套细胞淋巴瘤（MCL）是一种难以治疗的B细胞疾病，建立用于研究和开发治疗方法的原发性MCL异种移植小鼠模型同样具有挑战性。本文中，我们描述了在小鼠中成功建立MCL异种移植模型的方法，以帮助深入理解其潜在的生物学特性。
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本文内容
摘要
摘要
B 淋巴细胞在免疫细胞循环中起关键作用，主要归巢并驻留在淋巴器官中。正常 B 细胞仅在 T 淋巴细胞刺激下增殖，而肿瘤性 B 细胞则能在未明确定义的器官微环境中自主存活并扩增。套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma, MCL）即为一种此类 B 细胞疾病，患者中位生存期为 4 至 5 年。因此，亟需开发有效策略，阻断这些细胞的归巢与植入，以延长患者的生存时间。为此，需建立异种移植小鼠模型，用于研究通过抑制归巢机制来评估 MCL 治疗药物的有效性 体内 至关重要。长期以来，人们一直致力于开发用于人体细胞异种移植以测试早期药物的动物受体，因为相关的临床前小鼠模型对于筛选新的治疗药物至关重要。该动物模型的建立旨在避免人体移植物排斥反应，并为人类疾病构建研究模型，可能成为研究不同类型淋巴瘤疾病进展以及对血液系统恶性肿瘤（如套细胞淋巴瘤，MCL）候选药物进行临床前测试的极为有用的工具。我们建立了一种异种移植小鼠模型，可作为研究和开发MCL新型治疗策略的优良资源。
引言
淋巴细胞在免疫监视中起着重要作用，而淋巴细胞迁移是启动抗原特异性免疫的关键步骤1,2。该过程包括初始T淋巴细胞从胸腺迁移至血液，并进一步迁移至次级淋巴器官（如淋巴结、派伊尔集合淋巴结或脾脏），在这些部位与相应的抗原相遇。B淋巴细胞在骨髓中分化，并以初始细胞形式迁移至次级淋巴器官的滤泡中3。部分B细胞通过其受体结合抗原，并由特异性T细胞激活。这些B细胞的增殖和分化将未激活的初始B细胞推入滤泡的外套层。激活后的细胞可进一步分化为在体内巡逻的记忆B细胞，或成熟为分泌免疫球蛋白的浆细胞，并迁移至骨髓4。
套细胞淋巴瘤（MCL）发生于生发中心周围套区的初始B淋巴细胞转化为肿瘤细胞时。这些淋巴瘤细胞定位于淋巴器官的微环境中，可在无特定T淋巴细胞调控的情况下自主增殖。然而，当肿瘤细胞达到一定密度时，便会离开原有微环境，进入血液循环，继而迁移至其他器官寻找新的定植位点。鉴于黏附分子的复杂性以及趋化因子与其受体之间广泛存在的交叉反应性，该类细胞迁移的分子机制 体内 其机制尚不明确，因而阻碍了治疗。需要开发新方法以有效阻断这一迁移过程，防止淋巴瘤B细胞到达新的微环境。
套细胞淋巴瘤（MCL）是最难治疗的B细胞恶性肿瘤之一。MCL肿瘤表型的发展是一个多步骤级联过程，其特征是获得独特的生物学特性。在诊断时，大多数患者（70%） already 存在播散性疾病，其中多数病例出现脾脏、骨髓和/或胃肠道等结外受累5,6。在接受治疗的患者中，尽管传统化疗在短期内可诱导较高的缓解率，但在数年内常出现耐药性肿瘤的复发7,8。本文介绍了一种有助于理解MCL播散及其潜在生物学机制的新疾病模型：我们建立了一种源自患者原发肿瘤细胞的人源MCL异种移植小鼠模型。我们希望该模型有助于开发针对MCL播散的治疗策略，并可能为复发患者的优化诊断和治疗提供新的临床视角。
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方案
人血样使用均依照日内瓦大学医院当地伦理与人体实验委员会批准的程序进行。
动物实验遵循瑞士日内瓦机构动物护理伦理委员会和州兽医办公室的规定（许可编号：GE/26/15）。
1. 通过密度梯度离心法分离制备外周血单个核细胞（PBMCs）
注意：从处于白血病期的套细胞淋巴瘤（MCL）患者中采集 3 - 5 mL 外周血。诊断依据流式细胞术的标准诊断标准（CD5+、CD23−、CD200+、单克隆B细胞群）确立，并通过染色体易位 t(11;14) 的存在以及细胞周期蛋白 D1 的过表达进一步确认。在所有病例中，单克隆B细胞占总B细胞群体的 >90%。其余细胞主要为单核细胞及少量T细胞。
- 将5 mL MCL血液样本与5 mL Roswell Park Memorial Institute 1640培养基（RPMI）按1:1比例稀释（图1A）。
- 使用前将密度梯度介质（材料表）反复颠倒数次，以确保充分混匀。
- 用移液器吸取5 mL密度梯度介质加入15 mL离心管中。
