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用于补体受体1长度多态性基因分型的高分辨率熔解PCR：阿尔茨海默病基因易感性评估的创新工具

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DOI：

10.3791/56012

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2017年7月18日

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1Department of Immunology, Reims University Hospitals, Robert Debré Hospital, 2Faculty of Medicine, LRN EA 4682, University of Reims Champagne-Ardenne, 3Department of Internal Medicine and Geriatrics, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 4Faculty of Medicine, EA 3797, University of Reims Champagne-Ardenne

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于检测补体受体1（CR1）长度多态性的创新方法，该方法可应用于多个领域，特别是用于评估阿尔茨海默病（AD）等疾病的易感性。该方法有助于更深入地理解CR1异构体在AD发病机制中的作用。

摘要

补体受体1（CR1）是一种跨膜糖蛋白，在先天免疫系统中发挥关键作用，表达于多种细胞类型，尤其在红细胞（RBCs）上高度表达。作为补体成分C3b和C4b的受体，CR1可调节补体级联反应的激活，并促进免疫复合物、细胞碎片以及阿尔茨海默病（AD）中淀粉样β肽（Aβ）的吞噬。多项研究已证实，CR1基因中存在与AD相关的单核苷酸多态性（SNPs）以及拷贝数变异（CNV）。本文介绍一种用于测定CR1受体长度多态性的创新方法。该受体包含三个结构域，即长同源重复序列（LHR）-LHR-A、LHR-C和LHR-D，以及一个可变数量的n个LHR-B结构域，其中n为0至3之间的整数。利用一对特异性引物，可从遗传物质中扩增出LHR-B结构域的第一片段（可变扩增子B）和LHR-C结构域的第二片段（不变扩增子）。所述引物结合区域之外，可变扩增子B与不变扩增子在五个核苷酸位点上存在差异。通过定量分析工具（高分辨率熔解曲线，HRM）推断可变扩增子B和不变扩增子的数量，且可变扩增子B与不变扩增子的比值随CR1长度多态性的不同而变化。与传统的表型检测方法相比，该方法具有多项优势：无需新鲜样本，成本更低、速度更快，因而适用于更大规模的人群研究。因此，该方法的应用将有助于更深入地理解CR1异构体在AD等疾病发病机制中的作用。

引言

阿尔茨海默病（AD）是痴呆症最常见的病因，全球受影响人数超过3000万，是重大的公共卫生问题1。临床上，AD以神经认知障碍为特征，导致自主能力进行性丧失2。AD具有两种神经病理学标志性改变，即细胞外淀粉样蛋白沉积和细胞内神经纤维缠结3。

传统上，根据疾病发病年龄，阿尔茨海默病（AD）分为两种类型。第一种是早发性阿尔茨海默病（EOAD），通常在65岁之前发病，占AD病例的不到5%。这是一种罕见的常染色体显性遗传形式，由淀粉样前体蛋白（APP）4、早老素1（PSEN1）5或早老素2（PSEN2）6基因的完全外显突变引起。第二种更为常见的形式（>90%的AD病例）被称为"散发性"晚发性阿尔茨海默病（LOAD），多见于65岁及以上的个体，由多种遗传和环境风险因素共同导致7。在LOAD中，载脂蛋白E（APOE）基因的4等位基因是主要的遗传风险因素8,9。此外，全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出超过20个与AD风险相关的基因位点，其中之一是补体成分（3b/4b）受体1（CR1）基因10，该基因位于1号染色体长臂32区（1q32），处于一组补体相关蛋白的基因簇中。CR1基因编码补体受体1型（CR1）蛋白，是补体活性调节因子的组成部分。

CR1（C3b/C4b 受体，CD35）是一种跨膜糖蛋白，分子量约为 200 kDa11，可结合 C3b、C4b、C3bi、C1q、甘露糖结合凝集素（MBL）以及 ficolin 补体蛋白12。CR1 的生物学功能随其表达的细胞类型而异。在人体中，90% 的循环 CR1 存在于红细胞（RBCs）上13。位于红细胞表面的 CR1 可结合被 C3b 或 C4b 调理的微生物或免疫复合物，促进其从血液循环中清除。当红细胞流经肝脏和脾脏时，与 CR1 结合的复合物确实会转移至吞噬细胞11,14。通过限制 C3b 和 C4b 的沉积，CR1 可能防止补体系统的过度激活。因此，红细胞表面的 CR1 表达被认为是保护组织（如中枢神经系统）免受免疫复合物沉积及其所致疾病的重要机制之一。红细胞上的 CR1 还被证实参与病原体感染过程15,16。此外，作为先天免疫中的关键分子，CR1 参与调控补体级联反应以及免疫复合物的运输与清除。CR1 通过结合 C3b 和 C4b 片段，并解离经典和旁路途径的转化酶（即从 C4b2a 复合物中解离 C2a，以及从 C3bBb 复合物中解离 C3b），发挥其生物学活性。作为血浆丝氨酸蛋白酶因子 I（FI）的辅助因子，CR1 可增强 FI 对 C4b 和 C3b 的裂解作用（该功能称为辅助因子活性，CA），从而抑制经典和旁路补体通路；同时通过抑制 C3 放大环路，进一步阻止补体系统的持续激活。Rogers 及其同事提供了证据表明，Aβ 肽可在无抗体存在的情况下结合并激活补体通路17，并提出 Aβ 肽可通过依赖补体的机制黏附于红细胞表面表达的 CR1，从而实现其在血液循环中的清除18。

