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方法文章

血红蛋白病患者造血干细胞移植后残余供体红系祖细胞的检测

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DOI：

10.3791/56002

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2017年9月6日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Medical University Innsbruck, 2Department of Internal Medicine V (Hematology & Oncology), Medical University Innsbruck, 3Tyrolean Cancer Research Institute, 4Department of Pediatrics, Medical University Graz

本文内容

摘要

为了监测血红蛋白病患者在干细胞移植后的植入情况，需要对供体来源的细胞进行定量。可通过结合基于流式细胞术的细胞分选、集落形成实验以及后续的短串联重复序列分析，来评估红系细胞区室中前体细胞的增殖与分化能力。

摘要

在因重型地中海贫血或镰状细胞病接受骨髓移植的患者中，有相当大比例存在不完全嵌合现象。这一发现具有重要意义，因为后续的治疗性免疫调节策略可能改善临床结局。传统上，通过基于聚合酶链反应的短串联重复序列分析来鉴定供体来源血细胞中的嵌合状态。然而，该方法仅限于有核细胞，且无法区分解离的单个细胞系。我们将短串联重复序列分析应用于流式细胞术分选的造血祖细胞，并与从骨髓中分离的红系爆式集落形成单位（burst-forming unit-erythroid）集落中获得的短串联重复序列分析结果进行比较。通过该方法，我们能够展示供体细胞在红系组分中的不同增殖与分化情况。该技术可补充当前干细胞移植背景下嵌合状态的监测手段，因此有望应用于未来的临床研究、干细胞研究以及基因治疗试验的设计中。

引言

异基因造血干细胞移植（HSCT）是目前唯一可用于治愈多种造血系统先天性遗传病的方法，对于原本预后极差且生存期受限的患者，其无病生存率可超过90%1。这一重要治疗手段的疗效已通过降低移植前后治疗方案的毒性得到优化2，同时也得益于旨在维持移植物稳定功能的干预措施，后者通过密切监测供体来源细胞来量化评估3,4,5。

通常，完全嵌合（CC）指受者的淋巴造血系统被供者来源的细胞完全取代，而混合嵌合（MC）则指供者和受者来源的细胞以不同比例同时存在。分裂嵌合（SC）特指在单一细胞谱系（如红细胞系）中观察到的混合嵌合状态。造血干细胞移植（HSCT）后及时确定嵌合状态至关重要，因其有助于识别疾病复发风险较高的患者，并启动后续免疫调节策略，例如供者淋巴细胞输注或减少免疫抑制治疗6。

已开发出多种方法用于监测HSCT后移植物的植入情况。免疫球蛋白分型和细胞遗传学分析的敏感性较差，且在检测多态性方面存在局限性。7,8荧光的引入 原位 荧光原位杂交（FISH）可提高造血干细胞移植（HSCT）后嵌合体监测的敏感性，但仅限于性别不匹配的异基因移植。9目前，聚合酶链式反应（PCR）是检测嵌合体最广泛使用的方法，该方法基于对可变数目串联重复序列（VNTRs）或短串联重复序列（STRs）进行常规琼脂糖-丙烯酰胺凝胶电泳分析。常规使用的定量PCR能够检测造血干细胞移植（HSCT）后极少量残留供体细胞。迄今为止，相关研究的主要局限在于混合嵌合体（MC）的检测几乎仅限于有核细胞，而非常具有功能重要性的成熟红细胞，后者对于血红蛋白病患者尤为关键。对于血型不同的患者，值得指出的是，流式细胞荧光分析可通过使用针对红细胞ABO及C、c、D、E、e抗原的单克隆抗体，实现对红细胞嵌合体的识别。10,11评估红系嵌合体的另一种非常有趣的方法是通过流式细胞术分选红系祖细胞，并在克隆形成实验中培养以富集不同类型的红系祖细胞，随后进行短串联重复序列（STR）分析。12该方法能够量化红系组分中供体与受体嵌合体的相对比例，并可应用于维持骨髓移植物的策略中。