- 用移液器将稀释后的血液样本轻柔地铺在15 mL离心管中的密度梯度介质上方（血液与密度梯度介质的体积比应为2:1，例如，10 mL血液加5 mL密度梯度介质）。注意避免两层液体混合（图1B，C）。
- 将样本在室温下以400 × g离心40分钟，离心机刹车关闭。
- 使用无菌巴斯德吸管，小心吸取中间层（呈乳白色、薄环状，箭头所示处（图1D，E））含有单个核细胞的部分，并将其转移至一支洁净的离心管中。
- 单个核细胞的洗涤
- 估计所转移细胞悬液的体积，并加入3倍体积的含1%牛血清白蛋白（BSA）的无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）。
- 通过反复吹打数次混匀细胞悬液。
- 在室温下以400 - 500 × g离心10 - 15分钟。
- 弃去上清液，获得细胞沉淀，并重复洗涤步骤一次。
- 去除上清液，将细胞重悬于所需体积的缓冲液中，例如，1或2 mL PBS中。
- 使用自动细胞计数仪或血细胞计数板（Neubauer计数室）对细胞数量进行计数。
2. 通过B细胞阴性选择富集B细胞
- 用 PBS 将细胞稀释至终浓度为 50 × 106 个细胞/mL。
- 将细胞转移至 5 mL 圆底聚苯乙烯管中。向 2 mL 细胞悬液中加入 B 细胞富集试剂盒中的 100 µL 抗体混合液，通过上下吹打轻轻混匀（图 2-1）。
- 室温孵育 10 分钟。
- 将 B 细胞富集试剂盒中提供的磁性颗粒短暂涡旋振荡 30 秒（图 2-2），然后向 2 mL 样品中加入 150 µL 磁性颗粒。
- 样品再于室温孵育 5 分钟。
- 用含 2% 胎牛血清（FCS）和 1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）的 1×PBS 将样品体积调至 2.5 mL。将试管放入磁架中，继续孵育 3–5 分钟（图 2-3）。
- 手持磁架并保持试管在位，连续动作倾倒试管，使富集后的细胞悬液转移至新的洁净试管中（图 2-4）。使用自动细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数，以获得 B 细胞的总回收量。
注意：通常情况下，正常 B 细胞的回收量约为 ~105 个 B 细胞/mL，套细胞淋巴瘤（MCL）样本的回收量为 5–50 × 106 个细胞/mL。 - 确认 B 细胞富集纯度
- 取约 50,000 个细胞，与不同荧光染料标记的抗 CD19/CD20 抗体（1:20 稀释）和抗 CD45 抗体（1:10 稀释）在室温下孵育 15–30 分钟。
- 用 1 mL 的 1×PBS + 1% BSA 洗涤，400–500 × g 离心 5 分钟，将细胞重悬于约 200 µL PBS 中。
- 通过流式细胞术检测细胞样本，并分析 B 细胞纯度。该方法获得的纯度通常 >90%（图 3）。
3. 异种移植小鼠模型的建立
- 重悬约 40 - 60 × 106 150 - 200 µL 的 1x PBS 中的细胞（每只小鼠注射所需体积）。
- 将150 µL细胞悬液经尾静脉静脉注射（i.v.）注入6至7周龄免疫缺陷型NOD scid gamma（NSG）小鼠，性别不限。图4A).
- 让小鼠发育人淋巴瘤约10周。
注意：原代人类淋巴瘤细胞形成肿瘤所需时间远长于人类淋巴瘤细胞系（约3周）。 - 当动物开始出现体重减轻、毛发竖立、活动减少、后肢瘫痪等致命疾病的症状时， 等等。，通过 CO 处死小鼠2 窒息后经心脏穿刺取血。
- 通过解剖小鼠采集骨髓、脾脏和肝脏等不同器官，并在处死时经心脏采血以收集外周血，用于肿瘤移植分析（图4B - F).
4. 不同器官中移植肿瘤细胞的嵌合体分析
- 在收集不同器官后，通过机械破碎处理样本，先进行红细胞（RBC）裂解，再制备单细胞悬液：血液和骨髓使用 200 µL 1× 氯化铵钾缓冲液，脾脏使用 500 µL，肝脏使用 2 mL。
- 使用人B细胞特异性抗体对细胞进行计数和染色， 即抗CD19、抗CD20和抗CD45。
注意：NSG 小鼠缺乏 B 细胞，因此在分析时，细胞需用特异性针对人类 B 细胞的标记物进行染色。 - 通过流式细胞术分析各器官来源的细胞，设门圈选B细胞（CD19+、CD20+、CD45+）。
- 根据第4.3步中设定的门控细胞，定量分析MCL注射小鼠不同器官中移植的肿瘤细胞图 4G) .