CR1 存在三种类型的多态性：结构或长度多态性、密度多态性以及Knops血型多态性11,19。结构多态性与长同源重复序列（LHRs）的数量变异有关，由此定义了四种异构体。事实上，CR1蛋白的胞外区由一系列重复单位组成，称为短同源重复序列（SCRs）或补体调控重复序列（CCPs）。这些SCRs已从编码CR1的补体脱氧核糖核酸（cDNA）中得到证实。SCRs以七个为一组串联排列，称为长同源重复序列（LHRs）。CR1由四个LHR组成，分别命名为LHR-A、-B、-C和-LHR-D，它们来源于一个七SCR单位的重复19,20,21。

按照频率递增的顺序，通过蛋白质印迹法（WB）确定的这些CR1异构体分别为CR1*1（A/F）（在凝胶电泳中迁移较快）、CR1*2（B/S）（在凝胶电泳中迁移较慢）、CR1*3（C/F'）和CR1*4（D）。其中最常见的两种异构体CR1*1（A/F）和CR1*2（B/S）分别由四个和五个LHR组成，而CR1*3（C/F'）和CR1*4（D）则分别由3个和6个LHR组成。最常见的异构体CR1*1由30个SCR组成，包含三个C4b结合位点（SCRs 1-3、8-10和15-17）以及两个C3b结合位点（SCRs 8-10和15-17），而SCRs 22-28可结合C1q、ficolins和MBL12,20,21,22,23,24,25。因此，与CR1*1相比，CR1*2多出一个C3b/C4b结合位点。图1展示了四种不同CR1异构体的结构、命名方式及分子量。

密度多态性对应于一种稳定的表型，代表红细胞（RBC）上CR1组成性表达的水平。在健康的高加索人群中，已发现每个红细胞上的CR1分子数量可相差达十倍（从每个细胞150至1,200个分子不等）26。Helgeson表型的红细胞具有极低的CR1密度，已被证实低于每个细胞150个分子27,28。红细胞上CR1密度在遗传上与CR1基因上的常染色体共显性双等位基因系统相关，该系统与HindIII限制性片段长度多态性（RFLP）相关联29。CR1基因第27内含子中发生单点突变，位于编码LHR-D区第二个SCR结构域的外显子之间，导致该区域内产生一个多态性的HindIII酶切位点30。HindIII基因组片段分别为7.4和6.9 kDa，分别对应于红细胞上高（H等位基因）或低（L等位基因）CR1密度的等位基因。然而，在一些西非人群中，并未发现红细胞CR1密度与HindIII多态性之间的相关性31,32。将CR1密度调控与非编码区HindIII多态性相联系的机制仍不清楚。在多个多态性中，SCR16区的Q981H和SCR28区的P1786R已被报道与红细胞上CR1密度相关30,33。

根据国际命名法，Knops（KN）多态性是国际输血协会登记的第22个血型系统。该系统包含9种由红细胞CR1表达的抗原特异性，其中包括三对相对抗原：KN1/KN2、KN3/KN6和KN4/KN7，以及三种独立抗原：KN5、KN8和KN9。KN1、KN3、KN4和KN5抗原属于KN系统中的高频抗原（即在超过99%的普通人群中表达）。然而，该多态性在AD中的作用仍有待确定13。

本研究中描述的实验方案旨在确定与多种疾病（如阿尔茨海默病、系统性红斑狼疮和疟疾）易感性相关的CR1长度多态性基因型。我们用于确定CR1长度多态性的方法利用了构成CR1同工型的LHR-B数量以及LHR-B与LHR-C之间的序列差异（图2）。

