患者胶质母细胞瘤切除组织中细胞微环境的定量免疫组织化学分析

摘要

本方案旨在利用显色免疫组织化学法和ImageJ软件，对胶质母细胞瘤患者切除组织中的肿瘤微环境组分进行定量鉴定。

摘要

随着人们对肿瘤微环境的兴趣日益增长，我们着手开发一种方法，用于特异性地确定胶质母细胞瘤患者样本中微环境的组成成分。胶质母细胞瘤是最致命且最具侵袭性的脑癌。定量方法不仅有助于准确描述病变组织，还可能促进更精确的预后判断、诊断以及组织工程系统和替代物的开发。在胶质母细胞瘤中，胶质细胞（如小胶质细胞和星形胶质细胞）已被病理学家分级独立证实与不良预后相关。然而，这些细胞及其他胶质细胞组分的状态尚未得到充分的定量描述。这可能具有挑战性，因为这些胶质细胞具有显著的大范围突起结构。此外，大多数组织学分析集中于整体组织样本或仅限于肿瘤主体区域，而未能根据高度异质性组织内的不同区域进行区分量化。本文中，我们描述了一种方法，用于识别和定量分析胶质母细胞瘤患者肿瘤切除标本中肿瘤主体及其邻近区域的胶质细胞群体。我们采用显色免疫组织化学法识别患者肿瘤切除样本中的胶质细胞群体，并利用ImageJ分析每种胶质细胞群体染色的覆盖百分比。通过这些技术，我们能够更全面地描述胶质瘤肿瘤微环境中不同区域的胶质细胞分布情况。

引言

胶质母细胞瘤（GBM）是最常见且恶性程度最高的脑癌，其特征是肿瘤主体细胞高度弥漫性地侵入周围健康的脑实质^1,2。这种弥漫性侵袭使得肿瘤难以完全切除，而治疗后残留的侵袭性癌细胞是导致肿瘤不可避免复发的最常见原因^2,3,4。我们先前发现，抑制胶质瘤细胞的弥漫性侵袭具有治疗益处⁵，然而目前对促进GBM侵袭的复杂机制仍知之甚少。肿瘤微环境，即肿瘤周围的组织，在多种癌症的进展中已被证实发挥重要作用^6,7。特别是胶质母细胞瘤的肿瘤微环境，其特征尚不充分，且具有独特的复杂性，包含多种胶质细胞（如星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞）、细胞外基质、可溶性因子以及生物物理因素。实验研究表明，星形胶质细胞和小胶质细胞可促进胶质瘤的进展和侵袭^8,9,10，但人类大脑原生微环境中所有胶质细胞的具体组成仍不清楚。

我们先前通过定量分析胶质母细胞瘤微环境中的细胞成分，并将分析结果纳入比例风险模型，证明了微环境成分可预测患者的生存率¹¹。本文中，我们描述了一种定量分析方法，用于识别胶质母细胞瘤患者肿瘤切除组织中肿瘤实质及邻近区域内的胶质细胞群体。我们采用显色免疫组织化学法标记胶质细胞群体，并使用ImageJ分析每种胶质细胞群体染色的百分覆盖面积。评估染色百分覆盖面积可为判断细胞形态学差异提供一种简便的测量方式，尤其适用于受癌细胞相互作用影响的细胞。以往对组织病理学染色的定量研究通常采用苏木精-伊红染色¹²或马松三色染色¹³等常规染色方法，这些方法无法充分利用基于抗体的免疫组织化学染色所具有的特异性。本方法旨在直接定量胶质母细胞瘤患者肿瘤切除组织中的胶质细胞群体，以期揭示复杂的胶质母细胞瘤微环境。

方案

本方案用于鉴定福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中的细胞组分，这类样本在储存的临床患者样本中较为常见。石蜡包埋能够最佳地维持细胞和组织形态，并具有更长的切片保存期限。本分析所用样本来自弗吉尼亚大学生物样本库与组织研究设施。神经病理学家根据明确诊断为胶质母细胞瘤（星形细胞瘤，WHO IV级）的患者样本进行筛选，这些患者于2010年至2013年间在弗吉尼亚大学完成了肿瘤切除手术，且所有样本在本分析前均已去标识化¹¹。

1. FFPE 样本脱蜡和水化

注意：本实验步骤部分专用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品。尽管石蜡包埋样品由于能更好地保存细胞和组织形态，因此在本分析中更具优势，但本分析也可使用冷冻切片进行。若使用冷冻切片，可省略本部分操作，直接进入显色免疫组织化学步骤。

1. 依次进行以下洗涤，每步5分钟：二甲苯，二甲苯，100% 乙醇，100% 乙醇，95% 乙醇，95% 乙醇，70% 乙醇，去离子水，去离子水

2. 抗原修复

注意：本实验步骤的这一部分旨在破坏福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本在固定过程中形成的亚甲基交联桥，从而暴露抗原位点，以便抗体能够结合。

1. 按照生产商的建议，用蒸馏水稀释基于Tris的高pH抗原修复液。
2. 使用微波炉进行热介导抗原修复。其他形式的热介导修复方法（如压力锅、蔬菜蒸锅或沸水）也可达到同样效果。
   1. 将稀释后的修复液加入一个非密封的可微波容器中。将切片放入容器，再将容器放入微波炉。
   2. 以高功率煮沸20分钟。注意观察液体蒸发情况，并根据需要补充蒸馏水。
3. 让样本在室温下于修复液中冷却1小时。

