植物原生质体mRNA相互作用组捕获

摘要

本文介绍了一种应用于Arabidopsis thaliana叶肉原生质体的相互作用组捕获方案。该方法关键依赖于体内紫外线交联，可从生理环境中分离并鉴定植物信使RNA结合蛋白。

摘要

RNA结合蛋白（RBPs）决定RNA的命运。它们参与所有RNA的生成途径，尤其在信使RNA（mRNAs）的转录后基因调控（PTGR）中发挥重要作用。近年来，通过一种名为“mRNA互作组捕获”（mRNA interactome capture）的新方法，已成功从酵母和哺乳动物细胞系中分离出多个与mRNA结合的蛋白质组，该方法能够直接从生理环境中鉴定出与mRNA结合的蛋白（mRBPs）。该方法包括体内（in vivo）紫外（UV）交联、利用寡聚dT（oligo(dT)）磁珠下拉并纯化信使核糖核蛋白复合物（mRNPs），以及随后通过质谱（MS）对交联蛋白进行鉴定。最近，采用相同方法，已从拟南芥（Arabidopsis）的不同组织来源——黄化幼苗、叶片组织、叶肉原生质体和培养的根细胞——同时报道了多个植物mRNA结合的蛋白质组。本文中，我们介绍了针对拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶肉原生质体优化的mRNA互作组捕获方法，这类细胞是开展多种细胞实验的多功能工具。获得最佳蛋白产量的条件包括起始组织的用量和UV照射时间。在中等规模实验（10⁷个细胞）获得的mRNA结合蛋白质组中，已知具有RNA结合能力的RBPs显著富集，并鉴定出大量新的RBPs。该实验可进一步放大至大规模（10⁹个细胞），且优化后的方法可应用于其他植物细胞类型和物种，以广泛分离、编目和比较植物中的mRNA结合蛋白质组。

引言

真核生物利用多种RNA生成调控途径来维持细胞的生物学过程。在已知的RNA类型中，信使RNA（mRNA）具有高度多样性，携带蛋白质及其同工型的编码信息¹。转录后基因调控（PTGR）通路决定了前体mRNA（pre-mRNA）的命运^2,3。来自不同基因家族的RNA结合蛋白（RBP）调控RNA的代谢过程，在PTGR中，特定的mRNA结合蛋白（mRBP）通过与mRNA直接的物理相互作用引导其命运，形成具有功能的信使核糖核蛋白复合物（mRNP）。因此，鉴定和表征mRBPs及其mRNPs对于理解细胞内mRNA代谢调控机制至关重要²。在过去三十年中，多种体外（in vitro）方法——包括RNA电泳迁移率变动分析（REMSA）、基于文库构建体的指数富集配体系统进化分析（SELEX）、RNA Bind-n-Seq（RBNS）、放射性标记或定量荧光RNA结合分析、X射线晶体学以及核磁共振波谱法（NMR）^4,5,6,7,8,9——已被广泛应用于主要来源于哺乳动物细胞的RBP研究。这些哺乳动物RBP研究结果可通过RNA结合蛋白数据库（RBPDB）进行检索，该数据库汇总了已发表的实验观察数据¹⁰。

尽管这些体外方法是强大的工具，但它们仅能从给定的RNA序列库中确定结合的RNA基序，因此在发现新的靶标RNA方面存在局限性。基于蛋白质序列和结构保守性的计算策略在预测全基因组范围内的RNA结合蛋白（RBP）时也存在同样的局限¹⁵。为克服这一限制，已建立一种新的实验方法，可鉴定目标RBP所相互作用的RNA基序，并确定其结合的精确位置。该方法称为“交联与免疫沉淀”（CLIP），包括体内紫外（UV）交联，随后进行免疫沉淀¹¹。早期研究表明，DNA和RNA核苷酸在激发波长超过245 nm的紫外光照射下可发生光活化反应。其中，胸苷酸的反应最为有利（光反应活性递减顺序：dT ≥ dC > rU > rC, dA, dG）¹²。使用波长为254 nm（UV-C）的紫外光照射时，当RNA核苷酸与蛋白质残基之间的距离仅为数埃（Å）时，即可形成共价键。因此，该现象被称为RNA与RBP的“零长度”交联。随后可进行严格的纯化步骤，背景信号极低^13,14。

一种与CLIP互补的策略是结合 在活体中 通过蛋白质鉴定的紫外交联技术描述RNA结合蛋白的图景。已有多种此类全基因组范围的mRNA结合蛋白质组从酵母细胞、胚胎干细胞（ESCs）和人类细胞系中分离获得。即， HEK293 和 HeLa）中应用这一新型实验方法，称为 "mRNA相互作用组捕获"^18,19,20,21该方法包括 在体内 紫外线交联结合mRNP纯化及基于质谱的蛋白质组学分析。通过应用该策略，已鉴定出大量新的 "双功能蛋白" 含有非经典RNA结合结构域（RBDs）的RNA结合蛋白（RBPs）已被发现，且越来越多的证据表明具有RNA结合能力的蛋白质数量远超此前预期^15,16,17该方法的使用为研究RNA结合蛋白（RBPs）时开展新的应用和回答新的生物学问题提供了可能。例如，最近一项研究探讨了酵母与人类细胞之间mRNA结合蛋白组（核心RBP蛋白组）的保守性。²².

