激光多普勒：一种用于体内测量胰岛微血管血管运动的工具 In Vivo

摘要

胰腺胰岛微血管舒缩运动调控胰岛血流分布，并维持胰岛β细胞的生理功能。本方案描述了使用激光多普勒监测仪评估胰腺胰岛微血管舒缩运动功能状态的方法。 在体内 并评估胰岛微循环对胰腺相关疾病的影响。

摘要

微血管舒缩运动作为微循环的功能状态，对氧气和营养物质的输送以及二氧化碳和代谢废物的清除具有重要意义。微血管舒缩功能的损害可能是微循环相关疾病发生发展的关键环节。此外，胰岛具有高度血管化的结构特征，以适应其内分泌功能。因此，胰岛微血管舒缩运动的功能状态可能影响胰岛功能。分析胰岛微血管舒缩运动功能状态的病理变化，可能是明确胰岛微循环在糖尿病、胰腺炎等相关疾病中作用的可行策略。 等等因此，本实验方案描述了使用激光多普勒血流监测仪来测定胰岛微血管舒缩运动的功能状态，并建立用于评估微循环功能状态的参数（包括胰岛微血管舒缩运动的平均血流灌注量、振幅、频率及相对速度）。在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型中，我们观察到胰岛微血管舒缩运动的功能状态受损。综上所述，该方法可用于评估胰岛微血管舒缩运动 体内 可能揭示与胰岛疾病相关的机制。

引言

微血管血管运动作为微循环功能状态的一个参数，负责氧气、营养物质和激素的输送与交换，并对二氧化碳和细胞代谢废物等代谢产物的清除至关重要¹。微血管血管运动还调节血流分布和组织灌注，从而影响局部微循环血压以及对炎症的反应，而炎症反应在多种疾病中可诱发水肿。因此，微血管血管运动对于维持器官^2,3,4、组织及其组成细胞的生理功能具有极其重要的意义。微血管血管运动功能的损害可能是微循环相关疾病发生发展的关键环节之一⁵。

激光多普勒最初是为微循环研究领域的观测与定量分析而开发的⁶。该技术与其他技术方法相结合（例如， 激光散斑⁷经皮氧 等等.) 一直被视为评估微循环血流的金标准。其原理在于局部微循环的血流灌注（即， 毛细血管，微动脉，微静脉 等等。可通过配备激光多普勒的仪器，基于多普勒频移原理测定。当入射光子与微血管中流动的血细胞相遇时，受激辐射光的波长和频率会发生改变；若未遇到流动细胞，则保持不变。因此，在微循环中，血细胞的数量和流速是决定多普勒频移光强度和频率分布的关键因素，而微血管血流方向则无关紧要。采用不同方法，多种组织已被用于微循环研究，包括小鼠、大鼠、仓鼠甚至人类的肠系膜和背部皮肤折叠腔室⁸然而，在本实验方案中，我们重点关注胰岛微血管舒缩功能状态，该功能通过激光多普勒技术结合自制的评估参数系统进行评价。

胰岛微循环主要由胰岛微血管构成，具有独特的特征。胰岛毛细血管网络的密度是其外分泌部分毛细血管网络的五倍以上⁹。胰岛内皮细胞为β细胞输送代谢活跃所需的氧气，同时作为葡萄糖输入的通道并扩散胰岛素。此外，越来越多的证据表明，胰岛微血管不仅参与调控胰岛素基因表达和β细胞存活，还影响β细胞功能，促进β细胞增殖，并产生多种血管活性物质、促血管生成物质及生长因子¹⁰。因此，从这一角度来看，我们推断胰岛微血管舒缩功能的状态可能影响胰岛β细胞功能，并参与急性/慢性胰腺炎、糖尿病及其他胰腺相关疾病的发病机制。

分析胰岛微血管舒缩功能状态的病理变化可能是确定胰岛微循环在上述疾病中作用的可行策略。以下为测定胰岛微血管舒缩功能的详细分步操作流程 体内 然后展示典型测量结果。 代表性结果最后，本文重点阐述了该方法的优势与局限性 讨论以及进一步的应用。