注意：参见 材料表 详情请见。
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结果
该论文描述了一种优化的实验方案，可用于成功建立套细胞淋巴瘤（MCL）细胞移植的异种移植小鼠模型。获得纯化的细胞群体（在本研究中为MCL细胞）对于成功构建MCL异种移植模型至关重要。 图1 代表通过密度梯度离心法从套细胞淋巴瘤（MCL）患者血液中分离单个核细胞的制备步骤。进一步使用阴性B细胞富集试剂盒对单个核细胞进行处理，以获得高纯度的B细胞群体，用于移植至小鼠体内。为确保MCL细胞成功植入，应尽可能提高细胞纯度。采用该方法获得的细胞纯度通常为 >90%。剩余细胞主要为单核细胞及少量T细胞（数据未显示）。
图2展示了方法部分所述B细胞纯化方案的不同步骤。通过流式细胞仪使用多种标记物（CD45、CD19、CD20、CD23、CD200、CD5、kappa和lambda）对富集后的细胞进一步分析其纯度。如
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讨论
对于处于研发后期阶段的药物可以开展临床试验，但临床试验不适用于药物发现。长期以来，人们一直致力于开发可接受人类细胞异种移植的动物受体，以用于测试早期阶段的药物。本文介绍一种能够避免人类移植物排斥反应的动物模型，并可用于建立人类疾病（如MCL）的研究模型。目前，这是一种最先进的异种移植模型，可用于研究人类肿瘤移植及肿瘤生长的机制。本研究采用NSG小鼠，这是迄今免疫缺陷程度最高的小鼠模型之一，可显著提高淋巴瘤移植的成功率。NSG小鼠缺乏成熟的T细胞、B细胞和NK细胞，同时存在细胞因子信号传导障碍以及固有免疫应答缺陷。
通过密度梯度法从原发性套细胞淋巴瘤（MCL）样本中制备淋巴细胞是去除红细胞和血小板等其他细胞类型的重要步骤。传统上，密度梯度离心法可有效分离淋巴细胞。为进一步富集B细胞群体，可按照本文所述方案使用B细胞富集试剂盒对这些淋巴细胞进行后续处理。为实现淋巴瘤细胞的最佳移植效果，应确保获得高纯度的B淋巴细胞群体。MCL细胞通过静脉注射方式注入（至少40–60 × 10⁶个细胞）。6 通过尾静脉每只小鼠注射细胞，随后让小鼠自由发展淋巴瘤，最长观察期为10周。每...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作得到了日内瓦抗癌联盟、Dr. Dubois Ferriere Dinu-Lipatti 基金会、Oncosuisse KPS-OCS（项目号：OCS-02260-08-2008 和 2914-02-2012）以及瑞士国家科学基金会资助项目 31003A_156760 和 310030-153456 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 菲可-泛介质 | GE Healthcare | 17-1440-02 | 用于分离单个核细胞 |
| RPMI 1640 培养基 | Gibco-Life technologies | 61870-010 | 用于稀释血液样本 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | D8537 | 用于细胞洗涤 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A8412 | 用于配制含1% BSA的PBS，用于细胞分离过程中的洗涤 |
| CD19-APC700 | Beckman Coulter | B49212 | 人全B细胞标记物 |
| CD20-APC | Beckman Coulter | A21693 | 人全B细胞标记物 |
| CD20-ECD | Beckman Coulter | IM3607 | 人全B细胞标记物 |
| CD5-PC 5.5 | Beckman Coulter | PN A70203 | 人T细胞标记物 |
| CD23-PE | Pharmingen | 555711 | 通常在套细胞淋巴瘤（MCL）中缺失的细胞表面蛋白 |
| CD45 KO | Beckman Coulter | B36294 | 全白细胞标记物 |
| CD200-PE | Pharmingen | 552475 | 通常在套细胞淋巴瘤（MCL）中缺失的细胞表面蛋白 |
| NOD scid gamma（NSG）小鼠 | Charles River Laboratories | 5557 | 本研究中用于建立MCL异种移植模型 |
| EasySep人B细胞富集试剂盒 | Stem cell technologies | 19054 | 用于富集B细胞，以获得纯化的细胞用于注射至小鼠体内 |
| FACS | Beckman Coulter | Navios | 用于表征MCL样本及检测器官中MCL的移植情况 |
| 1× 氯化铵钾缓冲液 | 红细胞裂解缓冲液（NH4Cl 8,024 mg/L；KHCO3 1,001 mg/L；EDTA.Na2·2H2O 3.722 mg/L） |
参考文献
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