植物RBPs已被发现参与生长和发育（例如，参与开花时间的转录后调控、昼夜节律以及线粒体和叶绿体中的基因表达^{24,25,26,27,28,29}此外，它们被认为在响应非生物胁迫的细胞过程中发挥功能（例如， 低温、干旱、盐胁迫和脱落酸（ABA）^31,32,33,34。在预测中，有超过200个RBP基因 拟南芥 基因组，基于RNA识别基序（RRM）和K同源（KH）结构域序列基序；在水稻中，已发现约250个^35,36值得注意的是，许多预测的RNA结合蛋白似乎是植物所特有的（例如， 无后生动物中约50%预测蛋白的直系同源物 拟南芥 含有RRM结构域的RNA结合蛋白（RBPs）³⁵，表明其中许多可能具有新的功能。大多数预测的 RNA 结合蛋白的功能仍有待阐明²³.

从与mRNA结合的蛋白质组中分离 拟南芥 通过使用mRNA互作组捕获技术，最近已报道了去黄化幼苗、叶片组织、培养的根细胞以及叶肉原生质体中的mRNA结合蛋白组^38,39这些研究展示了近期系统性编目植物中功能性 RBPs 的巨大潜力。本文中，我们提供了一种从植物原生质体中进行 mRNA 互作组捕获的实验方案（即， 无细胞壁的细胞。 拟南芥 叶肉原生质体是叶片细胞的主要类型。分离得到的原生质体可使紫外线充分穿透细胞。该细胞类型可用于瞬时表达蛋白质的功能鉴定实验。^40,41此外，原生质体分离技术已应用于多种其他植物细胞类型和物种^42,43,44 (例如， Petersson 等，2009；Bargmann 和 Birnbaum，2010；以及 Hong 等., 2012).

该方法共包含 11 个步骤（图 1A）。首先分离 Arabidopsis 叶肉原生质体（步骤 1），随后进行紫外线（UV）照射以形成交联的信使核糖核蛋白复合物（mRNPs）（步骤 2）。当原生质体在变性条件下裂解时（步骤 3），交联的 mRNPs 被释放到裂解/结合缓冲液中，并通过寡聚脱氧胸苷酸磁珠（oligo-d(T)₂₅ beads）进行富集（步骤 4）。经过多轮严格洗涤后，纯化 mRNPs 并进行进一步分析。在蛋白酶 K 消化去除与 mRNA 交联的 mRNA 结合蛋白（mRBPs）的变性肽段后，纯化交联的 mRNA，并通过定量反转录 PCR（qRT-PCR）验证 RNA 质量（步骤 5 和 6）。经过 RNase 处理和蛋白浓缩（步骤 7）后，通过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和银染检测蛋白质量（步骤 8）。交联样本（CL）与未交联样本（non-CL；即未经 UV 照射的原生质体阴性对照样本）之间的蛋白条带模式差异可被清晰观察到。蛋白质的鉴定通过基于质谱的蛋白质组学实现。CL 样本中的蛋白质通过一维聚丙烯酰胺凝胶电泳（1D-PAGE）分离，以去除可能的背景污染，随后在凝胶内使用胰蛋白酶将蛋白质酶解为短肽，并进行纯化（步骤 9）。纳米级反相液相色谱联用质谱（nano-LC-MS）可用于确定 mRNA 结合蛋白质组中可靠蛋白质的数量（步骤 10）。最后，通过生物信息学分析对鉴定出的 mRBPs 进行表征和编目（步骤 11）。