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方案

1. 通过多参数荧光激活细胞分选法分离造血骨髓细胞

  1. 样品染色
    1. 在开始该流程之前，需要收集并准备好以下物品：
      1. 用于单个核细胞制备的梯度介质（GM），50 mL 圆锥形管
      2. 用于细胞染色的12 x 75 mm流式管
      3. 染色缓冲液：磷酸盐缓冲液（PBS）+ 3% 胎牛血清（FCS）
      4. 移液器
      5. FC封闭液及染色抗体（CD34 APC、CD36 FITC、CD45 V450，BD Biosciences）。该荧光染料组合在其他检测通道中的溢出可忽略不计，但也可使用其他合适的荧光染料组合。
      6. 补偿微珠（如需要）
      7. 悬浮缓冲液：Hank's 平衡盐溶液 (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS
      8. 台盼蓝和血细胞计数板
      9. 收集管：可使用任何含高血清的富集培养基管（含1 mL FCS + 25 mM HEPES）来收集分选后的细胞。
      10. 骨髓样本：通常需要获得患者关于从髋骨后部髂嵴进行骨髓活检的知情同意。骨髓样本采集后应保存在含肝素的注射器中，于室温下避光保存直至染色。以下实验步骤均依照本机构人类研究伦理委员会关于人类受试者福利的相关指南执行。
    2. 制备骨髓样本的单细胞悬液。向离心管中加入3 mL GM。将4 mL单细胞悬液小心地铺加到GM溶液上层。在20 °C条件下以550 g离心30分钟（关闭刹车）。使用无菌移液管吸除含有血浆和血小板的上层液体，保留位于界面处的单个核细胞层不受扰动。使用无菌移液管将单个核细胞层转移至另一无菌离心管中。
    3. 用5 mL染色缓冲液洗涤后，将细胞重悬于2 mL悬浮缓冲液中，并测定细胞浓度。取5 µL细胞悬液置于带螺帽的试管中，加入95 µL 0.2%台盼蓝染液，充分混匀。室温静置5分钟。按细胞计数方法充入血细胞计数板。在显微镜下观察非活细胞是否被染色，并计数活细胞。
    4. 在20 °C下以250 g离心10分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于染色缓冲液中，细胞浓度不超过1 x 106 每 100 µL
    5. 使用每 1 x 10⁶ 个细胞 2.5 µg Fc Block 来阻断 FcR6 冰上孵育细胞 10 - 15 分钟。
    6. 加入适量组合的10 µg单克隆抗体，用于染色1 x 10⁶细胞6 细胞并在 4°C 避光孵育 20 分钟，随后用 3 mL 染色缓冲液洗涤。为正确进行补偿，取少量细胞（或更优选择为补偿微珠）分别单独标记单种抗体，另留一份样本不染色。
    7. 将浓度调整至 20 x 106 cells/mL
    8. 设置并优化细胞分选仪。流式细胞仪及其软件的设置流程已由厂商提供详细操作说明，属于标准化操作，须由经过适当培训的人员完成。
  2. 细胞分选仪分选
    1. 准备步骤 1.1.1.9 中的收集管。
    2. 设置一个包含双变量图的模板，用于显示前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）。
    3. 运行细胞样本，并调节FSC/SSC以使目标细胞群位于量程范围内
    4. 记录阴性对照管。
    5. 运行单阳性质控管；记录每根管的数据。
    6. 使用采集软件提供的功能手动或自动计算补偿。
    7. 获取实验样本，并在双变量FSC/SSC点图上设门图1A) 以包含淋巴细胞和髓系细胞。通过比较FSC的不同信号来排除双联体和聚集体。即、高度、宽度和面积）（图1B). 在显示 CD45 和 CD36 的双变量点图上观察单细胞群体（图1C)。CD45阳性的事件为白细胞（包括其前体细胞），CD45阴性而CD36阳性的事件为红系前体细胞。使用设门工具定义CD36+细胞（如需要，可进一步分为CD36高表达和低表达细胞）以及CD45+细胞。在另一幅显示CD34与SSC参数的散点图中观察CD45+事件。使用设门工具定义CD34+细胞（白细胞前体）和SSC高表达细胞（处于不同分化阶段的髓系细胞）。
    8. 确定门控参数后，可选择这些门控参数以分选至外部收集管中。
    9. 在4 °C条件下继续分选，直至获得所需数量的细胞
    10. 进行分选后分析，以确定分选后细胞群体的纯度（图1E, 1F).

