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使用改良的微流控嗅觉芯片对雄性 C. Elegans 头部神经元中信息素诱导的神经元活动进行成像

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DOI：

10.3791/56026

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2017年9月7日

 ,  ,  , 
1Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute

本文内容

摘要

本文介绍了一种改良的"嗅觉芯片"，用于高效进行秀丽隐杆线虫（C. elegans）雄虫的钙成像。同时展示了雄虫暴露于甘油和一种信息素的研究结果。

摘要

钙指示剂的使用极大地增进了我们对神经动态及其调控机制的理解。线虫 秀丽隐杆线虫，其神经系统已完全绘图且解剖结构透明，是利用钙指示剂研究实时神经动态的理想模型。结合微流控技术和实验设计，可对自由移动和固定状态的动物均开展基于这些指示剂的钙成像研究。然而，以往大多数研究采用的固定装置（如 Chronis 所描述的嗅觉芯片） 等，已有专为更常见的雌雄同体线虫设计的装置，而较为少见的雄性线虫在形态学和结构上均存在差异。本研究设计并制作了一种改良的嗅觉芯片，以提高对年轻成年雄性个体神经元成像的效率。在蠕虫加载端口处加入了一个转弯结构，用于旋转动物个体，从而在二维成像中实现双侧成对神经元的分离。线虫在微流控装置内暴露于受控的气味流中，具体条件如先前针对雌雄同体研究所述。随后使用开源软件 ImageJ 分析钙瞬变信号。本文所述方法应有助于增加基于雄性线虫的 秀丽隐杆线虫 钙成像研究，加深了我们对性别特异性神经元信号传导机制的理解。

引言

微流控装置提供了对精确可控环境的更便捷访问，可在其中对线虫 C. elegans 等动物进行实验操作1。这些研究包括行为学检测、钙成像研究，甚至特定表型的筛选，从而实现对实验结果更精确的测量1,2,3,4,5,6。微流控技术可通过小规模液体环境开展细致实验，同时仅需极少量试剂。新型微流控装置设计不断涌现，其用途各异：有的用于行为学检测和神经成像研究中支持 C. elegans 自然正弦运动的实验区域，有的为神经成像和嗅觉研究中使用的捕获装置，还有的适用于遗传筛选中的高通量表型分析4,5,6,7。在制备出主模具后，微流控装置的构建成本低廉——由于主模具可重复使用——且操作简便，可通过高通量研究快速生成数据。采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）等聚合物材料制造装置，可在数小时内完成新装置的制作。

钙成像研究利用在靶细胞中表达的基因编码钙指示剂（GECIs），实时测量这些细胞的神经动态8,9,10,11。C. elegans 的透明特性使得能够在活体动物中记录这些蛋白质的荧光水平。传统上，GECIs 依赖基于绿色荧光蛋白（GFP）的传感器——GFP-钙调蛋白-M13 肽（GCaMP），但近年来的研究已对这些传感器进行了改进，以获得更高的信噪比和红移的激发光谱。继 GCaMP3 开发之后，符合这些特性的蛋白质不断涌现，包括荧光衰减速率分别为慢速和快速的传感器 GCaMP6s 和 GCaMP6f，以及具有红移激活光谱的 RFP-钙调蛋白-M13 肽（RCaMP）。将这些 GECIs 与 C. elegans 细胞特异性基因启动子序列结合，可实现对特定细胞（尤其是感觉神经元）的靶向标记12,13,14,15,16。

尽管秀丽隐杆线虫（C. elegans）在微流控研究中的使用具有明显便利性，但几乎所有研究都集中于雌雄同体个体。尽管雄性个体在野生型种群中仅占0.01–0.02%，但对其表征仍可能带来不可估量的重要发现。虽然雌雄同体神经系统完整的物理连接组（connectome）数十年来已被全面绘制17，雄性个体的连接组仍不完整，尤其是在头部区域18。在雄性个体中应用钙成像技术将有助于理解雄性神经系统及其与雌雄同体之间的差异。成年雄性 C. elegans 体型较小，导致其难以在为体型较大的雌雄同体设计的传统嗅觉装置的加载端口内实现有效且可靠的固定。为解决这一问题，研究人员开发了一种改进版的Chronis嗅觉芯片19，其具有更窄的加载端口、更低的通道高度，以及带有转弯结构的线虫加载端口（可使线虫旋转），从而实现对左右双侧成对神经元的可视化观察。该设计具备以下优势：（1）可有效固定年轻成年雄性个体；（2）更可靠地调整线虫体位，以便同时观察双侧成对神经元的两个成员；（3）实现对雄性神经元神经活动的精确成像。

