从新生及成年小鼠皮肤中分离和培养原代小鼠角质形成细胞

摘要

表皮角质形成细胞构成功能性皮肤屏障，在抵御外界环境侵害的宿主防御中处于前沿位置。本文介绍了从小鼠新生及成年皮肤中分离表皮角质形成细胞并进行原代培养的方法，以及诱导角质形成细胞终末分化和紫外线B诱导的炎症反应的实验方案。

摘要

角质形成细胞（KC）是皮肤最外层表皮中的主要细胞类型。表皮KC在皮肤防御中发挥关键作用，不仅通过形成完整的皮肤屏障以抵御环境损伤（如UVB辐射或病原体侵袭），还能在受到这些刺激时启动炎症反应。本文描述了从新生小鼠皮肤和成年小鼠尾部皮肤中分离KC的方法，并比较了使用特定生长添加剂（dGS）与螯合处理的胎牛血清（cFBS）进行培养的条件。功能上，我们证明新生小鼠和成年小鼠来源的KC均对高钙诱导的终末分化、紧密连接形成及多层化具有高度响应性。此外，体外培养的成年KC易受UVB诱导的细胞死亡影响，并可在UVB照射后释放大量TNF。综上所述，本文所述方法将为研究人员建立 体外 用于研究新生小鼠和/或成年小鼠表皮生物学的模型

引言

皮肤是人体最大的器官，表皮为其最外层。表皮在形成完整的表皮屏障方面发挥着关键作用，将机体与外界环境分隔开来，从而防止水分流失，并提供针对环境侵害（如过敏原、病原体和紫外线B照射）的保护。表皮由单层未分化的基底角质形成细胞（KCs）发育为多层的复层上皮，依次包括基底层、棘层、颗粒层和角质层。基底角质形成细胞包含表皮干细胞和过渡扩增细胞，具有增殖能力且未分化。当基底角质形成细胞退出细胞周期后，便启动分化程序，并逐渐向表皮表面迁移，同时伴随细胞间连接的成熟以及表皮通透屏障（EPB）的形成。位于棘层的角质形成细胞表达早期分化标志物，如角蛋白10（K10）；当角质形成细胞迁移至颗粒层时，则表达晚期分化标志物，如丝聚蛋白（FLG）、兜甲蛋白（LOR）和外被蛋白（INV）。在角质层，角质形成细胞最终分化为终末分化的角质细胞，随后通过脱屑过程脱落，由新生细胞取代。

钙被认为是表皮中最符合生理条件的因子，可触发细胞分化 体外 和 体内 以类似方式。在正常皮肤表皮中，钙离子形成一种特征性分布 "浓度梯度"向皮肤表面浓度逐渐增加^1,2,3钙离子浓度从最深层的基底层和棘层的低水平逐渐升高，在颗粒层上部达到峰值，随后在最表层的角质层中降至可忽略水平。钙梯度的形成与皮....

方案

所有动物实验均经加州大学圣地亚哥分校机构动物护理和使用委员会批准。

1. 新生小鼠皮肤原代角质形成细胞的分离与培养

1. 使用剪刀对 C57B/6 野生型小鼠品系的出生后第 0-2 天的新生小鼠进行断头处死。在腕关节和踝关节上方剪去四肢，然后完全剪去尾巴，留下一个小孔。
2. 为了剥离整张皮肤，首先将尖头剪刀从尾部的小孔插入，沿身体背侧中线剪开皮肤直至颈部开口处。接着，用一把镊子夹住暴露的躯体，另一把镊子夹住皮肤，以连续动作轻柔地将整张皮肤从躯体上剥离，并翻过腿部残端。
   1. 应将皮肤完整剥离为一整块，注意避免将其撕裂成碎片，否则会在dispase消化步骤中导致细胞丢失。
3. 用 10 cm 培养皿中的 15 mL 无菌 PBS 冲洗剥离的皮肤，然后将每只幼鼠的皮肤放入装有冰冻 dispase 消化缓冲液的 2 mL 离心管中，该缓冲液含有 4 mg/mL dispase 的 KC 生长培养基（KC 基础培养基含 0.06 mM CaCl₂、dGS 以及抗生素/抗真菌剂）。
   注意：多个皮肤样本可合并后置于一个 15 mL 离心管中（每管最多 5 张皮肤），加入 12 mL dispase 溶液。将装有皮肤的离心管置于 4 °C 冰箱中，在旋转仪上过夜孵育。
   1. ....