方案

人类血液采集与处理方案已通过地区伦理委员会（CPP Est II）的审查和批准，方案编号为2011-A00594-37。

注意：以下方案描述了人血的处理方法。处置生物危害材料时，请遵循所在机构的相关指南。应穿戴实验室安全装备，例如实验服和手套。描述该方案的流程图见图3。

1. 血液与体液 DNA 提取

  1. 将 20 µL 蛋白酶 K（15 µg/µL）移液至 1.5 mL 离心管底部。
  2. 向该 1.5 mL 管中加入 200 µL 样品。可使用最多 200 µL 全血、血浆、血清、白细胞层或体液，或在 200 µL PBS 中最多 5 × 106 个淋巴细胞。
  3. 向样品中加入 200 µL 裂解缓冲液，脉冲式涡旋振荡 15 秒以混匀。
  4. 将样品在 56 °C 水浴中孵育 10 分钟。
  5. 短暂离心 1.5 mL 管，使管盖内壁的液滴沉至管底。
  6. 向样品中加入 200 µL 乙醇（96–100%），再次脉冲式涡旋振荡 15 秒混匀。混匀后，短暂离心 1.5 mL 管，去除管盖内壁的液滴。
  7. 小心将步骤 1.6 中的混合液转移至膜柱（置于 2 mL 收集管中）。避免润湿边缘，盖紧管盖后于 6,000 × g 离心 1 分钟。将膜柱转移至新的洁净 2 mL 收集管中，弃去含有滤液的收集管。
  8. 小心打开膜柱，加入 500 µL 洗涤缓冲液 1，避免润湿边缘。盖紧管盖后于 6,000 × g 离心 1 分钟。将膜柱转移至新的洁净 2 mL 收集管中，弃去含有滤液的收集管。
  9. 小心打开膜柱，加入 500 µL 洗涤缓冲液 2，避免润湿边缘。盖紧管盖后以最大转速（20,000 × g）离心 3 分钟。
  10. 将膜柱放入新的 2 mL 收集管中，弃去含有滤液的收集管，于 20,000 × g 离心 1 分钟。
  11. 将膜柱转移至洁净的 1.5 mL 管中，弃去含有滤液的收集管。
  12. 小心打开膜柱，加入 200 µL 去离子水。室温孵育 5 分钟，然后于 6,000 × g 离心 1 分钟。
  13. 继续进行 DNA 浓度测定步骤，或将 DNA 样品于 -20 °C 冻存。

2. DNA 浓度的测定

注意：参见图4。

  1. 在分光光度计上按 1 选择 DNA 模式。使用左右箭头选择 5 mm 的光程长度。使用左右箭头选择 1 的稀释倍数。
  2. 使用左右箭头选择单位（µg/mL）。使用左右箭头选择 50 的倍数。按 OK。
  3. 用移液器将 10 µL 去离子水加入比色皿中。将比色皿放入分光光度计中。按下 OA/100%T 按钮。
  4. 将 10 µL DNA 样品（用去离子水稀释 1/4）移入比色皿中。将比色皿放入分光光度计中。按下绿色按钮（读数/开始）。记录浓度。
  5. 将 DNA 样品在 -20 °C 冷冻保存。

3. HRM-PCR 实验方案

  1. 解冻DNA样品。在1.5 mL离心管中用水稀释DNA样品，使其浓度调整为10 ng/µL
    注意：稀释后DNA的总体积应在2 µL至10 µL之间。
  2. 解冻引物溶液。在1.5 mL离心管中用水稀释引物溶液，使其浓度调整为6 µM。
    注意：引物序列和反应条件见表1。

高分辨率熔解分析（HRM-PCR）实验方案表格，列出了引物、产物大小、MgCl2浓度及循环条件。
表1：高分辨率熔解分析中使用的引物与实验参数。

  1. 解冻HRM-PCR试剂盒溶液，通过涡旋振荡充分混匀，以确保所有组分完全恢复。将含有酶混合物与DNA结合染料、MgCl₂的三个小瓶短暂离心，使管壁残留液体沉至管底。2在打开前，先在微型离心机中短暂离心，并置于室温下保存。
  2. 在室温下的 1.5 mL 离心管中，配制一份 PCR 反应混合液 20 µL 通过按以下顺序添加组分来进行反应：
    1. 10 µL 含DNA结合染料的酶混合物；
    2. 2 µL 25 mM MgCl2;
    3. 1 µL 引物1的 6 µM （终浓度：300 nM）；
    4. 1 µL 引物2的 6 µM （终浓度：300 nM）；以及
    5. 5 µL 水。
      注意：若需配制多于一个反应的PCR混合液，应将上述各组分体积乘以拟进行的反应数再加一个反应的数量。
  3. 轻轻混匀，使用涡旋振荡器。
  4. 移液 19 µL 将上述制备的PCR混合液加入白色多孔板的每个孔中。
  5. 添加 1 µL 经步骤3.1制备的浓度调整后的DNA模板
    注意：进行对照反应时，务必为样品设置阴性对照。制备阴性对照时，用水替代模板DNA。
  6. 用封板膜密封白色多孔板。
  7. 将白色多孔板放入离心机中，并使用适当的配重进行平衡（即， 另一块多孔板）。在配备适用于多孔板及相应转接器的转子的标准摆动桶式离心机中，以1,500 × g离心1分钟。
  8. 将白色多孔板装入HRM-PCR仪器中。
  9. 启动HRM-PCR程序，PCR条件如下：