越来越多的研究表明，秀丽隐杆线虫（C. elegans）雄性对多种ascaroside（ascr，即线虫信息素）的反应与雌雄同体个体不同20,21,22,23,24。因此，深入理解雄性连接组中的神经动态过程及其表征变得愈发重要。雄性 C. elegans 拥有87个雌雄同体所没有的性别特异性神经元25,26，这些神经元以尚未明确的方式改变了连接组的结构。能够成像这些独特的神经动态，将有助于我们更深入地理解性别特异性的神经反应及其表征机制。

本方案描述了使用雄性适配的嗅觉芯片对雄性 C. elegans 化学感应神经活动进行成像的方法。伤害性感觉神经元 ASH 对 1 M 甘油产生可靠反应，这与此前对雌雄同体的研究结果一致27。暴露于ascaroside可能引发个体间差异较大的反应，因此需要检测更多数量的动物。此前通过膜片钳电生理和钙成像研究均已证实，雄性特异性CEM神经元对 ascaroside #3 的反应具有变异性23。

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方案

1. 装置制备

注意：参见参考文献1。

注意：硅胶母模采用标准的光刻技术制备，通过在硅基底上图形化 SU-8 光刻胶实现1,7。用于晶圆图形化的光掩模以 25,000 dpi 打印。该雄性适配装置采用 Chronis 嗅觉芯片设计19，并对线虫加样口进行了修改，改进的设计源自 M. Zimmer（个人通信，2016 年）。装置中包含一个弯道结构，用于控制动物的旋转方向。线虫加样口通道的宽度收窄至 50 μm。所有通道高度均为 32 μm。一旦用户获得硅胶母模，即可按照此前所述的后续操作流程进行实验1。

  1. 按重量比10:1混合PDMS基液与固化剂。
  2. 使用移液管充分混合。
  3. 将混合物置于真空干燥器中脱气1小时，直至所有可见气泡完全去除。
  4. 将混合物倒入直径为150 mm的培养皿中的硅胶模具母版上，使其厚度达到5 mm（约100 g）。使用巴斯德移液管去除混入混合物中的任何气泡或灰尘。
  5. 在65 °C下烘烤至少3小时，或过夜。
  6. 使用解剖刀将PDMS从模具上剥离，并用剃刀片将各个器件分离开。
  7. 使用1 mm皮肤打孔器打出入液口和出液口孔。
  8. 依次用dH2O、乙醇以及再次用dH2O冲洗孔道，以去除打孔过程中产生的颗粒。用脉冲气流将器件吹干。
  9. 用胶带清洁器件的两个通道面及上表面，去除残留的灰尘或碎屑，以确保后续键合成功。
  10. 将器件通道面向下，经等离子体键合至1号盖玻片上。
    1. 将盖玻片和器件（通道面向上）暴露于空气中等离子体处理，使用可实现良好键合的条件，例如100 W处理30秒，或24 W处理60秒。
      注意：可根据实际情况调整参数以提高键合效率。当试图提高键合效率时，等离子体处理条件的重要性低于充分清洁。即使在理想的等离子体条件下，清洁不充分的器件也无法实现键合。
    2. 将盖玻片翻转并贴合到器件的通道面，用拇指按压5秒。

2. 缓冲液的配制

  1. 从无菌的10倍浓缩储备液中稀释1倍S基础培养基（含100 mM NaCl和0.05 M KPO4，pH 6.0）。
  2. 将1 M 四甲基咪唑储备液稀释至所有缓冲液中的终浓度为1 mM，溶剂为1倍S基础培养基。
  3. 在“流体控制”和“缓冲液”储液槽中均加入荧光素。
    1. 在1倍S基础培养基中配制100 mg/mL的荧光素储备液。
    2. 将该储备液稀释至“流体控制”储液槽中的终浓度为1 µg/mL，缓冲液储液槽中的终浓度为0.1 µg/mL。
  4. 配制刺激物。
    1. 将甘油稀释至1倍S基础培养基中的终浓度为1 M。
    2. 将ascaroside #3（ascr#3）稀释至1倍S基础培养基中的终浓度为1 µM。