方案

所有动物实验均遵照所有相关指南、法规及监管机构的要求执行。本演示的实验方案是在北京协和医学院微循环研究所动物伦理委员会（IMAEC）的指导和批准下进行的。

1. 动物

1. 实验开始前，将三只BALB/c小鼠置于同一笼中饲养，环境温度控制在（24 ± 1）°C，湿度控制在（55 ± 5）%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。小鼠可自由摄取常规食物和饮水。
2. 将小鼠随机分为非糖尿病对照组和糖尿病组。准确称量每只小鼠的体重，并根据每只小鼠的体质量计算注射体积。
3. 实验第1天，注射链脲佐菌素（STZ）前使小鼠禁食4小时，并正常提供饮用水。
4. 配制 pH 4.3 的 0.1 M 柠檬酸钠缓冲液。取 1 mL 该溶液加入 1.5 mL 微离心管中，并用铝箔包裹微离心管以避光。
5. 将STZ溶解于柠檬酸钠缓冲液（pH 4.3）中，配制成终浓度为5 mg/mL的工作液，现用现配。
6. 给糖尿病组小鼠腹腔注射STZ，剂量为40 mg/kg，使用1 mL注射器和25 G针头。非糖尿病对照组小鼠注射等体积的柠檬酸钠缓冲液（pH 4.3）。
7. 将小鼠放回笼中，并提供常规食物和10%蔗糖水。
8. 在实验第2至第5天重复执行步骤1.3–1.7（即， 接下来连续4天。
9. 最后一次STZ注射后，将10%蔗糖水替换为普通水。
10. 禁食小鼠6小时，但可自由饮水，在实验第14天（即9天后）测定其血糖水平。从尾静脉采集血样，使用血糖监测系统确认高血糖状态。
    注意：血糖水平的小鼠 > 200 mg/dL 被视为糖尿病。

2. 仪器准备

1. 使用柔软、无研磨性的布清洁激光多普勒仪器探头尖端和探头连接器的光学表面，以去除任何灰尘或颗粒。将电缆插入仪器的端口中（图1A）。
2. 组装校准支架，使通量标准品与实验环境（室温，通常为30分钟）达到热平衡。轻轻摇动通量标准品10秒，然后静置2分钟。
3. 将通量标准品容器置于校准底座中央。调整夹具至最大高度，并将探头固定在夹具中，使其朝向容器垂直向下。确保通量标准品正确地位于探头正下方。
4. 缓慢下移探头，直至其尖端完全浸入通量标准品中。在激光多普勒仪器上选择并按下"校准"，然后选择探头所连接的工作通道。运行校准程序，直至激光多普勒仪器屏幕上显示"校准成功"提示。
5. 使用探头固定装置固定探头。手动固定探头以避免移动。
6. 保持实验室内温度恒定（24 ± 1 °C）和湿度稳定（约50–60%）。
7. 在进行实验前关闭所有外部光源（如荧光灯和聚光灯），以避免外部光照引起的变化。

3. 动物的准备

1. 将手术器械进行高压灭菌，并在使用前冷却至室温。
2. 在使用激光多普勒检测胰岛微血管舒缩运动前，让小鼠适应实验环境10分钟。
3. 用1 mL注射器抽取1 mL 3%戊巴比妥钠溶液，按75 mg/kg剂量腹腔注射，以麻醉小鼠。
4. 用预先润湿的医用纱布覆盖小鼠眼睛，防止角膜干燥。
5. 确认小鼠完全失去意识，且对镊子夹捏尾巴或后肢足部无反应。 在整个麻醉及术中过程，每15分钟监测一次麻醉状态；必要时补充初始注射量10%的戊巴比妥钠溶液以维持麻醉深度。
6. 在动物体下方放置带有半绝缘层的加热垫，将小鼠置于仰卧位，并转移至激光多普勒仪器的工作台，用手术胶带将小鼠固定在工作平台上。
7. 用聚维酮碘擦拭小鼠腹部皮肤，再用75%乙醇擦拭腹部区域，进行清洁消毒。
8. 皮下注射2%利多卡因/0.5%布比卡因（50/50）混合液。  在纱布海绵中心剪一个直径约3 cm的孔洞，将纱布海绵覆盖于腹部区域。
9. 用镊子提起腹部皮肤，使用手术刀或剪刀沿腹中线做初始垂直切口。
10. 用镊子夹住下方肌肉层并切开，进入腹腔，注意避免损伤任何器官。将皮肤和肌肉层向胸部方向翻折，暴露腹腔。使用钝头镊子轻柔分离，暴露胰体和脾脏。

4. 分析用数据采集

1. 单击激光多普勒仪器的软件运行程序 "文件" → "新" 创建一个新的测量文件。要配置已连接的显示器，请在下方 "通用" 标签，设置监测持续时间为 "自由运行。" 使用出厂默认设置 "LDF 监测仪" 点击标签页。 "下一步。"
2. 设置图形显示方式 "显示设置对话框。" 选择 "流速，浓度，速度" 通过勾选相应的复选框来选择通道。选择以下参数： "通道的数据源" 和 "标签、单位和颜色。" 点击 "下一步。"
3. 输入有关受试者和测量的信息（即， 姓名和受试者编号、操作者、监测时间、备注 等等。）在 "文件信息对话框" 并点击 "下一步" 完成测量配置。
   注意：软件会自动创建一个测量窗口（图1B).
4. 手动将电极推进至胰腺。确保探针与胰腺组织之间的距离在1 mm以内。距离不当会导致血流量读数出现人为的升高或降低。
5. 点击 "开始" 单击工具栏图标以开始记录微血管血流灌注单位（PU）数据。每次运行连续采集1分钟的PU数据。单击 "停止" 停止测量。选择 "文件" → "保存为" 命名并保存完成的测量文件。
6. 每次运行后手动重新定位探针，以避免累积效应以及局部收缩和舒张能力的耗竭。重复步骤 4.1–4.4，以获取多点（即， 每只小鼠采集胰腺组织中三个随机选择位点的微血管PU数据。以非反射性平板的PU数据作为基线对照进行测量。
7. 用缝线缝合腹肌层和皮肤层。实验结束后将动物放入清洁的笼子中。
8. 将恢复笼的一半置于加热垫上，以保持动物体温。
   注意保持小鼠的体温、卫生、液体和食物摄入，并预防感染。术后给予小鼠2 mg/kg卡洛芬，持续48小时，用于疼痛管理。当观察到小鼠处于严重疼痛或痛苦状态且无法缓解时，通过腹腔注射150 mg/kg戊巴比妥钠实施安乐死。

