方法文章

植物原生质体mRNA相互作用组捕获

DOI：

10.3791/56011

⸱

2017年7月28日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, KU Leuven

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种应用于Arabidopsis thaliana叶肉原生质体的相互作用组捕获方案。该方法关键依赖于体内紫外线交联，可从生理环境中分离并鉴定植物信使RNA结合蛋白。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA结合蛋白（RBPs）决定RNA的命运。它们参与所有RNA的生成途径，尤其在信使RNA（mRNAs）的转录后基因调控（PTGR）中发挥重要作用。近年来，通过一种名为“mRNA互作组捕获”（mRNA interactome capture）的新方法，已成功从酵母和哺乳动物细胞系中分离出多个与mRNA结合的蛋白质组，该方法能够直接从生理环境中鉴定出与mRNA结合的蛋白（mRBPs）。该方法包括体内（in vivo）紫外（UV）交联、利用寡聚dT（oligo(dT)）磁珠下拉并纯化信使核糖核蛋白复合物（mRNPs），以及随后通过质谱（MS）对交联蛋白进行鉴定。最近，采用相同方法，已从拟南芥（Arabidopsis）的不同组织来源——黄化幼苗、叶片组织、叶肉原生质体和培养的根细胞——同时报道了多个植物mRNA结合的蛋白质组。本文中，我们介绍了针对拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶肉原生质体优化的mRNA互作组捕获方法，这类细胞是开展多种细胞实验的多功能工具。获得最佳蛋白产量的条件包括起始组织的用量和UV照射时间。在中等规模实验（107个细胞）获得的mRNA结合蛋白质组中，已知具有RNA结合能力的RBPs显著富集，并鉴定出大量新的RBPs。该实验可进一步放大至大规模（109个细胞），且优化后的方法可应用于其他植物细胞类型和物种，以广泛分离、编目和比较植物中的mRNA结合蛋白质组。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

真核生物利用多种RNA生成调控途径来维持细胞的生物学过程。在已知的RNA类型中，信使RNA（mRNA）具有高度多样性，携带蛋白质及其同工型的编码信息1。转录后基因调控（PTGR）通路决定了前体mRNA（pre-mRNA）的命运2,3。来自不同基因家族的RNA结合蛋白（RBP）调控RNA的代谢过程，在PTGR中，特定的mRNA结合蛋白（mRBP）通过与mRNA直接的物理相互作用引导其命运，形成具有功能的信使核糖核蛋白复合物（mRNP）。因此，鉴定和表征mRBPs及其mRNPs对于理解细胞内mRNA代谢调控机制至关重要2。在过去三十年中，多种体外（in vitro）方法——包括RNA电泳迁移率变动分析（REMSA）、基于文库构建体的指数富集配体系统进化分析（SELEX）、RNA Bind-n-Seq（RBNS）、放射性标记或定量荧光RNA结合分析、X射线晶体学以及核磁共振波谱法（NMR）4,5,6,7,

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 拟南芥 叶肉原生质体的分离

注意：Arabidopsis 叶肉原生质体的分离基本按照 Yoo et al., 2007 的方法进行，并进行了若干修改40。

  1. 植物的生长
    1. 将约200 拟南芥 Col-0 生态型种子在无菌水中于 4 ℃ 避光放置 2 天 °在黑暗中于4°C下进行春化处理。
      注：此数量的种子足以用于一个非CL样本和一个CL样本（参见步骤1.3）。
    2. 准备 pots，加入 50%（体积比（v/v）) 土壤与蛭石的混合物，并用蒸馏水浸泡花盆所在的托盘以润湿土壤。
    3. 将分层处理的种子播种并均匀撒在湿润的土壤表面。不要用额外的土壤覆盖种子，因为 拟南芥 种子萌发需要光照。
      注意：植物生长条件为23℃下12小时光照/12小时黑暗循环。 °C，光照强度为100 µmol m-2 s-1在生长室中培养5周至开花前。4周大的植株也可使用40.
      注意：从步骤1.2.1到步骤3.2.3中所述的所有材料和试剂适用于两个样本（即，

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在使用洗涤缓冲液2进行第4.3步洗涤时，我们观察到CL样品中珠粒沉淀周围出现特征性的晕环（图1B）。尽管该现象尚未被深入研究，但可能归因于交联的mRNP复合物在磁力捕获过程中干扰了珠粒的聚集，从而形成更为弥散的聚集体。这一现象表明寡核苷酸-d(T)25 珠粒捕获是有效的14。

在非交联（non-CL）对照样本和交联（CL）样本中，UBQ10 参考 mRNA 的水平显著高于 18S rRNA，如图 1C所示。这表明由于 oligo-d(T)25 磁珠仅能结合带有 poly(A) 尾的 mRNA，mRNA 在洗脱液中得到了富集。oligo-d(T)25 磁珠捕获的效率进一步通过 SDS-PAGE 和银染（步骤.......