3. 设备设置

注意：参见1。

figure-protocol-1
图 1. 微流控装置设置。 (A) 储液池与管路。一个无活塞的 30 mL 注射器用作“储液池”，通过鲁尔阀连接，该阀具有三个流路选项。其中一个出口连接带有活塞的 3 mL 注射器，另一个出口连接一根针头（橙色），针头插入与微流控装置相连的管路中。(B) 微流控成像实验的整体设置。该装置置于倒置落射荧光显微镜的载物台上，位于物镜上方。用于“流体控制”的缓冲液通过一个三通阀，该阀由装置上方架子上的控制单元调节。含有缓冲液的管路随后插入微流控装置相应的端口。(C) 微流控装置的端口。“流体控制”端口位于其他入口端口的两侧，即“刺激”端口和“缓冲”端口。“出口”端口位于最右侧。由于线虫加样区域的位置，“线虫加样”端口位于装置最中央的位置。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 通过将一个30或60 mL注射器连接至三通鲁尔阀，并在同一鲁尔阀上连接一个带有针头的3 mL注射器（如图1A所示），准备三个流体储液槽。将针头连接至延伸至微流控装置的管路（如图1A-B所示）。
  2. 去除储液槽和管路中的气泡。
  3. 用1× S 培养基填充带有连接管路的3 mL注射器，并将其插入出口端口。
  4. 轻柔地推动注射器，直至缓冲液出现在入口孔的顶部。
  5. 将流体控制、缓冲液和刺激物管路连接至相应的入口孔（如图1B-C所示），确保加载端口孔和待连接的缓冲液管路末端均存在液滴。
  6. 再次轻柔地推动连接至出口端口的注射器，直至线虫加载端口入口处出现液滴。
  7. 将一根实心阻塞针插入线虫加载端口。
  8. 从出口端口取下注射器，并将出口管路连接至家用真空泵（-670 Torr）。
  9. 通过肉眼观察以及使用与所用相机兼容的软件（例如开源软件Micro-Manager）进行视频确认，检查装置流道中是否存在任何气泡。有关使用Micro-Manager的提示，请参见步骤6。
    1. 若存在气泡，在加载任何生物样本前，需等待气泡脱离或被PDMS壁吸收；气泡的存在会干扰装置内液体的正常流动。
  10. 使用GFP滤光片，在加载线虫前通过操作三通阀并观察缓冲液切换情况，确认装置内的流动动力学是否正常。
    1. 确定正确的流动动力学：当按下灌注控制器软件中对应于三通阀的控制按钮时，观察流体控制和缓冲液溶液中荧光素（图2D-2E）的变化情况（图1B）。
    2. 启动Micro-Manager后，点击“Live”以观察装置的实时图像。打开荧光光源以观察装置内缓冲液的流动情况（图2D-2E）。

figure-protocol-2
图2：一种适用于雄性线虫的微流控嗅觉芯片。（A）当线虫暴露于缓冲液时装置内的流体流动模式。缓冲液（B）以棕色表示，流体控制通道（FC）以黄色表示，刺激物（S）以白色表示。线虫加载口经过改造，增加了一个弯曲结构，有助于更好地控制线虫的方向。（B）当线虫暴露于刺激物时装置内的流体流动模式。缓冲液（B）以棕色表示，流体控制通道（FC）以黄色表示，刺激物（S）以白色表示。（C）实际加工出的改进型装置的尺寸测量结果。线虫加载口末端为42 µm的开口，通道宽度设计为50 µm，以适应雄性线虫的体型。尽管设计目标为25 µm，实测通道高度为32 µm。（D-E）一只被捕获并表达psra-6::GCaMP3的雄性线虫。sra-6启动子并非ASH神经元特异性表达，因此在ASI神经元中也可能观察到部分表达，但在ASI中未检测到钙瞬变信号。图像（D）为明场与荧光照明的叠加图像，而（E）仅为荧光图像。比例尺为42 µm。（F）ASH神经元对1 M甘油刺激产生强烈的神经活动反应。蓝色区域表示施加1 M甘油刺激的时间段。阴影区域表示标准误差范围，数据来自七只线虫的20次刺激脉冲。红色轨迹表示去极化反应。Y轴显示ΔF/F0。比例尺表示5 s。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 动物准备