结果

高钙诱导新生期和成年KC的终末分化。 在0.06 mM CaCl₂条件下培养的原代小鼠表皮KC呈单层生长，单个细胞呈多边形，细胞间隙清晰，汇合时呈现铺路石样外观（图1A 和 图2A）。将CaCl₂浓度升高至0.2 mM可迅速诱导细胞形态改变。高钙处理8小时内，细胞变得扁平，明显的细胞间隙逐渐减少；24小时后，细胞间紧密连接的黏附结构已清晰可见（图1A 和 图2B）。高钙处理后约48–72小时开始形成角化包膜及垂直方向的细胞分层（图2B）。为分析高钙诱导过程中肌动蛋白的重塑及细胞间紧密连接的形成，使用0.2 mM CaCl₂处理KC后，用鬼笔环肽染色（

讨论

皮肤表皮作为关键屏障，能够将机体与外界环境隔离开来，保护身体免受水分流失、病原体、热量以及紫外线辐射的损害。角质形成细胞（KCs）是表皮的主要细胞谱系，表皮KC的原代培养是研究和理解屏障形成生物学过程以及KC对环境损伤反应的有用工具in vitro。

本文介绍了从新生期和成年小鼠皮肤中分离和培养原代表皮角质形成细胞（KC）的方法。虽然原代小鼠KC可方便地从新生小鼠皮肤中分离获得，但由于成年小鼠背部皮肤表皮变薄且毛囊密度高，其KC的分离与成功培养通常被认为较为困难。本文所述方法采用成年小鼠尾部皮肤作为获取基底层KC的便捷且丰富的来源。由于尾部皮肤具有较厚的表皮和较低的毛囊密度，经过过夜dispase消化后，将表皮与真皮分离以获取KC的关键步骤变得可行。相比之下，我们尝试使用该方案从成年背部皮肤分离KC并未成功，导致分离后细胞得率低，接种后细胞贴壁率也较低。然而，已有文献报道，在对无毛皮肤进行过夜胰蛋白酶（trypsin）消化后，可成功从成年背部皮肤分离并培养KC¹⁵，这表明仅用dispase可能不足以从成年背部皮肤真皮.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
出生后C57BL/6幼鼠或成年野生型小鼠	Jackson Laboratory	000664	野生型小鼠（最初购自Jackson Laboratory）在加州大学圣地亚哥分校（UCSD）的动物实验室内进行繁育和饲养。
KC基础培养基（EpiLife）	Invitrogen, Carlsbad, CA	MEPICF500	用于角质形成细胞培养的基础培养基，含0.06 mM CaCl2
定义型生长添加剂（dGS）	Invitrogen, Carlsbad, CA	S0125	用于培养基的定义型生长添加剂
Dispase粉末	Invitrogen, Carlsbad, CA	17105041	用于分离表皮与真皮的酶
贴壁因子	Invitrogen, Carlsbad, CA	S006100	基于明胶的包被材料
包被基质	Invitrogen, Carlsbad, CA	R011K	基于胶原蛋白的包被材料
TrypLE	Invitrogen, Carlsbad, CA	12604-013	一种温和的类胰蛋白酶，用于将角质形成细胞从表皮片中解离
100 μm 细胞筛网（尼龙材质）	Corning	352360
CCK-8细胞活力检测试剂盒	Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD	CK04-11
小鼠TNF（单克隆/单克隆）ELISA试剂盒II	BD Biosciences, San Jose, CA	555268
有线手持式紫外灯	Spectronics, Westbury, NY	EB-280C
8瓦紫外灯管	Spectronics, Westbury, NY	BLE-8T312
用于细胞培养的倒置光学显微镜	ZEISS, Jena, Germany	Axio Observer
荧光显微镜	Olympus	BX41