方案

1. 拟南芥 叶肉原生质体的分离

注意：Arabidopsis 叶肉原生质体的分离基本按照 Yoo et al., 2007 的方法进行，并进行了若干修改⁴⁰。

1. 植物的生长
   1. 将约200 拟南芥 Col-0 生态型种子在无菌水中于 4 ℃ 避光放置 2 天 °在黑暗中于4°C下进行春化处理。
      注：此数量的种子足以用于一个非CL样本和一个CL样本（参见步骤1.3）。
   2. 准备 pots，加入 50%（体积比（v/v）) 土壤与蛭石的混合物，并用蒸馏水浸泡花盆所在的托盘以润湿土壤。
   3. 将分层处理的种子播种并均匀撒在湿润的土壤表面。不要用额外的土壤覆盖种子，因为 拟南芥 种子萌发需要光照。
      注意：植物生长条件为23℃下12小时光照/12小时黑暗循环。 °C，光照强度为100 µmol m^-2 s^-1在生长室中培养5周至开花前。4周大的植株也可使用⁴⁰.
      注意：从步骤1.2.1到步骤3.2.3中所述的所有材料和试剂适用于两个样本（即， 一个非交联样本（未接受紫外-C照射的对照样本）和一个交联样本（接受紫外-C照射的实验样本）
2. 等渗酶溶液的制备
   1. 配制80 mL初代等渗酶溶液（400 mM甘露醇、20 mM KCl和20 mM MES缓冲液（pH 5.7）），并立即在60℃水浴中加热该溶液 °C孵育箱中孵育10分钟。
   2. 加入 1.2 g 纤维素酶 R10（w/v 1.5%) 和 0.32 克 Macerozyme R10 (w/v 将0.4%的粉末加入温热的等渗初酶溶液中。
   3. 通过轻轻搅拌使酶粉末充分溶解。将溶液迅速加热至60 °在C孵育箱中孵育10分钟，直至酶溶液变为澄清的浅棕色。
   4. 将溶液在冰上冷却 3 分钟，然后加入 800 µ1 M CaCl₂ 溶液₂ 和 800 µ10% 的 Lw/v) 将 BSA 加入溶液中。
   5. 通过移液并经0.22-µm 滤器。将此最终等渗酶溶液分装至两个大尺寸培养皿（150 mm × 20 mm）中。
3. 制备 拟南芥 莲座叶条
   注意：每个培养皿建议放置150片叶片，适用于一个非CL样本或一个CL样本。
   1. 选择并剪取总共 300 片完全展开的 2^nd- 或 3^rd将一对真叶（平均每莲座丛3-4片）用新的锋利剃须刀片切成0.5至1毫米宽的叶条。
   2. 立即将条带转移并浸入等渗酶溶液中。
      注意：为避免接触光线，务必用铝箔覆盖培养皿。不要压碎叶片。确保所有条带均浸没于溶液中，不得漂浮于液面。
4. 分离 拟南芥 叶肉原生质体
   1. 将覆盖有铝箔的培养皿放入真空干燥器中，在真空条件下对叶片条段进行30分钟的渗透处理。随后，将培养皿置于室温下避光静置孵育2.5小时。
   2. 用手轻轻且短暂地水平晃动培养皿，尽量使原生质体完全释放到酶溶液中。
5. 原生质体的收获与计数
   1. 将原生质体悬浮液通过35至75 µ尼龙滤膜（孔径为 m）。将每个样品的滤液分装到两个 50 mL 的圆底管中（每管约 20 mL 滤液）。
   2. 用10 mL W5缓冲液（154 mM NaCl，125 mM CaCl₂）冲洗每个培养皿₂，5 mM KCl 和 2 mM MES 缓冲液（pH 5.7））将剩余的原生质体转移至酶解液中。将每份样品的 10 mL 滤液加入各离心管中。用铝箔纸包裹离心管，并置于冰上保存。
   3. 将四个管中的样品在100 × g下离心5分钟，使原生质体沉淀。弃去上清液，每管中加入10 mL W5缓冲液，轻轻重悬原生质体沉淀。
      注意：重悬原生质体沉淀时，应轻轻将离心管倒置，并用手轻轻旋转管体，直至沉淀完全消失。切勿直接用移液器吹打沉淀，以免损伤细胞。
   4. 重复步骤1.5.3一次，将每个样本两支试管中的原生质体悬液合并至一个50 mL圆底管中。将试管置于冰上保存。
   5. 使用血细胞计数板对原生质体进行计数。
      注意：每 25 个立方体中的 20 个细胞相当于 2 x 10⁵ 原生质体/mL。150片叶片应可获得约1 x 10⁷ 细胞。调整非交联（non-CL）和交联（CL）样品中的原生质体总数相等。
   6. 将原生质体置于冰上静置30分钟。随后，以100 × g离心5分钟。弃去上清液，每管中用20 mL MMg溶液（400 mM甘露醇，15 mM MgCl₂）重悬原生质体。₂，以及 4 mM MES 缓冲液（pH 5.7）

2. 通过紫外照射进行体内 mRNA-蛋白质交联

注意：将非交联（non-CL）样品管置于冰上。交联（CL）样品必须立即进行紫外（UV）照射。

1. 将含有 1 x 10⁷ 个细胞的原生质体悬液从 CL 样品管转移至一个新的大尺寸培养皿（150 mm x 20 mm）中，并加入 30 mL 冰冷的 MMg 溶液以覆盖整个培养皿表面。通过轻柔吹打使细胞在 MMg 缓冲液中均匀分散。立即将未加盖的培养皿放入紫外交联仪中。
   注意：紫外灯与培养皿之间的距离为 8 cm。
2. 使用波长为 254 nm、紫外强度为 0.00875 W/cm² 的紫外光照射样品 1 分钟、3 分钟或 5 分钟。照射结束后，迅速将原生质体悬液等分至两个新的 50 mL 圆底离心管中。用额外的 5 mL 冰冷 MMg 溶液冲洗培养皿底部，以收集残留的原生质体，并将此细胞悬液加入上述两根离心管中。
   注意：1 分钟被确定为最佳条件，相关解释见代表性结果部分。

3. 变性条件下原生质体裂解

1. 裂解用原生质体沉淀的制备
   1. 将未交联（non-CL）样品管与步骤2中的两个交联（CL）样品管一同在100 × g下离心5分钟，弃去上清液。将未交联样品的原生质体沉淀管放回冰上。
   2. 向每个交联样品管中加入10 mL预冷的MMg溶液，轻轻重悬沉淀，并合并至一个50 mL圆底管中。在100 × g下离心5分钟。去除上清液后，将交联样品的原生质体沉淀置于冰上保存。
2. 原生质体裂解及裂解液均质化
   1. 向每个样品的细胞沉淀中加入9 mL预冷的裂解/结合缓冲液（500 mM LiCl，0.5%（w/v）十二烷基硫酸锂（LiDS），5 mM二硫苏糖醇（DTT），20 mM Tris-HCl（pH 7.5），1 mM EDTA（pH 8.0））。通过上下吹打约20次，粗略裂解原生质体，直至悬浮液呈均匀的浅绿色。
   2. 将原生质体裂解液用带有细针头（0.9 × 25 mm²）的50 mL玻璃注射器推注两次，以实现均质化。将裂解液在冰上孵育10分钟。用液氮速冻裂解液，并于-80 °C保存，最长可保存3周。