注意：参见参考文献23。

  1. 利用1 M甘油处理成像ASH响应。
    1. 放置约20 秀丽隐杆线虫 雄性个体 p 阳性sra-6::将GCaMP3阵列表达于接种了OP50菌苔的线虫生长培养基（NGM）琼脂平板上 E. coli使用荧光GECI的表达和/或共注射标记物来鉴定含有目的基因阵列的动物。
      注意：阵列阳性动物将根据所使用的GECI呈现荧光即， 表达 GCaMP 的动物在蓝光刺激下会发出绿色荧光，而表达 RCaMP 的动物在绿光刺激下会发出红色荧光。共注射标记物可以是其他荧光蛋白（如 GFP 和 RFP），也可以是表型标记物，例如 rol-6，或能够挽救一种显性表型，例如 pha-1 突变28.
      1. 若在检测前立即挑选，应选取年轻成年雄虫；若在检测前一天挑选，则应选取L4期雄虫。
  2. 成像CEM反应 1 µM ascr#3.
    1. 挑选约20个L4期 秀丽隐杆线虫 雄性（fkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1] pha-1(e2123ts) him-5(e1490) lite-1(ce314)，其共同注射的 dsRed 标记物呈阳性表达。
      注意：与雄虫尾部四条 CEM 神经元中的 GCaMP 表达相比，射线神经元中 dsRed 的表达更容易观察和确认。
    2. 将这些雄虫从两性虫中分离，置于接种了OP50菌苔的NGM琼脂平板上 E. coli 在进行成像实验前，需孵育5-14小时。
      注意：未至少隔离5小时的雄性个体在行为上不会对ascr#3产生反应，因此其对ascaroside的钙瞬变反应可能比本实验观察到的更少。

5. 动物装载

注意：参见参考文献1。

  1. 使用标准的线虫培养技术，挑取一条线虫至未接种的NGM琼脂平板上。
    1. 用火焰灼烧接种环（由压扁的铂金丝制成），蘸取细菌后挑取线虫， "点样" 用挑虫针轻轻挑起线虫，将其轻柔地放置到新的培养皿上，使其自行爬离。
  2. 向未接种的平板中加入约 5 mL 的 1× S 基础培养基，使平板表面完全被液体覆盖。
  3. 将蠕虫吸入加样注射器中（即， 已预装1x S 基础培养基的3 mL注射器（带连接导管）
    1. 务必仅将蠕虫吸入管路中，而不要完全吸入注射器内。
      注意：如果线虫进入注射器，几乎不可能将其重新移回管道中。
  4. 关闭出口鲁尔阀以关闭真空，停止液体流动。
  5. 移除堵塞线虫加样口的固体针状物。
  6. 旋转连接至出口端口的鲁尔阀（图1B）以使其通风。
    注意：在装载线虫时使用实时视频监控，以确认动物的位置和方向（步骤 5.8–5.13）。
  7. 将线虫加样管插入线虫加样口。
  8. 轻轻按压注射器，直至线虫出现在加样通道中。
  9. 如果线虫开始尾部先进入通道，拉动注射器活塞以阻止线虫进入通道。
  10. 交替施加和反向压力，直至头部首先进入通道。
  11. 通过旋转连接出口端口的三通鲁尔阀，将系统与真空连通，而非与大气相通，从而开启真空。
  12. 手动按压注射器活塞施加压力，以调整并固定线虫头部位置，使其暴露于缓冲液流动通道中，但不可过度深入，以免头部自由移动图2D-2E).