    变性： 95 °C 10 分钟；1 个循环。
    扩增： 95 °C 10秒， 62 °C 15秒，以及 72 °C 20秒；47个循环。
    熔解曲线： 95 °C；升温速率： 0.02 °C/秒；每25次采集 °C；1个循环。
    冷却： 40 °C 30 秒；升降温速率 2.2 °C/秒；1个循环。

4. HRM 分析以确定 CR1 长度多态性

注意：所描述的方法（图5）专用于我们的软件（参见材料表），尽管也可使用其他软件包。

  1. 打开基因扫描软件，进行CR1长度多态性扫描分析。
  2. 打开包含扩增程序和熔解曲线程序的实验。
  3. 点击 样本编辑器 在 模块 栏，然后选择 扫描 工作流程.
  4. 定义样品的特性（即， 名称；未知或阴性对照。
  5. 点击 分析 在 模块 巴
  6. 在 创建新分析 列表，选择 基因扫描
  7. 点击 归一化 切换至归一化熔解曲线。
  8. 点击 温度转换 单击以重置熔解曲线的温度轴（x 轴）。
    注意：下方图表显示的是经过归一化和温度校正的熔解曲线。
  9. 点击 计算 单击按钮以分析结果并确定分组。
  10. 点击 差异图 图表区域中的标签以查看 归一化与位移熔解曲线 和 归一化与温度偏移差异图.

结果

图6A展示了通过WB对CR1长度多态性进行的分型结果。图6B和C展示了HRM-PCR分析过程中获得的曲线，可用于确定CR1长度多态性。在对具有不同CR1异构体的受试者基因组DNA进行PCR扩增后，通过高分辨率熔解分析获得熔解曲线，并利用软件分析这些融合曲线，从而根据受试者CR1同种型表达表型的差异实现区分。

图6B 展示了第一种呈现模式，称为“归一化并位移的熔解曲线”，而 图6C 展示了第二种呈现模式，称为“归一化并温度位移的差值图”。

曲线的分布模式根据代表 图6A 中表型的分组进行划分：(CR1*3, CR1*1)；(CR1*1, CR1*2)；CR1*1；CR1*2；以及 (CR1*2, CR1*4)。这使得能够利用该新型分子生物学方法对 CR1 长度多态性进行基因分型。

补体受体1型异构体示意图，显示LHR结构域、SCR单元；蛋白质结构分析。
图1：补体受体1蛋白结构及其多态性的示意图。每个短共有序列重复区（SCR）或补体控制蛋白（CCP）以一个圆圈表示。SCR被归类为称为LHR的重复性高阶结构。从细胞外结构域到细胞膜，LHR依次为：LHR-A、-B、-C、-D 和 -S（辅助性或附加性LHR）。在最常见的CR1异构体（CR1*1）中，C4b/衰变加速活性（DAA）结合位点位于LHR-A（SCRs 1-3，绿色圆圈），C3b/C4b/辅因子活性（CA）结合位点位于LHR-B（SCRs 8-10，红色圆圈）和LHR-C（SCRs 15-17，紫色圆圈）的N端前3个SCR中，而C1q/甘露糖结合凝集素（MBL）和ficolin的结合位点则位于LHR-D（SCRs 22-28，蓝色圆圈）。同源结构以相同颜色标注。CR1*2（S）异构体具有一个额外的LHR（LHR-S），因此包含一个额外的C3b/C4b结合位点。KDa，千道尔顿。NRC，非还原条件。RC，还原条件。TM，跨膜结构域。本图经Nature Publishing Group许可改编自Brouwers et al.36。 请点击此处查看此图的放大版本。