4. 使用寡聚-d(T)₂₅ 磁珠进行mRNP的下拉与纯化

注意：以下从步骤4.1到步骤4.4所述的所有材料和试剂仅适用于一个样本（即， 一个非交联样品或一个交联样品）。在弃去含珠子的上清液裂解/结合缓冲液后，必须立即将原生质体裂解液加入含有珠子的离心管中。

1. 用于寡核苷酸(dT)捕获的寡聚-d(T)₂₅ 磁珠的制备
   1. 在室温下解冻冷冻的原生质体裂解液。当裂解液完全解冻后，将裂解液管置于冰上。
   2. 在冰上，将1.8 mL的寡聚-d(T)₂₅ 磁珠（5 mg/mL）分装至6个新的2 mL圆底微量离心管中。每管中加入600 µL裂解/结合缓冲液，通过轻微吹打混匀，并在4 °C下轻轻旋转孵育2 min，使磁珠悬浮液均匀洗涤。保持磁珠在冰上。
2. 结合
   1. 将含有磁珠的6个管置于4 °C的磁力架上3 min，使磁珠被磁力吸附至管壁，从而澄清悬浮液。
      注：将管子放入磁力架后，需等待磁珠完全吸附，至少3 min。
   2. 弃去上清液，并立即将9 mL原生质体裂解液分装至这6个管中。通过吹打充分混匀，直至形成均匀的棕色悬浮液，并在4 °C下轻轻旋转孵育1 h。
      注：建议孵育时间为30 min至1 h。
3. 洗涤
   1. 将管子再次放回4 °C的磁力架上3 min。当所有磁珠吸附至管壁后，将原生质体裂解液收集至6个新的2 mL圆底微量离心管中，并暂时在4 °C下保存。切勿立即弃去原生质体裂解液；保持在4 °C下。
   2. 每管中加入1.5 mL预冷的洗涤缓冲液1（500 mM LiCl，0.1% (w/v) LiDS，5 mM DTT，20 mM Tris-HCl (pH 7.5)，1 mM EDTA (pH 8.0)）。重悬磁珠，并轻轻旋转1 min。将管子再次放回4 °C磁力架上3 min，弃去上清液。用洗涤缓冲液1重复洗涤一次。
   3. 使用1.5 mL预冷的洗涤缓冲液2（500 mM LiCl，5 mM DTT，20 mM Tris-HCl (pH 7.5)，1 mM EDTA (pH 8.0)）重复上述洗涤步骤两次，再使用1.5 mL预冷的低盐缓冲液（200 mM LiCl，20 mM Tris-HCl (pH 7.5)，1 mM EDTA (pH 8.0)）洗涤一次。
      注：若mRNP已从原生质体裂解液中有效分离，则在使用洗涤缓冲液2洗涤时，CL样品中的磁珠沉淀周围应可见“晕环”现象（图1B）。
4. 洗脱
   1. 每管中加入500 µL洗脱缓冲液（20 mM Tris-HCl (pH 7.5)，1 mM EDTA (pH 8.0)）。轻轻重悬磁珠，并在50 °C下孵育3 min，以释放带有poly(A)尾的RNA。通过吹打轻轻重悬磁珠一次。将管子再次放回4 °C磁力架上5 min。
   2. 将所有洗脱液（总计约3 mL）转移并合并至一个洁净、无RNase的15 mL锥形离心管中，置于冰上。
      注：可立即使用分光光度计测定RNA的质量与浓度。
      注：每个样品的RNA浓度约为10 ng/µL，A₂₆₀/A₂₈₀ 比值约为1.9。A₂₆₀/A₂₈₀ 比值应在1.6至2.0之间，因为分离的poly(A)尾RNA纯度通常高于70%。若RNA浓度过低，可将起始原生质体数量增至最多10⁹个。样品可用液氮速冻，并在–80 °C下长期保存。
   3. 重复步骤4.2至4.4，额外进行两轮操作，并重复使用寡聚-d(T)₂₅ 磁珠，以从原生质体裂解液中进一步耗尽poly(A)尾RNA。
      注：经过三轮pull-down操作后，每个非CL或CL样品应共获得9 mL洗脱液。所有操作均需在4 °C下进行，以避免RNA降解。根据需要，执行步骤4.5或4.6以重复使用或再生磁珠。
5. 重复使用的寡聚-d(T)₂₅ 磁珠的制备
   1. 用1 mL预冷的洗脱缓冲液洗涤磁珠两次，再用1 mL预冷的裂解/结合缓冲液洗涤一次，以将LiCl盐浓度重新调整至500 mM。
   2. 执行步骤4.4，弃去上清液，将各管中保存的原生质体裂解液转移回磁珠中，并重复步骤4.2至4.4，额外进行两轮操作。
6. 寡聚-d(T)₂₅ 磁珠的再生
   注：磁珠可储存并用于后续实验（最多可重复使用三次）。
   1. 执行步骤4.4，向磁珠中加入1 mL 0.1 M NaOH，室温下旋转孵育5 min。每管中依次用1 mL洗涤缓冲液1洗涤两次，再用含0.1% Tween-20的1×PBS（pH 7.4）洗涤三次，以平衡体系。将各管中的磁珠保存于300 µL含0.1% Tween-20的无RNase 1×PBS（pH 7.4）中，4 °C下长期保存。
      注：本实验中用于Arabidopsis CL样品的磁珠，下次仅可用于相同植物样品。