5. 微血管血管运动参数的计算

1. 使用激光多普勒软件的 "导出" 命令将时间和PU原始数据导出为 *.xlsx 文件，并在电子表格中打开该文件。
2. 计算平均基线灌注单位（PU_b）（见步骤 4.6）。
3. 按以下方式计算每次测量 1 分钟内的平均血流灌注（PU_a）：平均血流灌注（PU_a）= PU - PU_b（公式 1）。
4. 计算每次 1 分钟测量的频率（周期/分钟）。
   注：微血管舒缩运动的频率定义为每分钟微血管舒缩波中出现的峰数。
5. 计算每次 1 分钟测量的振幅（ΔPU）。
   1. 将微血管舒缩运动的振幅计算为最大值（PU_max）与最小值（PU_min）之间的差值：振幅（ΔPU）= PU_max - PU_min（公式 2）。
6. 计算每次 1 分钟测量的相对流速（PU）。

结果

配备半导体激光二极管的微血管舒缩运动测量激光多普勒仪器照片如图所示 图1A用户界面软件展示于 图1B采用上述方法，检测了非糖尿病对照组和糖尿病小鼠胰岛微血管血管运动的血流动力学参数。自微血管血管运动首次被定义以来，已有多种技术被用于其研究，包括激光多普勒血流测定法、反射光与散射光技术、红外光谱法以及成像技术。 表1 总结了使用激光多普勒技术研究微循环在糖尿病及相关疾病中作用的研究团队及已发表的文章。

通常，胰岛微循环状况通过胰岛微血管血流运动的功能状态来反映，所用的微血管参数包括平均血流灌注量、振幅、频率、相对流速图2）。典型的微血管舒缩运动示意图主要由周期性的收缩和舒张相组成（图2A

讨论

在涉及微血管功能障碍的情况下（例如， 糖尿病，急性胰腺炎，外周微血管疾病 等等），某些疾病会导致血流减少。除血流变化外，微血管舒缩运动等重要指标也能反映微循环的功能状态。微血管舒缩运动这一特定指标，通常定义为微血管床中微血管张力的振荡。在本实验方案中，微血管血流灌注监测系统可实现对微血管舒缩运动功能状态的直接可视化和定量分析。通过识别血流灌注的动态变化，我们的微循环评估方法可选择性地应用于特定组织和器官。其他研究团队关于利用激光多普勒技术确定微血管血流灌注在糖尿病及其并发症中作用的研究报道已总结于 表1在本研究中，为展示我们的方法，评估了糖尿病小鼠胰岛微血管舒缩功能的状态。

微血管舒缩运动被认为是微循环功能状态的一个参数，能够通过调节局部组织内的血流分布来调控灌注血流²³。胰腺的微血管系统可分为胰岛、腺泡和导管三部分，已有数十年的研究历史。这种将胰腺划分为不同部分的做法基本上只是为了方便起见，因为实际上微血管系统是相互连接、作为一个有机整体而均一存在的

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MoorVMS-LDF2	摩尔仪器公司	GI80	PeriFlux 5000（Perimed 公司）可作为替代设备用于采集数据
MoorVMS-PC 软件	摩尔仪器公司	GI80-1	MoorVMS-LDF2 的配套软件
校准支架	摩尔仪器公司	GI-cal	校准工具
校准底座	摩尔仪器公司	GI-cal	校准工具
校准流量标准件	摩尔仪器公司	GI-cal	校准工具
One Touch UltraEasy 血糖仪	强生公司	#1955685	用于确认高血糖状态
One Touch UltraEasy 血糖试纸	强生公司	#1297006	用于确认高血糖状态
链脲佐菌素	Sigma-Aldrich	S0130	溶于柠檬酸钠缓冲液（pH 4.3）
戊巴比妥钠	Sigma-Aldrich	P3761	工作浓度为 3%
乙醇	国药集团化学试剂有限公司	200121	工作浓度为 75%
蔗糖	Amresco	335	工作浓度为 10%
医用纱布	中国医药材料有限公司	S-7112	外科用
钝头镊子	上海手术器械有限公司	N-551	外科用
外科胶带	3M 公司	3664CU	外科用
纱布海绵	福康森医疗器械有限公司	BB5447	外科用
手术刀	玉林手术器械有限公司	175C	外科用
皮肤剪	Carent	255-17	外科用
缝合线	宁波手术器械有限公司	3325-77	外科用
注射器及 25G 针头	MISAWA 公司	3731-2011	规格：1 ml