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讨论

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我们成功地将最初为酵母和人类细胞开发的mRNA互作组捕获技术应用于植物叶片叶肉原生质体。叶片叶肉细胞是植物叶片中基本组织的主要类型。该方法的主要优势在于利用体内交联，直接从生理环境中发现结合蛋白。

在本实验方案中，我们主要介绍了一系列优化的实验条件（例如， 原生质体的起始数量以及紫外照射的持续时间50. CL 样品中捕获的蛋白质只有在起始细胞数量不少于 107 原生质体（中等规模）被使用（步骤1.5.5）。较低浓度在SDS-PAGE上无法产生可观察的mRBP条带，可能不应用于后续的蛋白质组学分析。实际上，使用超过107 细胞（例如， 109 在大规模实验中也是可行的20银染实验结果表明，以 0.00875 W/cm² 的强度进行 1 分钟紫外照射2 由连续波紫外光源产生的强度为最佳（图1D.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 Joris Winderickx 教授实验室提供了配备常规紫外灯的紫外交联装置。K. G. 由鲁汶大学（KU Leuven）研究基金资助，并获得 FWO 项目 G065713N 的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
0.8 M 甘露醇SigmaM1902-500G初级等渗酶溶液 &
MMg 溶液
2 M KClMERCKArt. 4935初级等渗酶溶液 &
W5 缓冲液
0.2 M MES (pH 5.7)
(4-吗啉乙磺酸)		Sigma-aldrichM2933初级等渗酶溶液，
W5 缓冲液 &
MMg 溶液，
过滤除菌
纤维素酶 R10Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.CELLULASE
“ONOZUKA”
R-10, 10 g		终末等渗酶溶液
离析酶 R10Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.MACEROZYME R-10, 10g终末等渗酶溶液
10% (w/v) BSA
(牛血清白蛋白)		Sigma-aldrichA7906-100G终末等渗酶溶液 &
过滤除菌
1 M CaCl2Chem-Lab NVCL00.0317.1000终末等渗酶溶液，
W5 缓冲液 &
消化缓冲液
1 M NaClFisher ChemicalS/3160/60W5 缓冲液
2 M MgCl2SigmaM8266-100GMMg 溶液
1 M LiCl
(氯化锂)		Acros199885000裂解/结合缓冲液，
洗涤缓冲液 1，
洗涤缓冲液 2 &
低盐缓冲液
5% (w/v) LiDS
(十二烷基硫酸锂)		Sigma-aldrichL4632-25G裂解/结合缓冲液，
洗涤缓冲液 1 &
过滤除菌
1 M DTT
(二硫苏糖醇)		Thermo Fisher Scientific
洗涤缓冲液 1 &
洗涤缓冲液 2		307866裂解/结合缓冲液，
1 M Tris-HCl (pH 7.5) (三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，盐酸 (HCl))Acros &
Fisher Chemical		167620010 &
H/1200/PB15		裂解/结合缓冲液，
洗涤缓冲液 1，
洗涤缓冲液 2，
低盐缓冲液 &
洗脱缓冲液
0.5 M EDTA (pH 8.0) (乙二胺四乙酸)Sigma-aldrichED-500G裂解/结合缓冲液，
洗涤缓冲液 1，
洗涤缓冲液 2，
低盐缓冲液 &
洗脱缓冲液
Tween 20MERCK8.22184.0500寡聚脱氧胸苷酸-d(T)25 磁珠再生
0.1 M NaOHVWR PROLABO CHEMICALS28244.295寡聚脱氧胸苷酸-d(T)25 磁珠再生
1x PBS (pH 7.4)
(磷酸盐缓冲液)
含
(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)		Fisher Chemical, MERCK,
Sigma-aldrich & SAFC		S/3160/60,
Art. 4935,
71640-250G &
60230		寡聚脱氧胸苷酸-d(T)25 磁珠再生
蛋白酶 K 溶液 (2 μg/μL)Thermo Fisher Scientific11789020蛋白质消化
上样染料InvitrogenLC5925SDS-PAGE
qPCR 预混液PromegaA6001qRT-PCR 检测
RNase CocktailThermo Fisher ScientificAM2286RNA 消化
甲醇Sigma-aldrich322415凝胶固定与脱色
乙酸Sigma-aldrich537020凝胶固定与脱色
考马斯亮蓝 R-250Thermo Fisher Scientific20278凝胶染色