5. 蛋白酶K处理与mRNA纯化

1. 蛋白酶K处理
   1. 向每个样品的1 mL洗脱液中加入8 µL蛋白酶K溶液（2 µg/µL），以消化紫外交联的蛋白质。短暂涡旋混匀。
2. mRNA纯化
   1. 将洗脱液在37 °C下孵育1 h。使用RNA纯化试剂盒纯化RNA，以去除残留的杂质。
      注意：纯化后的RNA可直接用于qRT-PCR检测以评估RNA质量。
      注意：也可使用其他试剂盒，如RNA mini试剂盒或TRIzol试剂¹⁴。

6. qRT-PCR 检测

1. 逆转录
   1. 使用逆转录系统，以1 µg RNA作为模板，高效合成第一链cDNA。用无核酸酶的水将样品稀释至5 ng/µL。
2. 使用qRT-PCR定量cDNA
   1. 使用qPCR预混液和实时PCR仪，以10 ng cDNA作为模板，扩增并定量cDNA。采用以下PCR程序：95 °C 10 min（第一阶段，1个循环）；95 °C 15 s 和 60 °C 1 min（第二阶段，40个循环）。
      注：此处使用的参考基因为内源性内参基因UBQ10 (AT4G05320)。用于UBQ10和18S rRNA的qRT-PCR引物分别见Li et al., 2014 和 Durut et al., 2014^45,46。引物序列列于材料表中。

7. RNase 处理与 mRNA 结合蛋白浓缩

1. RNase 处理
   1. 向 8 mL 洗脱液中加入约 100 U 含有 RNase A 和 RNase T1 的 RNase 混合液。设置一个阴性对照样品，其中将洗脱液替换为无核酸酶水。短暂涡旋混匀后，在 37 °C 下孵育 1 小时。
2. mRBP 浓缩
   1. RNase 消化后，使用离心过滤装置浓缩洗脱液。最终体积为 75 µL，浓缩后每份样品的总蛋白产量约为 2 µg。将样品置于 -80 °C 下长期保存。

8. SDS-PAGE 和银染

1. SDS-PAGE
   1. 取25 µL浓缩洗脱液（CL样品）或对照样品（非CL样品），与15 µL 2倍上样缓冲液混合。在95 °C加热5分钟，然后上样至含有5%浓缩胶和12%分离胶的SDS-PAGE凝胶中，并同时加入蛋白分子量标记物。
   2. 以60 V电压浓缩蛋白40分钟，随后以160 V电压分离约1小时，直至上样染料迁移至分离胶底部。
2. 银染检测
   1. 用超纯水洗涤SDS-PAGE凝胶两次，每次5分钟。使用商用银染试剂盒对蛋白进行银染。
      注意：蛋白条带应在5分钟内显现。若条带在5分钟后才出现且颜色极浅，建议将起始原生质体数量增加至最多10⁹个。

9. 蛋白质条带的胰蛋白酶消化及肽段纯化

1. 胰蛋白酶消化
   注意：取各样品浓缩后的mRBP溶液另取25 µL进行1D-PAGE电泳，用于mRBP鉴定；银染凝胶不可用于后续分析，因其与质谱（MS）分析不兼容。
   1. 完成1D-PAGE电泳后，将凝胶置于固定液（50% (v/v) 甲醇和10% (v/v) 乙酸）中固定1小时。在染色液（0.1% (w/v) 考马斯亮蓝R-250，50% (v/v) 甲醇，10% (v/v) 乙酸）中染色20分钟，轻柔振荡。在脱色液（40% (v/v) 甲醇和10% (v/v) 乙酸）中脱色1小时。脱色完成后，将凝胶保存于5% (v/v) 乙酸中。
      注意：脱色过程中可更换新鲜脱色液，直至背景完全脱净。
   2. 切下目标条带，并进一步切成约1 mm³的小块，以利于后续胰蛋白酶消化和肽段提取。加入50 µL 100 mM 碳酸氢铵（NH₄HCO₃）溶液润湿凝胶小块，持续10分钟，确保完全覆盖凝胶块。
      1. 小心移除润湿液，加入乙腈（CH₃CN）脱水10分钟，随后小心移除乙腈溶液。
      2. 重复润湿至脱水步骤两次。最后移除乙腈溶液。
         注意：凝胶电泳时间取决于实验目的。较长的电泳时间有助于蛋白质的良好分离，便于切取特定染色条带进行后续分析。若目的是保留蛋白质并去除杂质，则较短的电泳时间已足够。
   3. 加入500 µL 6.6 mM DTT溶液，孵育凝胶小块10分钟。移除DTT溶液后，用500 µL 95% (v/v) 乙腈溶液洗涤凝胶小块两次。
      1. 洗涤后，移除乙腈溶液，在避光条件下加入500 µL 55 mM 碘乙酸（IAA）溶液，孵育10分钟。
      2. 孵育结束后，移除溶液，再次用500 µL 95% (v/v) 乙腈溶液洗涤凝胶小块，随后干燥凝胶小块。
   4. 用25 µL消化缓冲液（50 mM NH₄HCO₃，5 mM CaCl₂，6 ng/µL 胰蛋白酶）完全浸没凝胶小块，冰上放置45分钟，使胰蛋白酶充分渗透入凝胶。随后于37 °C过夜孵育，进行酶解消化。
2. 肽段纯化
   1. 向含凝胶小块的消化缓冲液中加入80 µL 50 mM NH₄HCO₃，反复涡旋以提取胰蛋白酶消化产生的肽段，收集提取液。再用80 µL 50% (v/v) CH₃CN 和 5% (v/v) 甲酸（FA）重复提取两次。
      注意：最终提取液总体积应约为240 µL。
   2. 合并提取液，通过真空浓缩或冻干浓缩至约10 µL，加入25 µL 0.1% (v/v) 三氟乙酸（TFA）水溶液。按照生产商说明书，使用µ-C18柱对样品进行脱盐处理。
   3. 用4–10 µL 60% (w/v) CH₃CN 和 0.1% (v/v) FA洗脱肽段。将肽段冻干（冷冻干燥），于-20 °C保存直至分析。

