细胞应进入有丝分裂（图3A-B，视频 3).
      注意：可通过 Annexin V 阳性、caspase 3 活性或 lamin B 裂解检测到非预期的细胞凋亡。在形态学水平上，可见细胞脱落和凋亡小体的形成。

4. 免疫荧光染色

1. 用 1 × PBS 短暂清洗显微镜培养皿中的细胞层，清洗后，在室温下用 4% 甲醛固定细胞 10 分钟（HeLa 来源的细胞系）或 20 分钟（D3 ES 细胞）。用 1 × PBS 再次清洗培养皿。
   注意：甲醛可导致严重的眼部损伤，可能引起过敏性皮肤反应，且为潜在致癌物；因此，所有涉及甲醛的实验步骤均应在通风橱中进行。
   注：为避免荧光信号不必要的漂白，在免疫荧光染色所需的孵育期间，应将培养皿保存在避光容器中。
2. 用含 0.1% Triton X-100 的 H₂O 溶液对细胞进行 8 分钟的透化处理，随后在含 0.1% 皂苷和 0.1% Triton X-100 的 1× PBS 中孵育细胞 12 分钟。孵育后，用 1× PBS 洗涤细胞两次，每次 15 分钟。
3. 用含 1% BSA 的 1× PBS 溶液孵育细胞 60 分钟，以阻断所选抗体的非特异性结合。孵育后，用 1× PBS 洗涤细胞 15 分钟。
4. 将一抗按 1:100（或 1:200）的比例（此步骤需根据不同抗体进行优化）用含 1% BSA 的 1 × PBS 溶液稀释，每皿使用 25 µL 该溶液，并用盖玻片覆盖细胞。将细胞置于湿盒中，于 4 °C 过夜孵育。
5. 次日，用 1 × PBS 洗涤细胞两次，每次 5 分钟。
6. 将二抗按 1:100（或可选 1:200）的比例用含 1% BSA 的 1 × PBS 溶液稀释，每皿使用 100 µL 该溶液，并用盖玻片覆盖细胞。将细胞在含二抗的溶液中孵育 60 分钟。孵育后，用 1 × PBS 洗涤细胞三次，每次 5 分钟。
7. 用一滴封片剂将盖玻片封固，并用指甲油或胶水密封盖玻片边缘，以防止显微镜观察过程中干燥或移动。将培养皿避光保存于 4 °C。

5. 荧光寿命成像（FLIM）显微镜

1. 启动FLIM软件。打开 "应用套件" 软件并将其切换到 "荧光寿命成像显微镜" 模式。确保 WLL 处于脉冲模式下运行。
   注意：操作人员必须切换硬件按钮以进入脉冲模式。
2. 将染色后的细胞培养皿（第4节中染色）以与局部微照射时相同的方位置于显微镜载物台上，根据培养皿上的网格定位受照射的细胞，通过共聚焦显微镜进行图像采集。
   注意：使用以下设置：1024 × 1024 像素，400 Hz，双向扫描模式，16 线，放大倍数 8x 至 12x。
3. 开始FLIM测量之前，通过点击以下选项执行初步测试，以显示指数衰减的实时记录： "设置荧光寿命成像显微镜（FLIM）" 和 "采集" 并按压 "进行荧光寿命成像测试"优化样品的FLIM参数，通过评估以下两个主要参数来实现。
   1. 根据样品的荧光寿命调整白光激光器（WLL）的重复频率（参见下文注释）。在共聚焦显微镜软件中，通过相应的按钮调节激光强度，该按钮通常称为 "激光调节设置" 在“图像采集”菜单中。然后，使用FLIM软件计算衰减曲线（或显示所有光子计数的直方图）（参见 图 4A- B).
      注意：使用白光激光器（WLL）的脉冲模式进行激发。软件必须配备适用于WLL的脉冲选择器，以便选择重复频率（80、40、20 或 10 MHz）。以荧光供体GFP为例，其激发波长为488 nm。荧光寿命衰减曲线通过FLIM软件工作区记录。参数（τ_D, τ_DA)显示指数衰减时间（例如，荧光染料寿命）；参数（A）代表荧光染料衰减的振幅（参见GFP标记的p53和mCherry标记的53BP1的荧光寿命成像显微技术数据示例） 图4A- B).
   2. 使用软件采集工具（选择重复率模式）检查计数重复率。选择样本中最亮的像素点；最亮像素点的曲线必须低于总荧光强度的10%。
4. 点击 "测量" 并按压 "运行荧光寿命成像显微技术（FLIM）".