1 M NH4HCO3
(碳酸氢铵)
 		Sigma-aldrich09830-500G凝胶水合 &
消化缓冲液
CH3CN
(乙腈)		Sigma-aldrich34851-100ML凝胶脱水 &
肽溶解液
IAA
(碘乙酸)		Sigma-aldrichI4386-10G烷基化试剂
TFA
(三氟乙酸)		Sigma-aldrich302031-10X1ML肽溶解液
FA
(甲酸)		Sigma-aldrich06554-5G肽提取
胰蛋白酶溶液 (6 ng/μL)PromegaV5280消化缓冲液
名称公司货号备注
仪器
土壤PeltracomLP2D植物生长
蛭石 3Sibli AS05VERMICULIET植物生长
培养皿 (150 x 20 mm)Sarstedt82.1184.500原生质体悬浮液载体
0.22 μm 滤膜MilliporeSE2M229104终末等渗酶溶液均质化
剃刀片Agar ScientificT585莲座叶条切割
35-75 μm 尼龙筛网SEFAR NITEX74010原生质体悬浮液过滤
50 mL 圆底管Sigma-aldrichT1918-10EA原生质体悬浮液载体
血细胞计数板
(Bürker 血细胞计数板)		MARIENFELD650030原生质体细胞计数
紫外交联装置
(HL-2000 HybriLinker)		UVP, LLCUVP95003101体内 紫外交联
紫外灯
(Sankyo-Denki G8T5)		SANKYO
DENKI		SD G8T5体内 紫外交联
50 mL 玻璃注射器FORTUNA OptimaZ314560原生质体裂解物均质化
细针头 (0.9 x 25 mm)Becton Dickinson microlance 32021-04原生质体裂解物均质化
旋转混合仪 L26 型Labinco BV26110912样品旋转孵育
寡聚脱氧胸苷酸-d(T)25 磁珠
(5 mg/mL)		New England BioLabsS1419SmRNPs 和 mRNAs 结合与下拉
磁力架InvitrogenCS15000mRNPs 和 mRNAs 结合与下拉
离心过滤装置
(Amicon Ultra-4 离心过滤装置)		EMD MilliporeUFC800308mRBP 浓缩
Pierce 银染试剂盒Thermo Fisher Scientific24612银染检测
RNA 纯化试剂盒
(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)		STRATEC Molecular1064100300RNA 纯化
分光光度计 (NanoDrop 1000 分光光度计)Thermo Fisher ScientificND-1000RNA 质量与数量
实时 PCR 仪
(StepOne 实时 PCR 仪)		Thermo Fisher Scientific4376600cDNA 定量
µ-C18 柱
(Millipore Zip Tip µ-C18 柱)		Sigma-aldrich720046-960EA肽纯化
质谱仪
(Q Exactive 混合四极杆-轨道阱质谱仪)		Thermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZR基于质谱的蛋白质组学
液相色谱仪 (Ultimate 3000 超高效液相色谱 (UHPLC) 仪)Thermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANO基于质谱的蛋白质组学
C18 柱
(Easy Spray Pepmap RSLC C18 柱)		Thermo Fisher ScientificES800基于质谱的蛋白质组学
C18 预柱
(Acclaim Pepmap 100 C18 预柱)		Thermo Fisher Scientific160321基于质谱的蛋白质组学
名称公司货号备注
qRT-PCR 检测引物序列
UBQ10 mRNA
(Li 等, 2014)		Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG
Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA
18S rRNA
(Durut 等, 2014)		Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG
Rv: CACGACCCGGCCAATTA

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 533-544 (2015).
  2. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582

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dT RNA

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