血红蛋白病患者造血干细胞移植后残余供体红系祖细胞的检测

摘要

为了监测血红蛋白病患者在干细胞移植后的植入情况，需要对供体来源的细胞进行定量。可通过结合基于流式细胞术的细胞分选、集落形成实验以及后续的短串联重复序列分析，来评估红系细胞区室中前体细胞的增殖与分化能力。

摘要

在因重型地中海贫血或镰状细胞病接受骨髓移植的患者中，有相当大比例存在不完全嵌合现象。这一发现具有重要意义，因为后续的治疗性免疫调节策略可能改善临床结局。传统上，通过基于聚合酶链反应的短串联重复序列分析来鉴定供体来源血细胞中的嵌合状态。然而，该方法仅限于有核细胞，且无法区分解离的单个细胞系。我们将短串联重复序列分析应用于流式细胞术分选的造血祖细胞，并与从骨髓中分离的红系爆式集落形成单位（burst-forming unit-erythroid）集落中获得的短串联重复序列分析结果进行比较。通过该方法，我们能够展示供体细胞在红系组分中的不同增殖与分化情况。该技术可补充当前干细胞移植背景下嵌合状态的监测手段，因此有望应用于未来的临床研究、干细胞研究以及基因治疗试验的设计中。

引言

异基因造血干细胞移植（HSCT）是目前唯一可用于治愈多种造血系统先天性遗传病的方法，对于原本预后极差且生存期受限的患者，其无病生存率可超过90%¹。这一重要治疗手段的疗效已通过降低移植前后治疗方案的毒性得到优化²，同时也得益于旨在维持移植物稳定功能的干预措施，后者通过密切监测供体来源细胞来量化评估^3,4,5。

通常，完全嵌合（CC）指受者的淋巴造血系统被供者来源的细胞完全取代，而混合嵌合（MC）则指供者和受者来源的细胞以不同比例同时存在。分裂嵌合（SC）特指在单一细胞谱系（如红细胞系）中观察到的混合嵌合状态。造血干细胞移植（HSCT）后及时确定嵌合状态至关重要，因其有助于识别疾病复发风险较高的患者，并启动后续免疫调节策略，例如供者淋巴细胞输注或减少免疫抑制治疗⁶。

已开发出多种方法用于监测HSCT后移植物的植入情况。免疫球蛋白分型和细胞遗传学分析的敏感性较差，且在检测多态性方面存在局限性。^7,

方案

1. 通过多参数荧光激活细胞分选法分离造血骨髓细胞

1. 样品染色
   1. 在开始该流程之前，需要收集并准备好以下物品：
      1. 用于单个核细胞制备的梯度介质（GM），50 mL 圆锥形管
      2. 用于细胞染色的12 x 75 mm流式管
      3. 染色缓冲液：磷酸盐缓冲液（PBS）+ 3% 胎牛血清（FCS）
      4. 移液器
      5. FC封闭液及染色抗体（CD34 APC、CD36 FITC、CD45 V450，BD Biosciences）。该荧光染料组合在其他检测通道中的溢出可忽略不计，但也可使用其他合适的荧光染料组合。
      6. 补偿微珠（如需要）
      7. 悬浮缓冲液：Hank's 平衡盐溶液 (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS
      8. 台盼蓝和血细胞计数板
      9. 收集管：可使用任何含高血清的富集培养基管（含1 mL FCS + 25 mM HEPES）来收集分选后的细胞。
      10. 骨髓样本：通常需要获得患者关于从髋骨后部髂嵴进行骨髓活检的知情同意。骨髓样本采集后应保存在含肝素的注射器中，于室温下避光保存直至染色。以下实验步骤均依照本机构人类研究伦理委员会关于人类受试者福利的相关指南执行。
   2. 制备骨髓样本的单细胞悬液。向离....