6. 使用 FLIM 脚本测定供体寿命及计算 FRET 效率

1. 启动FRET-FLIM软件并打开“Donor”工作区。
2. 在菜单中选择"Analysis"/"Imaging"选项卡，然后点击"Start"以运行FLIM脚本。为获得最佳FRET-FLIM设置，建议使用已知的相互作用蛋白对。
   注意：已知相互作用蛋白对GFP-p53和mCherry-53BP1的FRET-FLIM效率为(34.1 ± 2.3)%（图4C）。
3. 仅使用Donor发射通道（通道1或2），然后点击"Calculate Fast FLIM"。
   注意：图像和图表将同时更新。
4. 在FRET-FLIM软件中，手动设置强度范围（0 - 4000计数）和寿命范围（0 - 5 ns）。通过此方法，可观察目标细胞并设定FRET-FLIM测量参数。
   注意：该设置可消除细胞群体中各个细胞间荧光强度的差异。
5. 在衰减曲线界面中选择拟合模型。
   注意：推荐使用n指数去卷积法，并选择模型参数"n"。理想的拟合应满足以下标准：拟合曲线与衰减曲线高度重合，且χ²值等于1（图4B）。
6. 选择"Threshold"/"Use Threshold"，并将阈值设为75，然后启动"Initial Fit"。
   注意：SPT64软件将计算无FRET时的平均供体寿命（"Amplitude weighted average lifetime"，τ_Av.Amp）。

7. 使用 FLIM-FRET 脚本测定 FRET 效率

1. 选择“供体/受体”工作区，然后打开 "分析"| "成像"| "荧光寿命FRET图像"。
2. 仅将供体设为活动通道，并根据每像素光子数调整像素合并（Pixel Binning）。然后运行名为 "Calculate FastFLIM" 的软件模式。如果图像中每像素光子数较低，则将像素合并增加至4点。
3. 将强度设置为 0 - 200 计数，寿命设置为 0 - 5 ns。
4. 启用 "使用阈值"，并输入阈值 75。
5. 将拟合模型设为 "Multi-Exp. Donor"，输入模型参数 "n"，将 τ_Av.Amp（步骤 6.6）作为 τ_D 输入，并启用 "初始拟合"。
6. 通过取消勾选，将参数 Bkgr_Dec、Shift_IRF 和 Bkgr_IRF 设为固定值。
   注：应尽可能将大多数参数设为固定不变，以减少统计波动。在此情况下，不要再按 "初始拟合"。相关参数说明如下：IRF = 仪器响应函数，BkgrDec = 指数拟合中的背景信号，ShiftIRF = 指数反卷积拟合中的IRF偏移，BkgrIRF = 指数反卷积拟合中的IRF背景。这三个参数均可通过软件计算并固定，用于后续分析。
7. 点击 "Calculate FRET"；将计算出FRET图像（在FLIM图像区域中绘制）和FRET效率直方图，并生成FRET距离直方图（图4C）。图像分析完成后，点击 "保存结果"。
   注：在进行FRET实验时，需注意荧光蛋白会在荧光（亮态）与非荧光（暗态）状态之间发生可逆转换。这一特性称为 "闪烁（blinking）"，FRET效率会受此现象影响（Vogerl et al.²⁴ 对该效应进行了详细解释）。

8. FRAP 分析

1. 将培养皿置于显微镜载物台上，找到表达荧光标记目标蛋白的转染细胞，并使用标准显微镜光源进行明场显微成像（参见图2Aa-b）以及荧光显微成像模式采集图像。
   1. 图像采集时，使用连接共聚焦显微镜的白光激光器（WLL）（或根据所选荧光染料选择合适的激光器）。设置如下参数：512 × 512 像素，1000 Hz，双向扫描模式，线平均为1，放大倍数为8x至12x。
   2. 采集至少15帧预漂白图像（激光功率约为10%），并在图像采集菜单中定义感兴趣区域（ROI）。
2. 进行光漂白实验时，使用氩离子激光器（488 nm）。设置如下参数：帧分辨率为512 × 512 像素，1000 Hz，双向扫描模式，放大倍数为8x至10x。
   注：包括GFP、mCherry和RFP在内的荧光染料均可由工作在488 nm或514 nm的氩离子激光器激发。
3. 使用所选显微镜的FRAP软件模式。在光漂白过程中，通过激光调节按钮将氩离子激光器的功率调至最大。以0.256 s 为时间间隔，使用10%激光功率进行图像采集。
   注：漂白后的图像采集步骤应使用所选共聚焦显微镜的标准图像采集模式。
   1. 监测光漂白后的荧光恢复时间（最多持续至漂白后45–50 s）。
      注：如图4D所示，mCherry标记的53BP1在自发性DNA损伤位点与UVA照射诱导的焦点处的漂白后恢复时间存在差异。在UVA诱导的损伤位点，mCherry-53BP1的恢复速度明显快于在自发DNA修复焦点处的mCherry-53BP1聚集；参见图4D及Foltankova et al.²⁵
4. 将显微镜软件（或所选软件）中的数据导出至电子表格，并进行统计分析。