2. 克隆形成实验

  1. 试剂准备
    开始实验前，需准备以下物品：
    1. 移液器、100 mm 培养皿
    2. 台盼蓝和血细胞计数板
    3. 用含有至少 0.1% 人血清白蛋白的无菌 PBS 将人重组促红细胞生成素（EPO）重悬至 500 U/mL。将此溶液分装成小份，保存于 -20 °C，避免反复冻融。
    4. 配制完全的 Iscove 改良 Dulbecco 培养基（IMDM），终浓度为 5% 胎牛血清（FCS）、2 mM 谷氨酰胺、100 单位/mL 青霉素/链霉素（PS）。在不同孔中向完全 IMDM 培养基中添加不同浓度的人重组促红细胞生成素（EPO）：每孔 3 单位 EPO、每孔 6 单位 EPO 和每孔 12 单位 EPO（分别为 1×、2× 和 4× EPO）。
  2. 骨髓细胞的制备
    1. 在无菌条件下，将 10 mL 骨髓样本与 20 mL PBS 混合后，缓慢叠加于 50 mL 锥形管中的 15 mL 密度梯度介质上方，保持两相之间界面清晰。随后以 550 × g 在室温（RT）下离心 30 分钟，加速度设为 9，减速度设为 0（或关闭刹车）。
    2. 离心后，将界面层转移至新的 50 mL 管中，并加入 PBS 至终体积为 50 mL。
    3. 在 10 °C 下以 250 × g 离心 10 分钟后，弃去上清液，将细胞重悬于完全 IMDM 培养基中，浓度约为 0.5 × 106 个细胞/mL。取 10 µL 细胞悬液加入微量离心管中，与等体积的 0.4% 台盼蓝溶液混合，用血细胞计数板进行计数。
    4. 可选步骤：根据 Miltenyi CD34 磁珠试剂盒制造商提供的说明，通过磁性细胞分选富集 CD34+ 细胞。该富集步骤的主要优势在于可评估造血干细胞的质量，这些细胞在半固体培养基中培养，其中添加了 50 ng/mL 干细胞因子（SCF）、20 ng/mL 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、20 ng/mL 白细胞介素-3（IL-3）、20 ng/mL 白细胞介素-6（IL-6）、20 ng/mL 粒细胞集落刺激因子（G-CSF）以及如 1.4 所述的三种不同浓度的 EPO。
    5. 用补充 EPO 的完全 IMDM 培养基将细胞稀释至 0.1 - 0.15 × 106 个单个核细胞/mL 或 2 × 103 个 CD34+ 细胞/mL，并将 300 µL 加入 3 mL Methocult H4434 培养基中。充分振荡混匀后，短暂孵育 5 分钟，然后在 35 mm 培养皿中每皿接种 1.1 mL，共接种三皿。其中两个培养皿与第三个盛有水的培养皿一同置于 100 mm 培养皿中。
    6. 细胞在 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养 14 天。
  3. 集落分析
    1. 使用倒置显微镜在 40× 放大倍数下，根据集落形态对培养皿中带有计数网格的集落进行计数。在本实验中，集落形成单位（CFU）分为四类：多向祖细胞（CFU-GEMM）、粒细胞-巨噬细胞祖细胞（CFU-GM）、红系爆式形成单位（BFU-E）和红系集落形成单位（CFU-E）。更多集落亚型分类请参阅试剂盒说明书。
    2. 为进一步分析，根据上述四类分别从 CFU 培养板中回收细胞，用含 2% FCS/IMDM 的室温 PBS 悬浮细胞。在 4 °C 下以 400 × g 离心 10 分钟后，弃去上清，将细胞重悬于 PBS 中，计数后进行 DNA 提取处理。

3. 嵌合体分析

  1. DNA 提取
    1. 以 400 g 离心 10 分钟，收集细胞沉淀。
    2. 使用血液 DNA 提取试剂盒（QIAmp DNA Blood 提取试剂盒）提取 DNA。将洗脱缓冲液（AE）预热至 37 °C，以提高洗脱 DNA 的得率。
    3. 使用 Nanodrop ND-1000 分光光度计测定 DNA 浓度。OD 260/280 在 1.8–2.0 之间的样品用于后续分析。
    4. 用无 DNA 酶的 H2O 将 DNA 稀释至 0.1 ng/µL，总体积为 50 µL。
  2. STR 分析
    1. 按照说明书，将反应混合液、AmplTaq Gold DNA 聚合酶和 Profiler Plus 引物组与 20 µL 基因组 DNA（0.1 ng/µL）混合，配制 PCR 反应体系（引物试剂盒包含未标记的引物缓冲液，用于扩增 STR 位点 D3S1358、vWA、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317 和 D7S820，以及性别标记基因 amelogenin）。以无核酸酶水作阴性对照，9947A 作阳性对照。同时包括供体和受体的移植前 DNA。
    2. 使用 Eppendorf Mastercycler gradient 进行 PCR 反应，条件如下：95 °C 预变性 11 分钟，随后进行 28 个循环的扩增（95 °C 变性 1 分钟，59 °C 退火 1 分钟，72 °C 延伸 1 分钟），最后 60 °C 延伸 45 分钟。
    3. 向 1 µL PCR 产物中加入 12 µL Hi-Di 甲酰胺和 0.5 µL GeneScan 500 ROX 大小标准品（均为 Applied Biosystems 产品），配制片段分析反应体系。在第一个和最后一个位置需使用等位基因阶梯（Genotyper AmpFlSTR Blue、Green II 和 Yellow，Applied Biosystems）。
    4. 启动电泳仪进行电泳和信号采集。
    5. 使用软件13分析样品和对照的位点、等位基因及峰高。

