本文介绍了如何在小鼠中实施体外循环。这一新型模型将有助于研究器官损伤相关的分子机制。
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摘要
摘要
随着心脏介入手术中体外循环时间的延长，临床上对优化手术操作及减少长时间体外循环所致器官损伤的需求日益增加。本文旨在建立一种在小鼠中完全可行且具有临床相关性的体外循环模型。我们介绍了该模型的装置设计、灌注回路优化以及显微外科技术。该模型为急性实验模型，由于需多次采血，无法实现动物术后存活。由于小鼠可用的研究工具种类丰富（例如标记物，基因敲除 等等。该模型将有助于研究器官损伤的分子机制，以及体外循环与其他共病之间相互作用的影响。
引言
自体外循环（CPB）引入临床以来，其在心脏外科手术中发挥了至关重要的作用1。在现代心脏外科中，延长CPB时间对于实施广泛的主动脉重建及联合手术至关重要。尽管技术进步显著，但体外循环的使用仍与术中及术后全身性和局部器官损伤相关2,3。
已开发出大型动物模型以研究体外循环（CPB）对生理过程的影响4,5。尽管这些模型有助于深入了解与CPB相关的某些并发症，但其成本极高，且可用的分子工具（如抗体）非常有限。一种更具成本效益的替代方案已在小型动物中建立。自其发展以来，已有大量研究致力于优化大鼠和兔的CPB模型5,6,7,8,9。这些模型为病理生理疾病过程的测量提供了良好基础；然而，由于缺乏相关的抗体和试剂，它们在细胞免疫和体液免疫研究方面仍显不足，限制了其在此研究领域中的应用。
我们最近开发了一种体外循环（CPB）的小鼠模型。由于存在大量小鼠特异性试剂和基因修饰小鼠，小鼠模型通常成为生理学、分子生物学和免疫学研究的首选模型10,11。因此，该模型将有助于结合多种临床相关疾病的小鼠品系，促进对体外循环（CPB）与各种合并症之间关系的研究12,13。本文详细描述了在小鼠中实施体外循环（CPB）的操作方法。在深度呼吸和循环停滞后，密切监测氧合和血流动力学参数。
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方案
所有动物实验均依照德国动物保护法（TierSchG）进行，并经当地动物福利委员会批准（下萨克森州消费者保护与食品安全局，方案编号 TSA 14/1556）。适用于本模型的小鼠最低体重为 25 g。
1. 术前准备
注意：所有操作均在洁净、非无菌条件下进行，并使用已高压灭菌的器械。
- 将50-60根8厘米长的聚丙烯中空纤维平行放置于一根管中，并在两侧连接T型接头。用胶水填充中空纤维与T型接头外支之间的空隙。
- 让胶水至少固化24小时。使用标准切片机切割从T型接头伸出的中空纤维，并将硅胶管拉至连接部位。
- 将一根27 G金属针（来自26G针芯） 插入一根2 Fr聚氨酯导管中。在显微镜（8-12倍放大）下使用手术刀片和显微剪刀，在导管远端三分之一段内制作3至4个约0.15 cm的开窗，以确保最佳静脉回流。
- 完成后取出导丝。使用棉签进行钝性分离并牵拉组织。使用纱布块（5 x 5 cm2）吸除多余液体，防止组织脱水。
- 准备预充液体。为完成配制，每毫升预充液中加入30 IU肝素和2.5% v/v的8.4% NaHCO3溶液用于缓冲。将此溶液储存于4 °C，待用。
- 通过静脉导管向体外循环（CPB）回路（即泵、除气器、管路及两根导管）注入850 µL预充液。注满后，在动物准备插管前保持CPB持续循环。
2. 动物麻醉
- 麻醉时，将动物置于含2.5%（v/v）异氟烷/氧气混合气体的诱导室中。通过评估足底回缩反射、尾部夹捏反射和眨眼反射确认麻醉效果。涂抹兽用眼膏以防止眼睛干燥。
- 将动物放置在具有温度调节功能的加热垫上。使用连接至数据采集系统的直肠探针测量体温。
- 待动物完全麻醉后，使用20G塑料套管针经口进行气管插管，在直视下经口腔插入并推进至气管。启动连接有异氟烷挥发罐的小鼠呼吸机进行机械通气。根据动物体重调整通气参数，使潮气量达到250–350 µL。
- 为确保完全镇痛，皮下注射5 mg/kg体重的卡洛芬。建议在氧气中维持1.3–2.5%的异氟烷浓度，并可根据手术操作阶段手动调整异氟烷浓度。
3. 手术步骤
- 完全麻醉并完成插管后，使用精细剪刀沿颈部正中线做皮肤切口，以钝性方式分离肌肉，暴露右侧颈静脉和左侧颈总动脉。在分离过程中，使用连接双极电凝镊的兽用凝血装置对小血管进行凝固，以确保出血量最小化。
- 完成颈静脉血管的准备后，使用8-0丝线在左侧颈总动脉远端至其分叉处进行结扎。
- 使用硅胶连接器（内径0.5 mm，外径1 mm）将27 G套管的远端连接至动脉灌注管路，在动脉近端放置8-0丝线滑结，并将套管尖端插入颈总动脉。
- 在套管尖端正确就位后，推进套管，使其尖端位于主动脉弓近端3 - 4 mm处，并使用8-0丝线结扎固定套管尖端。