显示序列变异并突出核苷酸的CR1基因编辑示意图，用于DNA分析。
图2：通过HRM-PCR获得的CR1异构体结构及其扩增子位置的示意图。每个方框代表一个短共识重复序列（SCR）。SCR被归类为长同源重复区（LHR）：LHR-A、-B、-C和-D。同源结构以相同颜色标注。CR1*2和CR1*4异构体具有额外的LHR（LHR-B），因此包含一个额外的扩增子区域（红色所示的扩增子B）。CR1*3缺失LHR-B，扩增子区域较少（缺少扩增子B）。扩增子B（196 bp）与不变扩增子（197 bp）之间的核苷酸差异分别以红色和蓝色表示。各CR1异构体之间（红色扩增子B / 蓝色不变扩增子）的比值差异通过HRM-PCR测定，从而实现基因分型。CN3和CN3re引物序列已加下划线。TM，跨膜区；CYT，胞质尾区。请点击此处查看该图的放大版本。

从DNA提取到CR1基因型的流程图，重点展示HRM-PCR过程。
图3：从人血样本中对CR1长度多态性进行基因分型的实验流程图。采集人源DNA样本，提取DNA以获得血液DNA样品；测定DNA浓度，并稀释至10 ng/µL；采用HRM-PCR方法获得CR1长度多态性基因型。请点击此处查看该图的放大版本。

用于DNA分析的分光光度计装置；包括吸光度测量和数据显示面板。
图4：用于测定DNA浓度的分光光度计操作界面截图。按数字键1（A）选择分光光度计上的DNA检测模式。使用左右箭头（C）选择光程长度为5 mm（B）。使用左右箭头（C）选择浓度单位（µg/mL）（D）。使用左右箭头（C）选择稀释倍数为1（E）。使用左右箭头选择换算系数为50（F）。按OK键（G）。用移液器向比色皿中加入10 µL去离子水。将比色皿放入分光光度计中（H）。按下OA/100%T按钮（I）。用移液器向比色皿中加入10 µL DNA样品（用去离子水稀释1/4）。将比色皿放入分光光度计中（K）。按下绿色按钮（读数/开始）（L）。记录测得的DNA浓度（M）。 请点击此处查看该图的放大版本。

PCR数据分析步骤；软件界面；定量结果；扩增曲线；温度循环。
图5：方案第4步所用软件图形界面的截图。（A）打开基因扫描软件。（B）扩增程序和熔解曲线程序。（C）在Module工具栏中点击Sample editor。（D）选择Scanning。（E）定义样本属性。（F）在Module工具栏中点击Analysis。（G）点击Normalization标签页以对熔解曲线进行归一化处理。（H）点击Temperature shift标签页，显示经过归一化和温度校正的熔解曲线。（I）点击Calculate按钮以分析结果并确定分组。（J）点击Difference plot标签页，查看Normalized and Shifted Melting Curves以及Normalized and Temperature Shifted Difference Plot。（K）根据CR1长度基因型对样本进行彩色分组。请点击此处查看该图的放大版本。

电泳结果和熔解曲线；蛋白质分析；温度变化；示意图。
图6：通过WB检测到的CR1长度多态性及其在HRM-PCR中获得的相应曲线图谱。（A）使用WB对CR1长度多态性进行表型分析。（B）和（C）采用HRM-PCR分析对CR1长度多态性进行基因分型。对来自表达不同CR1异构体个体的基因组DNA进行PCR扩增后，通过高分辨率熔解曲线（HRM）分析，鉴定出特定的曲线图谱：(CR1*3, CR1*1)（紫色）；(CR1*1, CR1*2)（蓝色）；CR1*1（绿色）；CR1*2（红色）；以及(CR1*2, CR1*4)（灰色）。这些图谱对应于CR1长度多态性的等位基因。如两种展示模式所示——“归一化并位移的熔解曲线”（B）和“归一化并温度位移的差异图”（C）——曲线图谱分别归属于(CR1*3, CR1*1)、(CR1*1, CR1*2)、CR1*1、CR1*2和(CR1*2, CR1*4)组。本图经Elsevier许可改编自Mahmoudi et al.38。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

在此，我们介绍一种广泛适用的方法，用于研究CR1长度多态性。由于CR1基因的重复结构，传统的分子生物学技术，如扩增或片段杂交，始终无法获得令人满意的结果，因而不能在所有个体中准确确定CR1长度多态性。即， CR1分子中高度重复的SCR区）。此处描述的分子生物学方法利用了CR1分子中LHR-B的定量分布特征。CR1分子包含n个LHR-B结构域，其中n为0至3之间的整数，且仅含有一个LHR-C结构域，如文中所述及图示所示。 图2定量检测B结构域能够精确区分多出或缺失一个B结构域的情况。

从提取的遗传物质中，使用一对特异性引物通过PCR扩增促黄体生成素受体B（LHR-B）的第一个DNA片段，代表一种称为"variant amplicon B"的特征性LHR-B变异片段。同时扩增第二个DNA片段，称为"invariant amplicon"，属于LHR-C。该第二个DNA片段是LHR-C的一个片段，但也可使用LHR-A或LHR-D的其他不变片段。

