应用一种适应微流控嗅觉芯片的神经活性成像对雄性线虫神经元的信息素反应

Summary

在这里描述了使用一个适应的 "嗅觉芯片" 的有效钙显像的C. 线虫男性。还显示了男性接触甘油和信息素的研究。

Abstract

使用钙指标大大提高了我们对神经动力学和调节的认识。线虫线虫线虫, 其完全映射的神经系统和透明的解剖, 提出了一个理想的模型, 了解 real-time 神经动力学使用钙指标。结合微流控技术和实验设计, 使用这些指标的钙显像研究在自由和被困动物中都进行。然而, 以前的研究大多使用诱捕器, 如 Chronis et al.中描述的嗅觉芯片, 这些装置的设计用于更常见的雌雄同体, 因为不常见的雄性在形态和结构上都不同.设计和制作了一种适应的嗅觉芯片, 以提高男性神经元成像的效率, 使用年轻的成年动物。一个转弯被并入到蠕虫的装货港旋转的动物和允许分离的单个神经元内的一对双边对2D 成像。正如以前的雌雄同体研究中所描述的, 蠕虫被暴露在微流控装置内受控的气味流中。然后使用开源软件 ImageJ 分析钙瞬变。本文所述的过程应允许增加 male-based 的C. 线虫钙显像研究, 加深我们对性特异性神经元信号机制的理解。

Introduction

微流控设备提供了更高的访问精确控制环境, 其中动物, 如线虫的C. 线虫, 可以在实验上操纵¹。这些研究包括行为分析, 钙显像研究, 甚至筛选特定的表型, 导致更精确的实验结果的测量^{1,2,3,4, 5,6}。微提供 small-scale 的液体条件, 通过它可以在使用少量试剂的同时运行详细的实验。有一个不断生产的新的微流控装置设计, 并使用每一个不同的领域, 从允许的自然正弦运动的C. 线虫的行为分析和神经成像研究, 陷阱设备用于神经成像和嗅觉研究, 对设备, 允许高通量表型分析在遗传屏幕^4,5,6,7。随着主模的制造, 微流控设备的构建成本低廉, 因为它可以重用主控器, 而且易于使用, 允许通过高通量....

Protocol

1. 设备制造

注意: 请参阅参考资料 ¹ 。

注意: 硅母模是使用标准的光刻技术制作的, 用于在硅母版上进行图案 SU-8 光刻胶的制造 ^{1 , 7} 。硅片图案的光印在 2.5万 dpi。该男性适应装置的特点是 Chronis 嗅觉芯片设计 ¹⁹ 与蠕虫加载端口的变化, 适应一个设计获得了 m. 兹 (个人通信, 2016)。一个回合包括控制动物的旋转。蜗杆加载端口通道的宽度缩小到50和 #956; m。所有通道都是32和 #956; 我很高。一旦用户使用了硅主模具, 用户就可以按照后面的协议进行操作, 如前所述 ¹ .

1. 按重量的比例将硅橡胶基体和硫化剂混合为 10:1.
2. 与传输管完全混合.
3. 将混合物放在真空干燥中1小时, 直到所有可见气泡都被移除.
4. 将混合物倒入一个 150 mm 直径的硅模母盘中, 直到5毫米厚 (100 克)。使用巴斯德吸管移除已引入混合物的任何气泡或灰尘.
5. 65 和 #176 烘烤; C 至少3....

Results

在图 1A-b中可以看到整个设备设置的一个示例。图 1A描述了适当的油藏构造和设置。图 1B显示了储层与微流体设备的连接。图 1C描述了一个微流体设备, 其各个端口标记为清晰。

设计的男性适应微流控装置包含一条曲线在装货港, 但流动力学是相同的设备设计的 Chronis et al.¹⁹(图 2A-2C)。缓冲器的流量可以通过改变哪个流量控制阀打开 (图 2A

