需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

野生型与CMAH基因敲除小鼠肝脏及乳汁样品中唾液酸的测定

9K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/56030

⸱

2017年7月14日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Glycomics and Glycan Bioengineering Research Center (GGBRC), College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University

本文内容

摘要

我们描述了一种基于高效液相色谱法（HPLC）的方法，用于测定小鼠肝脏和乳汁中的N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸。

摘要

CMAH（胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶）负责哺乳动物体内胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸的氧化反应。然而，由于人类CMAH基因发生了一个主要的外显子缺失，无法将胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸氧化为胞苷单磷酸-N-羟乙酰神经氨酸。为了更深入地理解CMAH活性缺失所带来的影响及其意义，在基础与应用研究中，构建小鼠的Cmah基因敲除模型具有重要意义。本文详细描述了用于确定该小鼠模型表型的分析方法，该方法基于检测野生型和Cmah基因敲除小鼠肝脏及乳汁中N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸的存在情况。内源性唾液酸被释放后，与邻苯二胺（o-phenylenediamine）进行衍生化反应，生成具有荧光特性的衍生物，随后可通过高效液相色谱（HPLC）进行分析。本方案也可应用于来自其他多种来源的乳汁和组织样本的分析，有助于研究N-羟乙酰神经氨酸对营养与健康的影响。

引言

N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）和N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）是大多数哺乳动物中最常见的唾液酸1。尽管人类能够内源性合成Neu5Ac，但由于编码CMP-Neu5Ac羟化酶的CMAH基因发生外显子缺失，无法产生Neu5Gc2,3。然而，动物源性食品可作为Neu5Gc的膳食来源4,5,6，导致机体产生抗Neu5Gc抗体，从而引发针对Neu5Gc的免疫反应7。这种Neu5Gc的膳食效应被认为可能促进慢性炎症及其他多种疾病的发生8,9,10。为了全面理解Neu5Gc对人类的影响，建立一种用于系统研究食源性唾液酸效应的动物模型具有重要意义。虽然基于聚合酶链式反应（PCR）的基因敲除小鼠分析方案已较为成熟，并可便捷地进行基因型鉴定，但对表型在代谢水平上的功能分析则需要更特异的分析方法。Cmah基因敲除小鼠模型的表型可通过分离并分析肝脏或乳汁样本中唾液酸的组成来进行评估。已有多种方法被用于检测动物组织中的唾液酸：例如唾液酸与间苯二酚11或硫代巴比妥酸12反应生成显色产物，可通过酶标仪进行简单检测，但仅能测定总唾液酸含量。此外，也有研究采用气相色谱法13、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-ToF MS）14或安培检测法15进行唾液酸分析。然而，目前最常用的唾液酸分析方法是基于水解释放后，经荧光衍生化，再进行高效液相色谱分析16,17,18。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

涉及动物实验的操作已获得南京农业大学实验动物中心伦理委员会批准，符合《国家实验动物福利伦理指南》（中华人民共和国科学技术部，2006年）的要求，动物饲养于SPF级设施中（许可证号：SYXK-J-2011-0037）。

1. Cmah 基因敲除小鼠模型

  1. 使用扬州大学比较医学中心（中国）提供的野生型 C57Bl/6 小鼠。
    注意：Cmah 基因敲除小鼠是根据以往 Cmah 基因敲除研究提供的信息构建的17,19，并通过 CRISPR/Cas920 技术策略商业化获得，该策略通过删除 Cmah 基因第6号外显子中的92个碱基对实现，而该区域在人类 CMAH 基因中同样缺失19。将阳性 F0 代小鼠（2只）与野生型小鼠杂交，获得杂合子 F1 代小鼠。再将杂合子 F1 代小鼠（5只）相互交配，成功获得纯合子 Cmah 基因敲除 F2 代小鼠（3只）。
  2. 采用商业化的DNA纯化试剂盒，按照Zangala21 所示方法，利用基因组DNA对小鼠进行基因型鉴定。
    1. 使用商业DNA聚合酶及引物对 5'gaaagggctcggctctgtatgaa3' 和 5'tttaaaatgtcccgggtgagaagc3' 扩增 Cmah 基因相应的DNA片段。PCR扩增共进行34个循环，每个循环包括：94 °C 变性40秒，63 °C 退火40秒，72 °C 延伸1分钟。
    2. 在1%琼脂糖凝胶上检测PCR产物。野生型个体应显示一条单带（0.5 kb），杂合子敲除个体显示两条带（0.4 kb 和 0.5 kb），纯合子敲除个体则显示一条单带（0.4 kb）。