两个DNA片段——变异扩增子B和不变扩增子——由相同的引物扩增，且在核苷酸序列上存在五个差异。这一特性使得在后续步骤中可以利用一种定量分子生物学工具HRM（为该目的而优化）来确定变异扩增子B和不变扩增子的数量。扩增子B与不变扩增子的数量比值（比值：扩增子B / 不变扩增子）随CR1分子长度的不同而变化。实际上，CR1*4表现为3个扩增子B对应1个不变扩增子，CR1*2表现为2个扩增子B对应1个不变扩增子，CR1*1表现为1个扩增子B对应1个不变扩增子，而CR1*3则表现为0个扩增子B对应1个不变扩增子（图2）。因此，该HRM-PCR方法可实现对CR1长度多态性的基因分型。

然而，在研究开始时，该技术需要使用已知CR1表型的参考受试者（即， 先前通过WB建立的）以能够根据HRM-PCR获得的参考曲线图谱建立CR1的基因分型。两种表示方式，即 "归一化与位移熔解曲线" 和 "归一化与温度偏移差分图" 可获得。它们根据WB测得的CR1长度多态性表型，显示出不同组别的曲线轮廓，且以不同颜色标示图6）。从 "归一化与位移熔解曲线" 这一步骤使得我们能够区分对应于CR1异构体的不同曲线组，这些曲线组按颜色分组。然而， "归一化且时间偏移校正的差异图，" 这对应于一种不同的数学表达方式，有助于更直观地展示不同的曲线组。尽管本研究中常规使用的是制造商提供的软件，但也可采用其他软件（如uANALYSE）作为数据提取程序用于曲线分析。

迄今为止，WB 分析技术是能够在蛋白质水平上鉴定不同 CR1 长度多态性的原始技术。然而，该技术存在若干缺点。特别是，通过 WB 进行蛋白质分析必须在提取细胞膜之后才能进行，因此操作复杂且非常耗时。此外，该技术需要在实验开始时获取条件合适的 fresh blood 样本，才能获得有意义的结果。相比之下，基于 DNA 的 HRM-PCR 技术则可以使用干血斑或长期储存后的样本。HRM-PCR 需要专用的 DNA 熔解仪器，可以是专用设备，也可以是具备 HRM 功能并配备 HRM 软件的热循环仪。SNP 检测的准确性依赖于多个因素：i）包含在较长 PCR 片段中的 SNP 比相同 SNP 位于较短 PCR 片段中更难检测；ii）属于 III 类和 IV 类的 SNP 比 I 类和 II 类的 SNP 更难检测34；iii）若 SNP 两侧具有邻近碱基对称性（例如，5'-G(G/C)C-3'），则无论 HMR 平台的分辨率如何，都无法通过熔解曲线区分。使用 uMELT 软件35对包含目标 SNP 的预测 PCR 片段进行测试，可能有助于评估该检测方法的有效性。最后，HRM-PCR 是一种模拟方法，这意味着参考样本与待测模板之间的熔解曲线相似，并不一定表明模板序列与参考序列完全相同，因为模板序列可能不同于参考序列但在热力学上等效。然而，这些局限性并不适用于本文所述的方法，该方法基于五种核苷酸序列不同的扩增子混合物的熔解分析。

此外，本文所述基于高分辨率熔解曲线（HRM）分析的技术具有多种优势。首先，CR1长度多态性的检测速度更快，因为在完成遗传物质提取后，约2小时内即可获得结果。相比之下，基于WB蛋白分析的传统生化技术所需步骤较为耗时：需通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞膜提取物，随后将蛋白质转移至硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，并通过免疫化学发光法鉴定CR1分子的不同异构体。其次，HRM-PCR技术还具有成本较低的优点，这对于可能需应用于大量个体的检测方法而言尤为重要。即， 大规模）以确定其对阿尔茨海默病、红斑狼疮或疟疾等疾病易感性。

近期，我们及其他研究者已证实，CR1*2 亚型因多出一个 C3b/C4b 结合位点，与阿尔茨海默病（AD）相关36,37,38。在我们先前发表的研究中，98.9% 受试者的基因和蛋白水平上的 CR1 长度多态性结果一致38。当比较 HRM-PCR 与 WB 检测所得的长度多态性时，出现不一致的结果：HRM（基因）检测确定为（CR1*1, CR1*2）基因型的个体，WB（蛋白）结果显示红细胞表面仅表达 CR1*1 亚型。在我们的研究中，CR1*2 亚型表达缺失（携带沉默等位基因的个体）在 WB 实验延长曝光时间后仍可重复观察到，这可能归因于文献中 Helgeson 所描述的沉默 CR1 等位基因（CR1*2）的存在39。然而，仍需在更大人群样本中开展进一步研究以支持这一假说。