- 使用显微外科镊和剪刀进行钝性和锐性分离，在胸锁乳突肌外侧、靠近锁骨处钝性分离组织以暴露右侧颈静脉，并在远端结扎8-0丝线，在近端留置8-0丝线环。
- 在颈静脉远端结扎后，将静脉套管尖端置入右侧颈静脉，并推进至右心房，使用丝线固定。为获得最佳静脉回流，可能需要将静脉套管尖端进一步推进至右心室。
- 在确认套管位置正确后，通过颈静脉直接静脉注射肝素，剂量为每克动物体重2.5 IU，进行全身肝素化。
- 为进行实时有创血压监测，需穿刺左侧股动脉。暴露腹股沟区域，在25倍放大镜下轻柔分离股总动脉与股静脉及股神经。
- 结扎股动脉远端，使用滑结暂时阻断近端，并用显微镊在血管前壁做一小切口。
- 随后，将1 Fr聚氨酯套管插入股动脉，并用10-0丝线固定。该套管用于采集血样进行血气分析。
- 在成功置入动脉和静脉套管后，启动体外循环泵开始体外循环。从插管至开始体外循环的时间约为45分钟。初始灌注流量设为0.5 mL/min，根据全身血压测量结果，在2分钟内逐步提高泵速，达到全流量（4 - 6 mL/min）。
- 在充分监测下，使用精细剪刀从胸骨柄开始向尾侧方向剪开约5 mm，行上部胸骨切开术。立即对胸骨切缘进行电凝止血，避免出血。通过向头侧牵拉右侧颈总动脉，暴露主动脉弓。
- 为实现最佳操作控制，沿主动脉弓周围环形游离其与胸腺及周围组织，便于夹闭操作。在升主动脉周围放置8-0丝线环。为放置心脏停搏液用的交叉钳，向头侧牵拉丝线环，以更好暴露升主动脉。
4. 体外循环与血气分析
- 进行血气分析（BGA）时，通过股动脉导管使用玻璃毛细管采集 60 - 90 µL 动脉血。
- 用小夹子夹闭硅胶管，并将硅胶管从导管上分离。缓慢松开夹子压力，使毛细管受控地充满血液。
- 将硅胶管重新连接至导管。将毛细管插入血气分析仪，在以下时间点进行测量：
体外循环（CPB）开始并通气 10 分钟后（BGA1）
体外循环 25 分钟及呼吸停止 15 分钟后（BGA2）
体外循环 40 分钟及呼吸停止 30 分钟后（BGA3）
体外循环 55 分钟、呼吸停止 45 分钟及心脏停止 20 分钟后（BGA4）
- 在体外循环流量稳定的情况下，通过停止通气来启动呼吸停止。
- 停止通气后，将加热垫设定为 28 ºC，并 在呼吸停止的前 20 分钟内，使用浸有冷生理盐水的纱布对动物进行局部降温，使其体温降至 28 ºC。
- 当体温达到 28 ºC 且呼吸停止累计达 30 分钟后，向体外循环回路中注入 0.3 mL 的 7.45% 氯化钾（KCl）溶液，以诱导心脏停搏。
- 进行主动脉交叉阻断时，将先前放置的丝线环（步骤 3.10）向头侧牵拉以获得更好的暴露视野，并在升主动脉部位放置微型微血管夹。
- 总共实施 60 分钟呼吸停止和 30 分钟心脏停止。移除升主动脉上的微型微血管夹以启动心脏再灌注。同时恢复通气，并将动物体温复温至 37 °C。
- 完成再灌注且动物恢复至正常体温后，关闭泵以终止体外循环，并继续监测生理指标（例如 体温、心电图和有创血压）20 分钟。
- 实验结束时，在深度麻醉（5% 异氟烷）下放血处死动物，并采集血液和器官用于进一步分析14。
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结果
本方案描述了小鼠体外循环（CPB）期间的灌注回路、手术操作以及生理参数的监测。由具备足够技能的显微外科医生操作时，可稳定且可重复地获得实验结果。
为了维持足够的组织灌注，通过调整体外循环（CPB）血流量并补充额外容积，始终将平均动脉压保持在40至60 mmHg之间。根据动物的体重、容量状态和体温，体外血流量维持在2.3 - 6.5 mL/min。实验过程中通过向体外循环管路中添加0.1 mL预充液来纠正容量丢失。全身pH值的稳定通过加入8.4 mmol/L的NaHCO2来实现。所有液体均通过空气捕集储液器给予，以降低空气栓塞的风险。
使用血气分析（BGA）在四个不同时间点评估生理参数（图1），代表性成功的体外循环（CPB）操作的测量结果见
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讨论
我们已成功建立了一种在小鼠中具有完全功能且与临床相关的体外循环（CPB）模型。鉴于已有超过三十种小鼠品系可用于心血管疾病研究，本模型可为开发与CPB相关的新前瞻性方案提供起点。此外，由于存在大量小鼠特异性试剂及基因敲除小鼠，该模型不仅有望取代当前的CPB大鼠模型，还将有助于深入解析CPB相关器官损伤的分子机制。迄今为止，由于插管技术中的显微外科挑战，以及诸如开发具有足够小预充体积的微型氧合器等技术难题，CPB尚未在小鼠中成功应用。为建立稳定的模型，我们经历了约90次尝试，并依靠一位经验丰富的显微外科医生的不懈努力。我们测试并持续改进了超过15种配备不同滚压泵、管路和多种储血器的CPB设备原型。为达到当前成果，我们构建并测试了10种以上不同版本的氧合器。本新型模型需要对现有的大鼠体外循环模型装置进行彻底重新设计。首先，我们研制了目前最小的微型氧合器，其预充体积可小于<0.3 mL。该氧合器采用倒置系统重新设计，使血液流经中空纤维内部而非纤维间隙，从而显著降低了预充体积。