2. 样品采集

  1. 使用Willingham描述的方案收集小鼠乳汁 等22.
  2. 使用Gonçalves所述方案收集小鼠肝组织 等23 并将样品储存在 -80 °C。

3. 从乳汁中分离唾液酸

  1. 通过将 12 mL 冰醋酸加入 88 mL 蒸馏 H2O 中，配制 100 mL 的 2 M 醋酸溶液。
  2. 将 50 µL 牛奶转移至 1.5 mL 离心管中，并加入 1.2 mL 上述制备的水相醋酸溶液。
  3. 将悬浮液在 80 °C 下孵育 4 小时，并在 14,000 × g 下离心 10 分钟。
  4. 将上清液顶部 1,000 µL 转移至新的 1.5 mL 离心管中，在室温下通过离心蒸发完全除去溶剂（根据所连接的真空泵，此过程需 4–20 小时）。将样品重新溶解于 500 µL 蒸馏 H2O 中。
  5. 制备微型阴离子交换柱。此步骤可特异性富集阴离子化合物，并去除牛奶和肝脏样品中的阳离子和中性化合物，从而提高荧光性 OPD 标记试剂对唾液酸衍生化的选择性。
    1. 为每个样品，将 200 mg 阴离子交换树脂（Dowex 1X8）转移至带有活塞的空 3 mL 柱管中。
    2. 加入 2 mL 第 3.1 步中制备的水相醋酸溶液，以将树脂中的氯离子置换为醋酸根离子。当溶剂到达树脂顶部时，立即关闭活塞。
    3. 轻柔加入 2 mL 蒸馏 H2O，打开活塞，当大部分溶剂到达树脂顶部时即停止流动。确保树脂始终被溶剂覆盖。
    4. 再用 2 mL 蒸馏 H2O 洗涤树脂柱两次，以去除过量醋酸根。
  6. 将第 3.4 步所得 500 µL 样品溶液转移至树脂柱上，弃去穿流液。用 2 mL 蒸馏 H2O 轻柔洗涤树脂。使用 1 mL 50 mM 醋酸铵溶液（将 386 mg 醋酸铵溶解于 100 mL 蒸馏 H2O 中）将样品阴离子从树脂中洗脱至 1.5 mL 离心管中。在室温下通过离心蒸发除去溶剂至完全干燥。
    注意：干燥样品可在 4–6 °C 下保存最多 12 个月。

4. 从肝组织中分离唾液酸

  1. 轻轻解冻20 - 50 mg小鼠肝脏，转移至Dounce组织研磨器（1 mL或2 mL体积）中。加入步骤3.1中配制的1.2 mL水性乙酸溶液，通过轻柔剪切作用匀浆组织10秒。将所得悬液转移至1.5 mL离心管中。
  2. 执行步骤3.3至3.6。
    注意：干燥样品可在4-6 °C下保存长达12个月。

5. 混合唾液酸标准品的制备

  1. 使用分析天平称取5 - 8 mg的N-乙酰神经氨酸，放入1.5 mL离心管中。记录精确质量，并按每毫克加入164 µL蒸馏H2O的比例加水（例如，若Neu5Ac的质量为7.2 mg，则加入7.2 × 164 = 1,181 µL蒸馏H2O）。由此得到20 mM的Neu5Ac储备液，可在-20 °C下保存长达12个月。
  2. 以较低价格获取小剂量的N-羟乙酰神经氨酸，例如每份1 mg。直接向该化合物中加入154 µL蒸馏H2O，以获得约20 mM的Neu5Gc储备液。将溶液转移至1.5 mL离心管中。该溶液可在-20 °C下保存长达12个月。
  3. 从步骤5.1和5.2中的每种储备液中各取5 µL，加入一个新的1.5 mL离心管中，并在室温下通过离心蒸发去除溶剂至干燥。
    注意：混合唾液酸标准品可在4 - 6 °C下保存长达12个月。

6. 唾液酸的荧光衍生化

  1. 配制10 mL OPD溶液，其中包含100 mg邻苯二胺和208 mg亚硫酸氢钠，溶于10 mL蒸馏H₂O中2O.
  2. 向来自小鼠乳汁（步骤3）、小鼠肝脏（步骤4）或混合唾液酸标准品（步骤5）的唾液酸样品中加入20 µL OPD溶液。剧烈涡旋振荡30秒，然后将样品在黑暗条件下于80 °C孵育4小时即 用铝箔包裹微量离心管。
  3. 让样品冷却5分钟，加入80 µL蒸馏水H2O，并在14,000 × g离心1分钟。
  4. 将80 µL上清液转移至300 µL高回收HPLC小瓶中。衍生化的唾液酸样品可在4 - 6 °C保存最多一周。