需要注意的是，私有SNP（仅出现在小家族群体中甚至单一个体中的SNP）会导致不同的曲线图谱，应通过参考表型测定（WB）进行解读，但不可将其与经典图谱混淆，以免对CR1长度多态性基因型产生误判。

披露

作者是兰斯香槟-阿登大学（URCA）持有的一项专利的发明人（专利号 WO 2015166194）

致谢

我们感谢区域创新生物学平台的所有成员、免疫科以及内科和老年病科的工作人员，他们为优化和验证本方案作出了贡献。本工作由兰斯大学医院资助（项目编号：AOL11UF9156）。我们还感谢法国贝桑松大学医院（EA3920）的 Fiona Ecarnot 提供的编辑协助。

材料

本文使用的材料清单
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SensiCareIce 无粉腈检查手套Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA486802样本防护
Eppendorf Reference 2 移液器，0,5-10µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000024样本移液
Eppendorf Reference 2 移液器，20-100µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000059样本移液
Eppendorf Reference 2 移液器，100-1000µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000083样本移液
TipOne 10µL 刻度滤芯吸头Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1121-3810样本移液
TipOne 1-100µL 斜面滤芯吸头Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1120-1840样本移液
ART 1000E 隔离吸头Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France2079E样本移液
Eppendorf Safe-Lock 管，1.5 mL，Eppendorf 品质Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France0030120086混匀
Vortex-Genie 2 涡旋振荡器Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USASI-0236混匀
QIAamp DNA Mini Kit (250)Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France51306DNA 提取
Buffer ALQiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France19075裂解缓冲液
QIAamp Mini Spin ColumnQiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France1011706DNA 结合
Buffer AW1Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France19081洗涤缓冲液
Buffer AW2Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France19072洗涤缓冲液
Biowave DNA 分光光度计Biochrom Ltd, Cambridge CB4 OFJ, England80-3004-70DNA 浓度 
Mikro 200 离心机Hettich Zentrifugen, D-78532, Germany0002020-02-00离心
Multipette E3Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4987000010分液
Light Cycler 480 96 孔白色多孔板Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany04729692001反应场所
Light Cycler 480 密封箔Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany04429757001覆盖
Heraeus Megafuge 11R 离心机Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France75004412离心
LightCycler 480 Instrument II，96 孔Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany05015278001高分辨率熔解聚合酶链式反应
LightCycler 480 高分辨率熔解 Master 混合液Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany04909631001反应试剂
light cycler 480 SW 1.5.1 软件Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany用于 HRM PCR CR1 多态性数据分析的软件
CN3 引物：5'ggccttagacttctcctgc 3'Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium反应试剂
CN3re 引物：5'gttgacaaattggcggcttcg 3'Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium反应试剂