10. 纳升液相色谱-质谱联用

1. 纳米级反相液相色谱
   注意：使用与液相色谱仪在线联用的质谱仪进行 LC-MS 分析。该仪器应配备 C18 柱（2 µm颗粒，100 Å 孔径，以及50 µm × 15 cm）
   1. 将冻干的肽重悬于 16 µL 溶液（2%（体积比CH₃CN 和 0.1%（v/v) FA)。注入并上样 5 µ5 L 肽溶液，流速为 5 µL/min，使用C18预柱（3 µm 粒径，100 Å 孔径、nanoviper 和 75 µm × 2 cm）
   2. 10.1.2. 使用95分钟梯度以300 nL/min的流速分离肽段。在此分离梯度过程中，分别在5 min、50 min和18 min内将流动相B从4%升至10%、10%升至25%、25%升至45%。最后，在1 min内将流动相B急剧升至95%。每次95分钟分离梯度后，执行一步内置清洗程序，包含一个10分钟梯度，即在5 min内从4%升至95%。
      注意：流动相A为99.9% H₂O 和 0.1%（v/v) FA，流动相B为19.92% H₂O，80%（质量体积比（w/v）) CH₃CN 和 0.08%（体积比（v/v）FA
2. 质谱分析实验
   1. 以数据依赖模式运行质谱仪，质荷比范围为 400 至 1,600 m/z。
   2. 在MS1中选择最多十个最强的离子以生成碎片谱图。将MS1和MS2的分辨率分别设置为70,000（半峰全宽，FWHM）和17,000，自动增益控制（AGC）目标值分别设为3,000,000和1,000,000个离子，最大离子注入时间（IT）分别设为256 ms和64 ms，对应MS1和MS2。
   3. 将动态排除设置为 10 秒，以避免对最丰富的离子进行重复碎裂。
      注意：在 MS2 中，排除带一个电荷或超过六个电荷的离子。
3. 定性蛋白质组学：肽段与蛋白质鉴定
   1. 使用 Peaks Studio 等软件分析碎裂谱图^47,48,49.
      注：其他可用于肽段鉴定的软件包还包括 NovoHMM³⁰ 和 PepNovo³⁷ 用于 从头 测序和SEQUEST⁵⁴ 和 Mascot⁵⁵ 用于数据库搜索。
   2. 合并具有相同质荷比的质谱图（< 2 ppm 差异）和保留时间（< 2 分钟），仅保留质量阈值高于 0.65 的谱图，用于在 Swiss-Prot 数据库（版本：2013 年 12 月）中搜索，设定分类为模式植物 拟南芥。使用以下搜索参数：以单一同位素质量为基准，前体离子质量容差为 10 ppm；碎片离子质量容差为 20 mmu；酶切酶为胰蛋白酶，最多允许 2 次漏切；半胱氨酸的羧甲基化作为固定修饰；甲硫氨酸的氧化作为可变修饰；每条肽段最多允许 3 个可变翻译后修饰。在完成鉴定后，手动设定肽段和蛋白质鉴定的得分阈值，以确保错误发现率（FDR） <5% 被获得。
4. 定量蛋白质组学：质谱数据的统计分析
   1. 使用 LC-MS（例如 Progenesis）用于蛋白质组学数据的无标记定量。
      注意：MS1 肽段峰面积（或强度）根据肽段的质量与质谱工作室软件鉴定出的肽段相关联，允许的最大误差为 10 ppm。
      注意：该软件通过整合2之间所有电荷态的峰面积来计算肽段的丰度⁺ 和 8⁺定量数据通过内部脚本与 PEAKS 肽段鉴定结果进行关联（质荷比匹配，允许的最大误差为 10 ppm）。
   2. 计算每种肽段的平均 log2 倍数变化（CL/non-CL）。按蛋白质对唯一肽段的倍数变化进行分组。
      注意：在每组中，蛋白质的最终倍数变化等于其肽段倍数变化的平均值。
   3. 使用学生氏t检验计算p值 t对每组进行检验以评估统计学显著性。使用R软件包（版本3.3.0）通过Benjamini-Hochberg（BH）法对所有组的p值进行FDR校正。
   4. 使用火山图绘制 "校准" 与 R 软件包（版本 3.3.0）兼容的 function 包（版本 1.7.2）
      注：此处，-log10-校正的 p 值（-log10 (adj. p-value)）是所有鉴定出的蛋白质的 log2-倍数变化的函数。若蛋白质的 log2-倍数变化大于 2，则无论是否具有统计学显著性，均被视为 mRNA 结合蛋白质组中的阳性结果。