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结果

通过FACS细胞分选分离淋系-造血祖细胞

本文展示了为后续 STR 分析而分选所需细胞群的结果。骨髓细胞使用 V450 标记的抗 CD45 抗体、FITC 标记的抗 CD36 抗体以及 APC 标记的抗 CD34 抗体进行染色。目标细胞群为巨核细胞-红系祖细胞（MEP），即负责红细胞发育的有核细胞。这些细胞表达 CD36，但不表达白细胞共同抗原 CD45（图 1C）。如有需要，可根据其 CD36 表达水平进一步区分这些细胞。此外还可分选多个其他细胞群作为对照。我们分选了 CD45+CD34+ 淋巴样/髓样前体细胞作为另一群祖细胞，并分选 CD45+ 且具有高侧向散射（SSC）信号的细胞作为成熟髓样细胞（图 1D）。分选使用 BD FACSAria I 仪器完成。分选后，红系祖细胞纯度 >85%（

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讨论

本研究的目的是为读者提供两种方法的结合，用于分析接受造血干细胞移植（HSCT）治疗血红蛋白病患者红系祖细胞中的供者/受者嵌合状态：1）对骨髓样本中的造血祖细胞进行荧光激活细胞分选，随后进行短串联重复序列分析；2）骨髓细胞的集落形成单位培养，将集落分类为不同类型的祖细胞，再进行短串联重复序列分析。该方法的新颖之处在于将这两种技术结合到一个实验流程中，以评估单个集落内的供者/受者嵌合情况。

该方法的特殊重要性体现在接受造血干细胞移植（HSCT）治疗血红蛋白病患者后出现的混合嵌合状态背景下。多项研究已表明，相当一部分患者体内供体髓系细胞比例较低，且与红系前体细胞的比例相一致，从而导致长期稳定的混合性造血嵌合3,11；相比之下，在这些患者中，供体来源的红细胞比例显著更高（比成熟白细胞高出2至5倍），提示无效红细胞生成发生在红系发育的较晚阶段。这些现象被认为与供体有核红细胞前体易于加速凋亡，以及残留的T细胞和B细胞持续存在从而允许混合异基因移植物共存有关

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Ficoll-PaqueGE HealthcareGE17-1440-02 去除红细胞
50 mL 圆底离心管Falcon14-432-22样品制备
12 x 75 mm 流式管Falcon352002FACS 分选
磷酸盐缓冲液Gibco10010023PBS
胎牛血清Invitrogen Inc.16000-044FCS（热灭活）
CD34 APCBD Bioscience561209FACS 抗体
CD36 FITCBD Bioscience555454FACS 抗体
CD45 V450BD Bioscience642275FACS 抗体
台盼蓝Gibco15250061
血细胞计数板Invitrogen Inc.C10227自动细胞计数
Hank’s 平衡盐溶液Gibco14025092FACS 分析中的悬浮缓冲液
HEPESGibco15630080悬浮缓冲液组分
FcRBD Bioscience564220封闭 FcR
FACS Aria IBD Bioscience23-11539-00FACS 分选仪
重组 人促红细胞生成素Affimetrix eBioscience14-8992-80EPO
Isocove’s 改良 Dulbecco’s 培养基Gibco12440053IMDM
L-谷氨酰胺Invitrogen25030-081培养基组分
CD34+ 磁珠Milteny Biotech130-046-702CD34+ 纯化
重组 人 G-CSFGibcoPHC2031CFU-检测
重组 人 SCFGibcoCTP2113CFU-检测
重组 人 GM-CSFGibcoPHC2015CFU-检测
重组 人 IL-3BD Bioscience554604CFU-检测
重组 人 IL-6BD Bioscience550071CFU-检测
Methocult H4434 培养基Stemcell Technologies4444CFU-检测
QiAmp 血液DNA提取试剂盒Qiagen51306DNA 提取
Nanodrop ND-1000 分光光度计Thermo ScientificND 1000DNA 定量
无DNA酶的 H2OThermo ScientificFEREN0521DNA 制备
AmplTaq Gold DNA 聚合酶Applied BioscienceN8080240PCR
Eppendorf Mastercycler gradientEppendorf6321000019PCR 
Hi-Di 甲酰胺Applied Bioscience4311320PCR
GeneScan 500 ROX 大小标准品Applied Bioscience4310361PCR
3130 遗传分析仪Applied Bioscience313001RPCR

参考文献

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