6. 刺激与采集

  1. 使用开源显微成像软件（如 Micro-Manager），在蓝光激发（470 nm）下以每秒10帧的速度连续采集30秒的TIFF图像序列。
  2. 在主菜单中将曝光时间设置为100 ms。
    1. 从软件主菜单中打开“Multi-D Acq.”，将“number”设为“300”，将“interval”设为“0.”，然后点击“Acquire!”开始采集视频。
  3. 在开始采集5秒后施加持续10秒的刺激。可根据需要调整刺激施加的持续时间。
    1. 采集5秒视频后，切换控制灌流缓冲液的三通阀，以向待测动物施加刺激。点击灌流控制软件中最左侧的按钮（图1B）。
    2. 刺激暴露10秒后（此时间可根据需要由用户自行调整），再次按下灌流控制软件中最左侧的按钮，以改变缓冲液的流动方向。
  4. 在刺激结束后继续仅用缓冲液灌流，直至完成30秒的采集窗口，使GECI荧光恢复至基线水平。
  5. 根据需要重复实验。每次采集结束后，需等待30秒再开始下一次试验。

7. 图像分析

  1. 将文件拖入 ImageJ 窗口，使用开源软件 ImageJ 打开 TIFF 图像序列。
  2. 使用光标单击并拖动，在目标神经元周围设置感兴趣区域（ROI）。将区域设置为包含目标神经元的胞体（如 图3A).
  3. 通过点击“打开”来绘制 ROI 在各层堆栈中的荧光强度 z 堆栈> 图像 -> 堆叠 -> 绘制 Z 轴剖面图
  4. 点击 "列表" 在打开的窗口中，单击“编辑” -> 复制数值，然后将数值粘贴到电子表格程序中。
  5. 通过将 ROI 拖动至不表达 GCaMP 的线虫区域，分析每个脉冲的背景荧光。
  6. 通过对每个脉冲的神经元荧光强度值减去背景荧光值来进行背景扣除。
  7. 计算 ΔF/F0 每个脉冲的每一帧。
    1. 计算 F0 作为采集开始后前1秒内ROI的平均强度值（例如， 第1-10帧
    2. 计算 ΔF/F0 通过将目标帧的背景校正值除以计算得到的 F0 值
  8. 对每个成像的神经元和每个刺激脉冲重复上述步骤。
  9. 对于反应模式一致的神经元（例如 ASH），对每个神经元的所有脉冲信号取平均值，并计算标准误（SEM），方法如 图 2F).
  10. 绘制平均值 ΔF/F0 随时间变化的每个神经元的SEM。
    注意：在此情况下，通常还需包含每次试验中单个神经元反应的热图。对于在重复刺激下或不同个体中，暴露于刺激时钙瞬变未表现出一致变化的神经元23，可能更合适的做法是展示单个脉冲轨迹（如 图4）。参见 讨论 有关如何显示数据的详细信息。

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结果

整体装置设置的示例如图1A-B所示。图1A展示了正确的储液池结构与设置方式。图1B显示了储液池与微流控装置之间的连接方式。图1C展示了带有各个端口标注以增强清晰度的微流控装置。

男性适应型微流控装置的设计在加样口处包含一个弯曲结构，但其流体动力学特性与Chronis et al.19(图2A-2C)所设计的装置相同。通过调节开放的流控阀门，可控制缓冲液的流动（图2A<...