参考文献

  1. Prince, M., et al. World Alzheimer Report 2015, The Global Impact of Dementia: An analysis of prevalence, incidence, cost and trends. Alzheimer's Disease International. , (2015).
  2. McKhann, G. M., et al. The diagnosis of dementia due to Alzheimer's disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer's Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 7 (3), 263-269 (2011).
  3. Serrano-Pozo, A., Frosch, M. P., Masliah, E., Hyman, B. T. Neuropathological alterations in Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), 006189(2011).
  4. Goate, A., et al. Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer's disease. Nature. 349 (6311), 704-706 (1991).
  5. Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature. 375 (6534), 754-760 (1995).
  6. Levy-Lahad, E., et al. A familial Alzheimer's disease locus on chromosome 1. Science. 269 (5226), 970-973 (1995).
  7. Mayeux, R., Stern, Y. Epidemiology of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (8), (2012).
  8. Corder, E. H., et al. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families. Science. 261 (5123), 921-923 (1993).
  9. Yu, J. T., Tan, L., Hardy, J. Apolipoprotein E in Alzheimer's disease: an update. Annu Rev Neurosci. 37, 79-100 (2014).
  10. Lambert, J. C., et al. Genome-wide association study identifies variants at CLU and CR1 associated with Alzheimer's disease. Nat Genet. 41 (10), 1094-1099 (2009).
  11. Liu, D., Niu, Z. X. The structure, genetic polymorphisms, expression and biological functions of complement receptor type 1 (CR1/CD35). Immunopharmacol Immunotoxicol. 31 (4), 524-535 (2009).
  12. Jacquet, M., et al. Deciphering complement receptor type 1 interactions with recognition proteins of the lectin complement pathway. J Immunol. 190 (7), 3721-3731 (2013).
  13. Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
  14. Cosio, F. G., Shen, X. P., Birmingham, D. J., Van Aman, M., Hebert, L. A. Evaluation of the mechanisms responsible for the reduction in erythrocyte complement receptors when immune complexes form in vivo in primates. J Immunol. 145 (12), 4198-4206 (1990).
  15. Krych-Goldberg, M., Moulds, J. M., Atkinson, J. P. Human complement receptor type 1 (CR1) binds to a major malarial adhesin. Trends Mol Med. 8 (11), 531-537 (2002).
  16. Cohen, J. H., Geffriaud, C., Caudwell, V., Kazatchkine, M. D. Genetic analysis of CR1 (the C3b complement receptor, CD35) expression on erythrocytes of HIV-infected individuals. Aids. 3 (6), 397-399 (1989).
  17. Rogers, J., et al. Complement activation by beta-amyloid in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (21), 10016-10020 (1992).
  18. Rogers, J., et al. Peripheral clearance of amyloid beta peptide by complement C3-dependent adherence to erythrocytes. Neurobiol Aging. 27 (12), 1733-1739 (2006).
  19. Krych-Goldberg, M., Atkinson, J. P. Structure-function relationships of complement receptor type 1. Immunol Rev. 180, 112-122 (2001).
  20. Klickstein, L. B., et al. Human C3b/C4b receptor (CR1). Demonstration of long homologous repeating domains that are composed of the short consensus repeats characteristics of C3/C4 binding proteins. J Exp Med. 165 (4), 1095-1112 (1987).
  21. Hourcade, D., Miesner, D. R., Atkinson, J. P., Holers, V. M. Identification of an alternative polyadenylation site in the human C3b/C4b receptor (complement receptor type 1) transcriptional unit and prediction of a secreted form of complement receptor type 1. J Exp Med. 168 (4), 1255-1270 (1988).
  22. Krych, M., Hourcade, D., Atkinson, J. P. Sites within the complement C3b/C4b receptor important for the specificity of ligand binding. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (10), 4353-4357 (1991).
  23. Krych-Goldberg, M., et al. Decay accelerating activity of complement receptor type 1 (CD35). Two active sites are required for dissociating C5 convertases. J Biol Chem. 274 (44), 31160-31168 (1999).
  24. Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
  25. Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. J Exp Med. 192 (12), 1797-1808 (2000).
  26. Cornillet, P., Philbert, F., Kazatchkine, M. D., Cohen, J. H. Genomic determination of the CR1 (CD35) density polymorphism on erythrocytes using polymerase chain reaction amplification and HindIII restriction enzyme digestion. J Immunol Methods. 136 (2), 193-197 (1991).
  27. Moulds, J. M., Nickells, M. W., Moulds, J. J., Brown, M. C., Atkinson, J. P. The C3b/C4b receptor is recognized by the Knops, McCoy, Swain-langley, and York blood group antisera. J Exp Med. 173 (5), 1159-1163 (1991).
  28. Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sang. 62 (4), 230-235 (1992).
  29. Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. J Exp Med. 164 (1), 50-59 (1986).
  30. Wong, W. W., et al. Structure of the human CR1 gene. Molecular basis of the structural and quantitative polymorphisms and identification of a new CR1-like allele. J Exp Med. 169 (3), 847-863 (1989).
  31. Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in Caucasian and African American populations. Clin Immunol Immunopathol. 87 (2), 176-183 (1998).
  32. Rowe, J. A., et al. Erythrocyte CR1 expression level does not correlate with a HindIII restriction fragment length polymorphism in Africans; implications for studies on malaria susceptibility. Genes Immun. 3 (8), 497-500 (2002).
  33. Birmingham, D. J., et al. A polymorphism in the type one complement receptor (CR1) involves an additional cysteine within the C3b/C4b binding domain that inhibits ligand binding. Mol Immunol. 44 (14), 3510-3516 (2007).
  34. Venter, J. C., et al. The sequence of the human genome. Science. 291 (5507), 1304-1351 (2001).
  35. Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
  36. Brouwers, N., et al. Alzheimer risk associated with a copy number variation in the complement receptor 1 increasing C3b/C4b binding sites. Mol Psychiatry. 17 (2), 223-233 (2012).
  37. Hazrati, L. N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33 (12), 2945-2949 (2012).
  38. Mahmoudi, R., et al. Alzheimer's disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiol. Aging. 36, 1712-1765 (2015).
  39. Helgeson, M., Swanson, J., Polesky, H. F. Knops-Helgeson (Kna), a high-frequency erythrocyte antigen. Transfusion. 10 (3), 137-138 (1970).

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