11. 已鉴定的mRNA结合蛋白质组目录

1. 通过基因本体（Gene Ontology, GO）数据库中的“分子功能与生物过程”项，以及InterPro数据库中的“家族与结构域”项，将步骤10中鉴定出的蛋白质分为三类。
2. 将类别I定义为“核糖体蛋白”，包含所有检测到的核糖体蛋白；将类别II定义为“主要RNA结合蛋白（Main RBPs）”，即含有已注释的与RNA相互作用的蛋白结构域，或在RNA生物学中具有已知或未知功能并与RNA结合相关的蛋白。
3. 将那些在RNA生物学中具有已知或未知功能但无已注释RNA结合结构域的蛋白归入类别III，即“候选RNA结合蛋白（Candidate RBPs）”，并依据IntEnz数据库的注释信息对类别III中的酶进行定义。

结果

在洗涤步骤4.3使用洗涤缓冲液2时，我们在CL样本中观察到一个特征性的晕环，围绕在珠粒沉淀周围（图1B）。尽管该现象尚未被深入研究，但可能归因于交联的mRNP复合物在磁力捕获过程中干扰了珠粒的聚集，从而形成更为弥散的聚集体。这表明寡聚-d(T)₂₅ 珠粒捕获是有效的¹⁴。

在非交联对照样本和交联样本中，UBQ10 参考 mRNA 的水平均显著高于 18S rRNA，如图 1C所示。这表明由于寡聚脱氧胸苷酸[oligo-d(T)₂₅]磁珠对带有poly(A)尾的mRNA具有特异性结合能力，mRNA在洗脱液中得到了富集。寡聚脱氧胸苷酸磁珠[oligo-d(T)₂₅]捕获效率进一步通过SDS-PAGE及银染结果...

讨论

我们成功地将最初为酵母和人类细胞开发的mRNA互作组捕获技术应用于植物叶片叶肉原生质体。叶片叶肉细胞是植物叶片中基本组织的主要类型。该方法的主要优势在于利用体内交联，直接从生理环境中发现结合蛋白。

