使用改良的微流控嗅觉芯片对雄性 C. Elegans 头部神经元中信息素诱导的神经元活动进行成像

摘要

本文介绍了一种改良的"嗅觉芯片"，用于高效进行秀丽隐杆线虫（C. elegans）雄虫的钙成像。同时展示了雄虫暴露于甘油和一种信息素的研究结果。

摘要

钙指示剂的使用极大地增进了我们对神经动态及其调控机制的理解。线虫 秀丽隐杆线虫，其神经系统已完全绘图且解剖结构透明，是利用钙指示剂研究实时神经动态的理想模型。结合微流控技术和实验设计，可对自由移动和固定状态的动物均开展基于这些指示剂的钙成像研究。然而，以往大多数研究采用的固定装置（如 Chronis 所描述的嗅觉芯片） 等，已有专为更常见的雌雄同体线虫设计的装置，而较为少见的雄性线虫在形态学和结构上均存在差异。本研究设计并制作了一种改良的嗅觉芯片，以提高对年轻成年雄性个体神经元成像的效率。在蠕虫加载端口处加入了一个转弯结构，用于旋转动物个体，从而在二维成像中实现双侧成对神经元的分离。线虫在微流控装置内暴露于受控的气味流中，具体条件如先前针对雌雄同体研究所述。随后使用开源软件 ImageJ 分析钙瞬变信号。本文所述方法应有助于增加基于雄性线虫的 秀丽隐杆线虫 钙成像研究，加深了我们对性别特异性神经元信号传导机制的理解。

引言

微流控装置提供了对精确可控环境的更便捷访问，可在其中对线虫 C. elegans 等动物进行实验操作¹。这些研究包括行为学检测、钙成像研究，甚至特定表型的筛选，从而实现对实验结果更精确的测量^1,2,3,4,5,6。微流控技术可通过小规模液体环境开展细致实验，同时仅需极少量试剂。新型微流控装置设计不断涌现，其用途各异：有的用于行为学检测和神经成像研究中支持 C. elegans 自然正弦运动的实验区域，有的为神经成像和嗅觉研究中使用的捕获装置，还有的适用于遗传筛选中的高通量表型分析^4,5,6,7。在制备出主模具后，微流控装置的构建成本低廉——由于主模具可重复使用——且操作简便，可通过高通量研究快速生成数据。....

方案

1. 器件制备

注意：参见参考文献¹。

注意：硅胶母模采用标准的光刻技术制备，用于在硅基底上对 SU-8 光刻胶进行图形化^1,7。晶圆图形化的掩膜版以 25,000 dpi 打印。该雄性适配装置采用了 Chronis 嗅觉芯片设计¹⁹，并对线虫加载口进行了修改，该设计源自 M. Zimmer（个人通讯，2016 年）。装置中包含一个弯道结构，用于控制动物的旋转方向。线虫加载口通道的宽度收窄至 50 μm。所有通道的高度均为 32 μm。一旦用户获得硅胶母模，即可按照此前所述的后续操作步骤进行实验¹。

1. 按重量比10:1混合PDMS基础剂与固化剂。
2. 使用移液管充分混合。
3. 将混合物置于真空干燥器中脱气1小时，直至所有可见气泡完全消除。
4. 将混合物倒入直径为150 mm的培养皿中的硅胶模具母版上，使其厚度达到5 mm（约100 g）。使用巴斯德移液管除去混入混合物中的气泡或灰尘。
5. 在65 °C下烘烤至少3小时，或过夜。
6. 使用解剖刀将PDMS从模具上剥离....

结果

整体装置设置的示例如图1A-B所示。图1A展示了正确的储液池结构与设置方式。图1B显示了储液池与微流控装置之间的连接方式。图1C展示了一个带有各个端口标注以增强清晰度的微流控装置。

男性适应型微流控装置的设计在加样口处包含一个弯曲结构，但其流体动力学特性与Chronis et al.¹⁹(图2A-2C)设计的装置相同。通过调节开放的流控阀门，可控制缓冲液的流动（图2A.......