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讨论

这种适用于雄性个体的嗅觉芯片设计包含一个通向更窄加载口的弯道，可更精确地控制线虫的方向，并高效捕获雄性 C. elegans。该设计使得神经元双侧成对结构中的左侧和右侧成员均可被同时观察，无需进行Z轴层扫成像。对于仅有一对双侧神经元被荧光标记的线虫（例如 ASH 神经元），该弯道可使线虫100%偏离垂直方向（图2D-E）29,30。然而，对于具有四个呈辐射对称排列神经元的神经元类型（如 CEM 神经元），仅有三分之一的线虫能够同时观察到全部四个神经元；另三分之一的线虫仅能观察到其中三个神经元；在剩余三分之一的线虫中，仅能区分背侧与腹侧的细胞体，而无法分辨左右不对称性（数据未显示）。该更窄的入口与较低的微通道高度相结合，可防止线虫在Z轴方向上发生波动。这一设计为未来雄性线虫的研究提供了成像便利，结合日益丰富的雄性连接组知识25,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Manuel Zimmer提供了最初的设计文件，并将其改进用于雄性样本；感谢Frank Schroeder合成了ascr#3并提供该化合物；感谢Ross Lagoy在成像与分析方面的见解和协助；感谢Laura Aurilio完成了主模具的制备，并与Christopher Chute共同参与了本文稿的审阅。本研究的资助来自美国国立卫生研究院基金1R01DC016058-01（J.S.）、美国国家科学基金会基金CBET 1605679（D.R.A.）以及Burroughs Wellcome在科学交叉领域授予的职业奖（D.R.A.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
硅片University Wafer452
SU-8 2035MicroChemY111070-0500L1GL
显影液MicroChemY020100-4000L1PE
晶圆掩模Cad/Art Services-定制订单，打印分辨率为 25,000 dpi。
Sylgard-184Ellsworth Adhesives184 SIL ELAST KIT 0.5KG
1.0 mm 皮肤打孔器Acuderm Inc.P150
软管Cole-PalmerEW-06419-01
硬管IDEX Health & Science1622
针脚New England Small TubeNE-1027-12
阻断针New England Small Tube0.415/0.425" 外径 × 0.500 英寸长批次 PB07027
3 mL 注射器BD309657
30 mL 注射器Vitality Medical302832用作缓冲液储液槽。
23 号不锈钢钝头针，聚丙烯鲁尔接头Component Supply CompanyNE-231PL-50
带鲁尔接头的三通旋塞阀，公端锁紧，5 种流路模式，非无菌Cole-PalmerEW-30600-07
Fisherfinest Premium 盖玻片Fisher Scientific12-548-5M
Mercator 控制系统 LF-5 等离子体系统MercatorLF-5
Scotch 透明胶带ScotchBSN43575
Series 20 腔室Warner InstrumentsP-2
真空干燥器Bel-Art Scienceware420250000内径 24 cm。
称量舟Cole-PalmerEW-01017-27
Classic Plus 天平Mettler ToledoPB1501-S/FACT
玻璃巴斯德吸管Cole-PalmerEW-25554-06
移液管Genesee Scientific30-202
烘箱Sheldon Manufacturing Inc9120993型号：1500E。
60 mm，无通气孔，锐边培养皿TriTech ResearchT3308
Zeiss Axio Observer.A1Zeiss-
Hammamatsu Orca Flash 4.0 数字 CMOS 相机HammamatsuC11440-22CU
蓝色荧光灯LumencorSOLA SM6-LCR-SA24–30 V/7.9 A 直流电。
照明适配器Zeiss423302-0000
Series 1 和 2 微型惰性聚四氟乙烯隔离阀Parker001-0017-900用于控制流体的三通阀。
ValveLink8.2®AutoMate Scientific01-18流量开关控制器
Micro ManagerMicro-Manager-免费软件，可从以下网址下载：https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release
ImageJImageJ-免费软件，可从以下网址下载：https://imagej.nih.gov/ij/download.html
琼脂，细菌级Apex9012-36-6
蛋白胨Apex20-260
CaCl2VWRBDH0224-1KG
MgSO4Sigma-Aldrich230391-1kg
胆固醇Alfa AesarA11470
乙醇Sigma-Aldrich270741-4L
四咪唑Sigma-AldrichL9756-10(G)4 °C 保存。
荧光素Sigma-AldrichFD2000S-250mg对光敏感。应储存在避光小瓶中。
甘油Sigma-AldrichG6279-1L
Ascaroside #3--由康奈尔大学 Schroeder 实验室合成。
NaClGenesee Scientific18-215
KH2PO4BDHBDH9268.25
K2HPO4J.T. Baker3252-025
ASH GCaMP3 品系--CX10979（KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/μL]）。由 Bargmann 实验室构建，由 Albrecht 实验室文库提供。
CEM GCaMP6 品系--JSR49（FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]；pha-1(e2123ts)；him-5(e1490)；lite-1(ce314)）。由 Robyn Lints 构建，由 Srinivasan 实验室文库提供。
E. coli (OP50)Caenorhabditis 遗传中心OP50
"储液槽"--制备储液槽的方法：将一个 "30 mL 注射器" 连接到一个 "带鲁尔接头的三通旋塞阀，公端锁紧，5 种流路模式，非无菌"，该旋塞阀再连接一个 "3 mL 注射器" 和一个 "23 号不锈钢钝头针，聚丙烯鲁尔接头"。将 "23 号不锈钢钝头针，聚丙烯鲁尔接头" 插入 "软管"，插入深度约为针头长度的三分之一。

参考文献

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