在本实验方案中，我们主要介绍了一系列优化的实验条件（例如， 原生质体的起始数量以及紫外照射的持续时间⁵⁰. CL 样品中捕获的蛋白质只有在起始细胞数量不少于 10⁷ 原生质体（中等规模）被使用（步骤1.5.5）。较低浓度在SDS-PAGE上无法产生可观察的mRBP条带，可能不应用于后续的蛋白质组学分析。实际上，使用超过10⁷ 细胞（例如， 10⁹ 在大规模实验中也是可行的²⁰银染实验结果表明，以 0.00875 W/cm² 的强度进行 1 分钟紫外照射² 由连续波紫外光源产生的强度为最佳（图1D...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
0.8 M 甘露醇	Sigma	M1902-500G	初级等渗酶溶液 & MMg 溶液
2 M KCl	MERCK	Art. 4935	初级等渗酶溶液 & W5 缓冲液
0.2 M MES (pH 5.7) (4-吗啉乙磺酸)	Sigma-aldrich	M2933	初级等渗酶溶液， W5 缓冲液 & MMg 溶液， 过滤除菌
纤维素酶 R10	Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.	CELLULASE “ONOZUKA” R-10, 10 g	终末等渗酶溶液
离析酶 R10	Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.	MACEROZYME R-10, 10g	终末等渗酶溶液
10% (w/v) BSA (牛血清白蛋白)	Sigma-aldrich	A7906-100G	终末等渗酶溶液 & 过滤除菌
1 M CaCl2	Chem-Lab NV	CL00.0317.1000	终末等渗酶溶液， W5 缓冲液 & 消化缓冲液
1 M NaCl	Fisher Chemical	S/3160/60	W5 缓冲液
2 M MgCl2	Sigma	M8266-100G	MMg 溶液
1 M LiCl (氯化锂)	Acros	199885000	裂解/结合缓冲液， 洗涤缓冲液 1， 洗涤缓冲液 2 & 低盐缓冲液
5% (w/v) LiDS (十二烷基硫酸锂)	Sigma-aldrich	L4632-25G	裂解/结合缓冲液， 洗涤缓冲液 1 & 过滤除菌
1 M DTT (二硫苏糖醇)	Thermo Fisher Scientific 洗涤缓冲液 1 & 洗涤缓冲液 2	307866	裂解/结合缓冲液，
1 M Tris-HCl (pH 7.5) (三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，盐酸 (HCl))	Acros & Fisher Chemical	167620010 & H/1200/PB15	裂解/结合缓冲液， 洗涤缓冲液 1， 洗涤缓冲液 2， 低盐缓冲液 & 洗脱缓冲液
0.5 M EDTA (pH 8.0) (乙二胺四乙酸)	Sigma-aldrich	ED-500G	裂解/结合缓冲液， 洗涤缓冲液 1， 洗涤缓冲液 2， 低盐缓冲液 & 洗脱缓冲液
Tween 20	MERCK	8.22184.0500	寡聚脱氧胸苷酸-d(T)25 磁珠再生
0.1 M NaOH	VWR PROLABO CHEMICALS	28244.295	寡聚脱氧胸苷酸-d(T)25 磁珠再生
1x PBS (pH 7.4) (磷酸盐缓冲液) 含 (NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)	Fisher Chemical, MERCK, Sigma-aldrich & SAFC	S/3160/60, Art. 4935, 71640-250G & 60230	寡聚脱氧胸苷酸-d(T)25 磁珠再生
蛋白酶 K 溶液 (2 μg/μL)	Thermo Fisher Scientific	11789020	蛋白质消化
上样染料	Invitrogen	LC5925	SDS-PAGE
qPCR 预混液	Promega	A6001	qRT-PCR 检测
RNase Cocktail	Thermo Fisher Scientific	AM2286	RNA 消化
甲醇	Sigma-aldrich	322415	凝胶固定与脱色
乙酸	Sigma-aldrich	537020	凝胶固定与脱色
考马斯亮蓝 R-250	Thermo Fisher Scientific	20278	凝胶染色
1 M NH4HCO3 (碳酸氢铵)	Sigma-aldrich	09830-500G	凝胶水合 & 消化缓冲液
CH3CN (乙腈)	Sigma-aldrich	34851-100ML	凝胶脱水 & 肽溶解液
IAA (碘乙酸)	Sigma-aldrich	I4386-10G	烷基化试剂
TFA (三氟乙酸)	Sigma-aldrich	302031-10X1ML	肽溶解液
FA (甲酸)	Sigma-aldrich	06554-5G	肽提取
胰蛋白酶溶液 (6 ng/μL)	Promega	V5280	消化缓冲液
名称	公司	货号	备注
仪器
土壤	Peltracom	LP2D	植物生长
蛭石 3	Sibli AS	05VERMICULIET	植物生长
培养皿 (150 x 20 mm)	Sarstedt	82.1184.500	原生质体悬浮液载体
0.22 μm 滤膜	Millipore	SE2M229104	终末等渗酶溶液均质化
剃刀片	Agar Scientific	T585	莲座叶条切割
35-75 μm 尼龙筛网	SEFAR NITEX	74010	原生质体悬浮液过滤
50 mL 圆底管	Sigma-aldrich	T1918-10EA	原生质体悬浮液载体
血细胞计数板 (Bürker 血细胞计数板)	MARIENFELD	650030	原生质体细胞计数
紫外交联装置 (HL-2000 HybriLinker)	UVP, LLC	UVP95003101	体内 紫外交联
紫外灯 (Sankyo-Denki G8T5)	SANKYO DENKI	SD G8T5	体内 紫外交联
50 mL 玻璃注射器	FORTUNA Optima	Z314560	原生质体裂解物均质化
细针头 (0.9 x 25 mm)	Becton Dickinson microlance 3	2021-04	原生质体裂解物均质化
旋转混合仪 L26 型	Labinco BV	26110912	样品旋转孵育
寡聚脱氧胸苷酸-d(T)25 磁珠 (5 mg/mL)	New England BioLabs	S1419S	mRNPs 和 mRNAs 结合与下拉
磁力架	Invitrogen	CS15000	mRNPs 和 mRNAs 结合与下拉
离心过滤装置 (Amicon Ultra-4 离心过滤装置)	EMD Millipore	UFC800308	mRBP 浓缩
Pierce 银染试剂盒	Thermo Fisher Scientific	24612	银染检测
RNA 纯化试剂盒 (InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)	STRATEC Molecular	1064100300	RNA 纯化
分光光度计 (NanoDrop 1000 分光光度计)	Thermo Fisher Scientific	ND-1000	RNA 质量与数量
实时 PCR 仪 (StepOne 实时 PCR 仪)	Thermo Fisher Scientific	4376600	cDNA 定量
µ-C18 柱 (Millipore Zip Tip µ-C18 柱)	Sigma-aldrich	720046-960EA	肽纯化
质谱仪 (Q Exactive 混合四极杆-轨道阱质谱仪)	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	基于质谱的蛋白质组学
液相色谱仪 (Ultimate 3000 超高效液相色谱 (UHPLC) 仪)	Thermo Fisher Scientific	ULTIM3000RSLCNANO	基于质谱的蛋白质组学
C18 柱 (Easy Spray Pepmap RSLC C18 柱)	Thermo Fisher Scientific	ES800	基于质谱的蛋白质组学
C18 预柱 (Acclaim Pepmap 100 C18 预柱)	Thermo Fisher Scientific	160321	基于质谱的蛋白质组学
名称	公司	货号	备注
qRT-PCR 检测引物	序列
UBQ10 mRNA (Li 等, 2014)	Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA
18S rRNA (Durut 等, 2014)	Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG Rv: CACGACCCGGCCAATTA