Discussion

男性适应的嗅觉芯片结合了一个转弯到一个狭窄的装货口岸, 允许更多控制方向和为有效地诱捕男性C. 线虫。这使得对神经元双边对的左、右两个成员的可视化, 而无需 z 堆叠。这条曲线导致一个方向远离垂直100% 的时间在蠕虫, 只有一个双边对是目标与荧光标记, 如灰 (图 2D-E)^29,30。然而, 在神经元类的四径向对称神经元, 如杰姆, 所有四神经元是可见的只有1/3 的时间。另外三分之一的蠕虫被检测出只有三的四神经元可见, 而对于其余的三分之一, 唯一可区分的区别是在背部和腹侧细胞体之间, 而不是左右不对称 (数据没有显示)。较窄的端口与较低的通道高度相结合, 以防止蠕虫在 z-axis 中发生波动。这种设计允许男性在未来的研究中的成像, 其中, 当结合不断增加的男性连接的知识^25,31, 将.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
硅晶圆	大学晶圆	452
SU-8 2035	MicroChem	Y111070-0500L1GL
开发商	MicroChem	Y020100-4000L1PE
晶圆掩模	CAD/Art 服务	-	定制订单。以 25,000 dpi 打印。
Sylgard-184	Ellsworth 胶粘剂	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
1.0 mm 皮肤打头	Acuderm Inc.	P150
软管	Cole-Palmer	EW-06419-01
硬管	IDEX Health &科学	1622
针	新英格兰小管	NE-1027-12
阻塞针	新英格兰小管	0.415/0.425" 外径 x .500 长	批次 PB07027
3 毫升注射器	BD	309657
30 毫升注射器	活力医疗	302832	用作缓冲储液器。
不锈钢钝针 23 号，聚丙烯 鲁尔	组件供应公司	NE-231PL-50
带鲁尔连接的旋塞阀; 3 通; 公锁; 5 流模式;非无菌	Cole-Palmer	EW-30600-07
费舍尔最高级盖玻片	费舍尔科学	12-548-5M
墨卡托控制系统 LF-5 等离子系统	墨卡托	LF-5
Scotch Tape	Scotch	BSN43575
系列 20 室	Warner Instruments	P-2
真空干燥器	Bel-Art Scienceware	420250000	24 厘米内径。
称重船	Cole-Palmer	EW-01017-27
Classic Plus Balance	Mettler Toledo	PB1501-S/FACT
玻璃巴斯德移液器	Cole-Palmer	EW-25554-06
移液管	Genesee Scientific	30-202
烤箱	Sheldon Manufacturing Inc	9120993	型号：1500E。
60 毫米，非通风，锋利的边缘培养皿	TriTech Research	T3308
蔡司 Axio Observer.A1	蔡司	-
滨松 Orca Flash 4.0 数字 CMOS	Hammamatsu	C11440-22CU
蓝色荧光灯	Lumencor	SOLA SM6-LCR-SA	24-30V/7.9A DC。
照明适配器	Zeiss	423302-0000
系列 1 和 2 微型惰性 PTFE 隔离阀	Parker	001-0017-900	用于控制流量的三通阀。
阀联8.2®	AutoMate Scientific	01-18	流量开关控制器
Micro Manager	Micro-Manager-Free		软件，可从以下网址下载：https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release
ImageJ	ImageJ-Free		软件，可从以下网址下载：https://imagej.nih.gov/ij/download.html
琼脂，细菌级	Apex	9012-36-6
蛋白胨	Apex	20-260
CaCl2	>VWR	BDH0224-1KG
MgSO4	Sigma-Aldrich	230391-1kg
胆固醇	Alfa Aesar	A11470
乙醇	Sigma-Aldrich	270741-4L
四咪唑	Sigma-Aldrich	L9756-10（G）	储存温度为 4°C。
荧光素	Sigma-Aldrich	FD2000S-250mg	光敏。储存在光保护瓶中。
甘油	Sigma-Aldrich	G6279-1L
蛔虫苷 #3	-	-	在 Schroeder 实验室（康奈尔大学）合成。
NaCl	Genesee Scientific	18-215
KH2PO4	BDH	BDH9268.25
K2HPO4	J.T. Baker	3252-025
ASH GCaMP3 线	-	-	CX10979 （KyEx2865 [psra-6：：GCAMP3 @ 100 ng/uL]）。在 Bargmann 实验室开发。由 Albrecht Lab 库提供。
CEM GCaMP6 线	-	-	JSR49 （FkEx98[ppkd-2：：GCaMP：：SL2：:d sRED + pBX-1];pha-1（e2123ts）;him-5（e1490）;lite-1（ce314））。由 Robyn Lints 开发。由 Srinivasan Lab 图书馆提供。
大肠杆菌 （OP50）	球菌炎遗传学中心	OP50
"储液器"	-	-	创建一个储液器："30 mL 注射器"连接到"带鲁尔接头的旋塞阀;3 通;公锁;5 流型;非无菌"，该旋塞阀连接到"3 mL 注射器"和"不锈钢钝针 23 号"， Polyprolylene Luer".然后将"不锈钢钝针 23 号，聚脯氨苯鲁尔接头"插入"软管"中，大约插入针头下方约 1/3 的位置。