结果

利用先进的共聚焦显微镜技术，我们观察到mCherry标记的53BP1和mCherry-PCNA蛋白在DNA损伤位点的聚集。该分析通过局部微辐照活细胞进行。为了识别DNA修复相关蛋白在细胞周期各个阶段的核内分布模式，我们采用了Fucci细胞系统，该系统可用于区分细胞周期的G1期、早期S期和G2期（图1）。我们在Suchankova et al.²⁶中发表的Fucci细胞模型的生物学应用表明，53BP1在细胞周期的G1期、S期和G2期均被招募至局部诱导的DNA损伤位点，这与该蛋白在非同源末端连接（NHEJ）过程中的功能相关；NHEJ是介导双链断裂修复的主要机制之一。另一方面，该实验系统在单细胞水平上显示，与同源重组修复途径（HRR）相关的PCNA蛋白仅在S期晚期和G2期识别双链断裂（DSBs）²⁷。为了研究DNA修复机制，我们还优化了辐照条件，以确保细胞在紫外激光照射后仍能继续进行有丝分裂（

讨论

显微镜技术是科研实验室中的基本工具。本文简要描述了用于研究蛋白质在DNA损伤位点募集及其动力学的方法。我们特别总结了在活细胞局部显微照射领域的实验经验，并讨论了利用FRAP研究蛋白质动力学，以及通过受体漂白FRET²⁸及其改进技术FRET-FLIM（图4A-D）研究DNA损伤位点处蛋白质-蛋白质相互作用的方法。文中所示这些方法对于深入理解DNA修复过程至关重要，尤其是借助先进的共聚焦显微镜对活细胞系统中蛋白质动力学进行观测时尤为关键^6,7,8,28。这些方法在未来的医学应用中具有重大价值，可用于分析放射治疗对组织的影响，或表征肿瘤细胞的形态特征。为了优化该方法，我们建议从已知存在相互作用的蛋白质对开始实验，如

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>细胞培养
HeLa	ATCC	CCL-2TM
ES-D3 [D3]	ATCC	CRL-11632TM
HeLa-Fucci 细胞			http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html
DMEM	PAN-Biotech	P03-0710
DMEM高糖	Sigma-Aldrich	D6429-500ML
胎牛血清（FBS）	HyClone	SV30180.03
ES 细胞 FBS	Gibco	16141-079
非必需氨基酸（NEAA）	Gibco	11140-035
mLIF（小鼠白血病抑制因子）	默克密理博	ESG1107
MTG（1-巯基甘油）	Sigma-Aldrich	M6145-25ML
青霉素-链霉素溶液	Biosera	XC-A4122/100
胰蛋白酶-EDTA	Biosera	XC-T1717/100	用1稀释 × PBS 按 1:6 比例稀释
Nunclon 细胞培养皿	Sigma-Aldrich	P7866	D3小鼠胚胎干细胞的培养
µ-35 mm培养皿+A15:I35m 500网格	Ibidi GmbH	81166	显微镜培养皿
0.2% 明胶	Sigma-Aldrich	G1890-100G	用去离子水稀释并高压灭菌
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>细胞转染
GFP-p53 质粒	Addgene	12091
mCherry-PCNA 质粒			由克里斯蒂娜·卡多索（Cristina Cardoso）慷慨惠赠，德国工业大学（Technische Universitä达姆施塔特
mCherry-53BP1 质粒	Addgene	19835
Metafecetene	Biontex Laboratories GmbH	T020–2.0
10 × PBS	赛默飞世尔科技	AM9625	用于转染，使用 1 × 用无核酸酶水稀释的 PBS
5-溴-2’-脱氧尿苷	Sigma-Aldrich	11296736001
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>共聚焦显微镜
Leica TCS SP5 显微镜	徕卡显微系统
显微镜 Leica TCS SP8	徕卡显微系统
白光激光器	Leica Microsystems
355 nm 激光器	相干公司		激光功率 80 mW
405 nm 激光器	徕卡显微系统		激光功率 50 mW
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>免疫荧光染色
盖玻片	VWR International Ltd	631-1580
4% 多聚甲醛	Affymetrix	19943 1 LT
Triton X100	MP Biomedicals	2194854
皂苷（来自皂荚树皮）	Sigma-Aldrich	S4521
BSA	Sigma-Aldrich	A2153
53BP1	Abcam	ab21083	一抗
AlexaFluor 647	赛默飞世尔科技	A27040	二抗
Vectashield	Vector Laboratories Ltd	H-1000	封片剂