3. 染色免疫组织化学

1. 使用疏水性笔勾画组织样本轮廓，以减少覆盖样本所需的试剂体积。
   注意：务必保持组织样本湿润，避免其干燥，否则会影响染色效果。
2. 加入足量的通透化溶液（Tris缓冲盐水（TBS）+ 0.01% Triton-X），以完全覆盖组织样本（通常约为100–200 µL）。
3. 移除并弃去溶液，重复步骤3.2。
4. 在室温下用封闭液（2.5% 马血清 + 通透化溶液）孵育样本。
5. 在4 ºC下用封闭液稀释的一抗溶液孵育样本过夜。
   注意：本实验中所有一抗的稀释比例均为1:200，但最佳稀释比例可通过从厂家推荐浓度开始进行系列稀释来确定。本方案所用抗体的详细信息此前已有发表¹¹。
6. 根据厂家说明书，使用与一抗宿主动物对应的辣根过氧化物酶聚合物试剂检测一抗。
7. 加入足量通透化溶液以覆盖组织样本，并孵育5分钟。
8. 移除并弃去溶液，重复步骤3.7。
9. 将切片在含0.3% H₂O₂的1x TBS溶液中孵育15分钟。
10. 使用过氧化物酶底物二氨基联苯胺（DAB）显色2–10分钟，直至达到理想的染色强度。
11. 对样本进行复染以识别细胞核，例如根据厂家说明书使用苏木精染色。
12. 使用100%乙醇和二甲苯对样本进行脱水处理。
13. 使用封片介质对样本进行永久封片。

4. 感兴趣区域的识别

1. 使用明场显微镜拍摄能够获得高分辨率图像的样本切片。
   注：对细胞组分成像时，分辨率至少应达到 20x。
2. 将相机移动至组织样本中的特定感兴趣区域。
3. 将图像保存为 TIFF 文件以进行定量分析。

5. 图像分析

1. 在 ImageJ 中打开图像，用于量化覆盖率百分比。
2. 使用阈值颜色插件去除苏木精染色细胞核中的紫色。
3. 将图像转换为8位。
4. 添加阈值，不使用暗色背景。
5. 使用17种预加载的ImageJ阈值滤波器之一处理图像即 最大熵值法（MaxEntropy），因此仅包含DAB染色部分进行阈值处理。
   注意：选择最佳的预设阈值滤波器，以最大程度减少背景染色的干扰。阈值的选择可能取决于染色质量和抗体的特异性。同一患者样本内的所有技术重复应使用相同的阈值。
6. 应用阈值。
7. 测量阈值化图像的面积百分比。
8. 每个样本内多个区域的平均百分比面积覆盖率。

结果

对于本分析，在我们的肿瘤切除样本中选取两个感兴趣区域——原发肿瘤主体和邻近区域，后者主要由含有弥散性浸润癌细胞的健康组织构成图1A, 1B）由合作的神经病理学家在苏木精-伊红染色的患者样本上鉴定确认。在每个患者样本中，星形胶质细胞呈阳性染色（图1C）、小胶质细胞（图1D）和少突胶质细胞（图1E通过显色免疫组织化学方法鉴定出这些细胞群，所用的一抗分别为ALDH1L1、Iba1和少突胶质细胞特异性蛋白（OSP1）。¹¹建议优化抗体稀释度，并参考生产商提供的实验方案，以确认染色结果准确且呈阳性图2）。例如，我们进行了不加一抗的染色作为阴性对照（图 2A

讨论

本文提出的方法是一种用于分析经传统显色免疫组织化学染色的组织学样本的定量分析方法。目前此类分析的常规方法包括类似的染色方案，随后由独立的病理学家进行评分。该方法虽已较为可靠，但在许多应用中仍需要对细胞组成有更精确的理解，例如更深入地了解肿瘤相关的异质性，以及在体外研究中对肿瘤进行准确的重现。

本方案展示了一种定量分析脑肿瘤微环境中胶质细胞群体的简便技术。该技术具有广泛的适应性，可扩展用于鉴定微环境中的许多其他组分，例如血管、趋化因子等，也可用于其他类型的癌症，如乳腺癌或胰腺癌，其中肿瘤切除样本可能具有更大的实质区域。此外，该技术还可进行调整以获取其他测量参数，例如细胞计数、细胞周长以评估细胞形态，以及更复杂的形态学指标，如各向同性、聚集性、取向性等。这些技术不仅限于癌症研究，因为此类染色与定量方法可应用于任何脑组织分析，正如我们在代表性健康组织的蛋白图谱定量分析中所展示的，以及我们先前发表的与癫痫脑组织的比较研究¹¹所示。

本方案中的关键步骤包括显色二抗的适当孵育与显色。需注意避...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二甲苯	Fisher Chemical	X3P
乙醇
高pH抗原修复液	Vector Labs	H-3301
Tris缓冲盐水（TBS）
吐温-X	Amresco	9002-93-1
马血清
抗ALDH1L1抗体	abcam	ab56777
抗Iba1抗体	abcam	ab5076
抗少突胶质细胞特异性蛋白1抗体	abcam	ab53041
ImmPRESS 抗山羊二抗	Vector Labs	MP-7405
ImmPRESS 通用型（抗小鼠/兔）二抗	Vector Labs	MP-7500
过氧化氢	Sigma Aldrich	216763
ImmPACT DAB底物	Vector Labs	SK-4105
苏木精复染剂	ThermoScientific	72404
Histochoice封片介质	Amresco	H157-475
Aperio Scanscope	Leica Biosystems
Image Scanscope	Leica Biosystems
Super HT PAP笔	Research Products International	195506