在模型开发过程中，我们遇到了一些技术难题。最初的原型电路需要高达6 mL的预充体积，导致严重的血液稀释，血...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 斯特罗芬丁 | B.Braun Petzold GmbH | PZN:8609189 | 预充体积，与四星溶液按1:1比例混合 |
| 四星6% HES溶液 | B. Braun Melsungen AG | PZN: 05565416 | 预充体积，与斯特罗芬丁按1:1比例混合 |
| 肝素钠25000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 每毫升预充液含2.5 IU |
| NaHCO3 8.4%溶液 | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 在预充液中占3% |
| KCL 7.45%溶液 | B. Braun Melsungen AG | PZN: 2418577 | 心脏停搏用，0.1 mL |
| 卡洛芬 | Zoetis Inc., USA | PZN:00289615 08859153 | 5 mg/kg/体重 |
| 1 Fr 聚氨酯导管 | Instechlabs INC., USA | C10PU-MCA1301 | 颈动脉 |
| 2 Fr 聚氨酯导管 | Instechlabs INC., USA | C20PU-MJV1302 | 颈静脉 |
| Vasofix安全型套管针 20G | B.Braun Medical | 4268113S-01 | 经口气管插管 |
| 8-0编织丝线缝合线 | Ashaway Line & Twine Mfg. Co., USA | 75290 | 结扎用 |
| 异氟烷 | Piramal Critical Care Deutschland GmbH | PZN:9714675 | 麻醉 |
| CLINITUBES 血液毛细管 | Radiomed GmbH | 51750132 | 采血量60–95微升 |
| 弹簧剪刀 - 6 mm刀头 | Fine Science Tools GmbH | 15020-15 | 器械 |
| 弹簧剪刀 - 2 mm刀头 | Fine Science Tools GmbH | 15000-03 | 器械 |
| Halsted-蚊式止血钳 | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | 器械 |
| Dumont #55镊子 | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | 器械 |
| Castroviejo显微持针器 - 9 cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | 器械 |
| 显微止血夹 | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | 器械 |
| Bulldog 止血夹 | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | 器械 |
| MiniVent 小鼠呼吸机（型号845） | Harvard Apparatus | 73-0044 | 机械通气 |
| 异氟烷蒸发器 Drager 19.1 | Drägerwerk AG & Co. KGaA | 麻醉浓度1.3–2.5% | |
| PowerLab 数据采集装置 4/35 | ADInstruments Ltd, New Zealand | PL3504 | 有创血压、心电图、体温 |
| ABL 800 Flex | Radiometer GmbH | 血气分析 | |
| NMRI小鼠 | Charles River Laboratories | Crl:NMRI(Han) | 雄性，体重30–35 g，12周龄，实验前至少饲养1周 |
参考文献
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