讨论

这种适用于雄性个体的嗅觉芯片设计包含一个通向更窄加载口的弯道，可更精确地控制线虫的方向，并高效捕获雄性 C. elegans。该设计使得神经元双侧成对结构中的左侧和右侧成员均可被同时观察，无需进行Z轴层扫成像。对于仅有一对双侧神经元被荧光标记的线虫（例如 ASH 神经元），该弯道可使线虫100%偏离垂直方向（图2D-E）^29,30。然而，对于具有四个呈辐射对称排列神经元的神经元类型（如 CEM 神经元），仅有三分之一的线虫能够同时观察到全部四个神经元；另三分之一的线虫仅能观察到其中三个神经元；在剩余三分之一的线虫中，仅能区分背侧与腹侧的细胞体，而无法分辨左右不对称性（数据未显示）。该更窄的入口与较低的微通道高度相结合，可防止线虫在Z轴方向上发生波动。这一设计为未来雄性线虫的研究提供了成像便利，结合日益丰富的雄性连接组知识^25,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硅片	University Wafer	452
SU-8 2035	MicroChem	Y111070-0500L1GL
显影液	MicroChem	Y020100-4000L1PE
晶圆掩模	Cad/Art Services	-	定制订单，打印分辨率为 25,000 dpi。
Sylgard-184	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
1.0 mm 皮肤打孔器	Acuderm Inc.	P150
软管	Cole-Palmer	EW-06419-01
硬管	IDEX Health & Science	1622
针脚	New England Small Tube	NE-1027-12
阻断针	New England Small Tube	0.415/0.425" 外径 × 0.500 英寸长	批次 PB07027
3 mL 注射器	BD	309657
30 mL 注射器	Vitality Medical	302832	用作缓冲液储液槽。
23 号不锈钢钝头针，聚丙烯鲁尔接头	Component Supply Company	NE-231PL-50
带鲁尔接头的三通旋塞阀，公端锁紧，5 种流路模式，非无菌	Cole-Palmer	EW-30600-07
Fisherfinest Premium 盖玻片	Fisher Scientific	12-548-5M
Mercator 控制系统 LF-5 等离子体系统	Mercator	LF-5
Scotch 透明胶带	Scotch	BSN43575
Series 20 腔室	Warner Instruments	P-2
真空干燥器	Bel-Art Scienceware	420250000	内径 24 cm。
称量舟	Cole-Palmer	EW-01017-27
Classic Plus 天平	Mettler Toledo	PB1501-S/FACT
玻璃巴斯德吸管	Cole-Palmer	EW-25554-06
移液管	Genesee Scientific	30-202
烘箱	Sheldon Manufacturing Inc	9120993	型号：1500E。
60 mm，无通气孔，锐边培养皿	TriTech Research	T3308
Zeiss Axio Observer.A1	Zeiss	-
Hammamatsu Orca Flash 4.0 数字 CMOS 相机	Hammamatsu	C11440-22CU
蓝色荧光灯	Lumencor	SOLA SM6-LCR-SA	24–30 V/7.9 A 直流电。
照明适配器	Zeiss	423302-0000
Series 1 和 2 微型惰性聚四氟乙烯隔离阀	Parker	001-0017-900	用于控制流体的三通阀。
ValveLink8.2®	AutoMate Scientific	01-18	流量开关控制器
Micro Manager	Micro-Manager	-	免费软件，可从以下网址下载：https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release
ImageJ	ImageJ	-	免费软件，可从以下网址下载：https://imagej.nih.gov/ij/download.html
琼脂，细菌级	Apex	9012-36-6
蛋白胨	Apex	20-260
CaCl2	VWR	BDH0224-1KG
MgSO4	Sigma-Aldrich	230391-1kg
胆固醇	Alfa Aesar	A11470
乙醇	Sigma-Aldrich	270741-4L
四咪唑	Sigma-Aldrich	L9756-10(G)	4 °C 保存。
荧光素	Sigma-Aldrich	FD2000S-250mg	对光敏感。应储存在避光小瓶中。
甘油	Sigma-Aldrich	G6279-1L
Ascaroside #3	-	-	由康奈尔大学 Schroeder 实验室合成。
NaCl	Genesee Scientific	18-215
KH2PO4	BDH	BDH9268.25
K2HPO4	J.T. Baker	3252-025
ASH GCaMP3 品系	-	-	CX10979（KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/μL]）。由 Bargmann 实验室构建，由 Albrecht 实验室文库提供。
CEM GCaMP6 品系	-	-	JSR49（FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]；pha-1(e2123ts)；him-5(e1490)；lite-1(ce314)）。由 Robyn Lints 构建，由 Srinivasan 实验室文库提供。
E. coli (OP50)	Caenorhabditis 遗传中心	OP50
"储液槽"	-	-	制备储液槽的方法：将一个 "30 mL 注射器" 连接到一个 "带鲁尔接头的三通旋塞阀，公端锁紧，5 种流路模式，非无菌"，该旋塞阀再连接一个 "3 mL 注射器" 和一个 "23 号不锈钢钝头针，聚丙烯鲁尔接头"。将 "23 号不锈钢钝头针，聚丙烯鲁尔接头" 插入 "软管"，插入深度约为针头长度的三分之一。