结果

通过FACS细胞分选分离淋系-造血祖细胞

本文展示了为后续 STR 分析而分选所需细胞群的结果。骨髓细胞使用 V450 标记的抗 CD45 抗体、FITC 标记的抗 CD36 抗体以及 APC 标记的抗 CD34 抗体进行染色。目标细胞群为巨核细胞-红系祖细胞（MEP），即负责红细胞发育的有核细胞。这些细胞表达 CD36，但不表达白细胞共同抗原 CD45（图 1C）。如有需要，可根据其 CD36 表达水平进一步区分这些细胞。此外还可分选多个其他细胞群作为对照。我们分选了 CD45+CD34+ 淋巴样/髓样前体细胞作为另一群祖细胞，并分选 CD45+ 且具有高侧向散射（SSC）信号的细胞作为成熟髓样细胞（图 1D）。分选使用 BD FACSAria I 仪器完成。分选后，红系祖细胞纯度 >85%（

讨论

本研究的目的是为读者提供两种方法的结合，用于分析接受造血干细胞移植（HSCT）治疗血红蛋白病患者红系祖细胞中的供者/受者嵌合状态：1）对骨髓样本中的造血祖细胞进行荧光激活细胞分选，随后进行短串联重复序列分析；2）骨髓细胞的集落形成单位培养，将集落分类为不同类型的祖细胞，再进行短串联重复序列分析。该方法的新颖之处在于将这两种技术结合到一个实验流程中，以评估单个集落内的供者/受者嵌合情况。

该方法的特殊重要性体现在接受造血干细胞移植（HSCT）治疗血红蛋白病患者后出现的混合嵌合状态背景下。多项研究已表明，相当一部分患者体内供体髓系细胞比例较低，且与红系前体细胞的比例相一致，从而导致长期稳定的混合性造血嵌合^3,11；相比之下，在这些患者中，供体来源的红细胞比例显著更高（比成熟白细胞高出2至5倍），提示无效红细胞生成发生在红系发育的较晚阶段。这些现象被认为与供体有核红细胞前体易于加速凋亡，以及残留的T细胞和B细胞持续存在从而允许混合异基因移植物共存有关

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ficoll-Paque	GE Healthcare	GE17-1440-02	去除红细胞
50 mL 圆底离心管	Falcon	14-432-22	样品制备
12 x 75 mm 流式管	Falcon	352002	FACS 分选
磷酸盐缓冲液	Gibco	10010023	PBS
胎牛血清	Invitrogen Inc.	16000-044	FCS（热灭活）
CD34 APC	BD Bioscience	561209	FACS 抗体
CD36 FITC	BD Bioscience	555454	FACS 抗体
CD45 V450	BD Bioscience	642275	FACS 抗体
台盼蓝	Gibco	15250061
血细胞计数板	Invitrogen Inc.	C10227	自动细胞计数
Hank’s 平衡盐溶液	Gibco	14025092	FACS 分析中的悬浮缓冲液
HEPES	Gibco	15630080	悬浮缓冲液组分
FcR	BD Bioscience	564220	封闭 FcR
FACS Aria I	BD Bioscience	23-11539-00	FACS 分选仪
重组 人促红细胞生成素	Affimetrix eBioscience	14-8992-80	EPO
Isocove’s 改良 Dulbecco’s 培养基	Gibco	12440053	IMDM
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030-081	培养基组分
CD34+ 磁珠	Milteny Biotech	130-046-702	CD34+ 纯化
重组 人 G-CSF	Gibco	PHC2031	CFU-检测
重组 人 SCF	Gibco	CTP2113	CFU-检测
重组 人 GM-CSF	Gibco	PHC2015	CFU-检测
重组 人 IL-3	BD Bioscience	554604	CFU-检测
重组 人 IL-6	BD Bioscience	550071	CFU-检测
Methocult H4434 培养基	Stemcell Technologies	4444	CFU-检测
QiAmp 血液DNA提取试剂盒	Qiagen	51306	DNA 提取
Nanodrop ND-1000 分光光度计	Thermo Scientific	ND 1000	DNA 定量
无DNA酶的 H2O	Thermo Scientific	FEREN0521	DNA 制备
AmplTaq Gold DNA 聚合酶	Applied Bioscience	N8080240	PCR
Eppendorf Mastercycler gradient	Eppendorf	6321000019	PCR
Hi-Di 甲酰胺	Applied Bioscience	4311320	PCR
GeneScan 500 ROX 大小标准品	Applied Bioscience	4310361	PCR
3130 遗传分析仪	Applied Bioscience	313001R	PCR