7. 唾液酸衍生物的高效液相色谱分析

  1. 使用连接在线荧光检测器的标准高效液相色谱（HPLC）系统分析样品。
  2. 采用标准尺寸为250 mm长、4.6 mm内径的反相C18色谱柱进行分析。
  3. 通过将200 mL储备液与800 mL液相色谱-质谱联用级（LCMS级）水混合制备流动相A。储备液的配制方法如下：
    1. 将46 g甲酸加入800 mL LCMS级H2O中。
    2. 逐滴加入氢氧化铵溶液（puriss. p.a.），调节pH至4.5。
    3. 将溶剂转移至量筒中，并用LCMS级H2O定容至1,000 mL。该储备液可在4 - 6 °C下保存最多3个月。
  4. 流动相B使用LCMS级乙腈。
  5. 以1 mL/min的流速，采用以下梯度洗脱程序分离唾液酸衍生物：
    1. 起始时，将10%的流动相B与流动相A混合。
    2. 从0 min到15 min，通过线性梯度将流动相B的比例逐步增加至60%。
    3. 从15 min到16 min，通过线性梯度迅速将流动相B的比例从60%升至90%，以启动HPLC柱的清洗过程。
    4. 为进一步清洗HPLC柱，在16 min至18 min期间保持流动相B比例为90%，随后在18 min至19 min之间逐步将流动相B比例降低回10%。
    5. 在19 min至24 min期间，将HPLC柱重新平衡至起始条件（10% B）。
  6. 向HPLC系统中进样50 µL。
  7. 使用荧光检测器在激发/发射波长373/448 nm条件下监测洗脱液，衍生化的唾液酸预计在约9 min（Neu5Gc-OPD）和10 min（Neu5Ac-OPD）处出峰。
  8. 根据Neu5Ac（ANeu5Ac）和Neu5Gc（ANeu5Gc）的荧光峰面积计算Neu5Gc的相对含量（FNeu5Gc）：FNeu5Gc [%] = 100×ANeu5Gc/(ANeu5Ac+ANeu5Gc)。对于纯合Cmah基因敲除小鼠的乳汁和肝脏样品，FNeu5Gc应为0%；而杂合子和野生型小鼠的FNeu5Gc值则因小鼠年龄和组织类型不同而有较大差异（介于2%至>90%之间），预期误差范围为±12%。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

所描述分析方法的示意图如图1所示，包括从野生型和Cmah基因敲除突变小鼠的乳汁及肝脏样本中分离唾液酸，并对这些成分进行荧光衍生化及高效液相色谱（HPLC）分析。图2和图3展示了纯合子和杂合子Cmah基因敲除小鼠（-/- 和 +/-）以及野生型小鼠乳汁和肝脏样本中衍生化唾液酸的代表性HPLC色谱图。图4显示了根据HPLC峰面积计算得到的各小鼠样本中N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）的相对含量。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本方案通过分析和定量乳汁及肝脏样品中 Neu5Gc 的相对含量，实现对纯合子 Cmah 基因敲除小鼠的表型评估。分析采用配备荧光检测器的标准高效液相色谱（HPLC）系统进行。该实验最关键的步骤是阴离子交换柱的制备及阴离子交换色谱操作；正确装填树脂并准确收集洗涤和洗脱组分需要一定的实践经验。

或者，本文所用的衍生化试剂OPD可轻松替换为成本较高的衍生化试剂DMB（1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯）。此外，步骤6.5中获得的唾液酸衍生化产物也可采用质谱检测替代荧光检测进行分析即 Shimadzu Nexera UPLC系统连接MS-2020检测器）。在执行步骤7.2至7.6后，直接采用正离子化模式检测唾液酸衍生物，扫描m/z值为382.0和398.0（这两个值分别为H+分别为 Neu5Ac-OPD 和 Neu5Gc-OPD 的加合物。

该方法的一个局限性在于，Neu5Gc 含量只能相对于 Neu5Ac 的量进行定量，而无法实现绝对定量。要实现绝对定量，需在样品制备的初始...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分得到了中国国家自然科学基金（资助号：31471703、A0201300537 和 31671854，授予 J.V. 和 L.L.）以及千人计划（资助号：JSB2014012，授予 J.V.）的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
化学试剂：
N-乙酰神经氨酸SigmaA0812
N-羟乙酰神经氨酸Sigma506441 mg 分装量已足够
邻苯二胺Sigma694975
亚硫酸氢钠J&K Scientific Ltd75234
仪器/材料：
3 mL 固相萃取管SupelcoSigma 57024空的固相萃取柱
鲁尔止流阀SigmaS7396用于控制固相萃取管的流速
Dowex 1X8Dow ChemicalsSigma 44340200 - 400 目
杜恩斯组织研磨器SigmaD8938紧密配合型
高效液相色谱分析：
高回收率 HPLC 小瓶Agilent Technologies#5188-2788
HPLC 系统ShimadzuNexera
HPLC 荧光检测器ShimadzuRF-20Axs
HPLC 色谱柱PhenomenexHyperclone ODS250 x 4.6 mm
LCMS 级 H2OMerck Millipore#WX00011
LCMS 级乙腈Merck Millipore#100029Hypergrade
氢氧化铵溶液Fluka#44273优级纯

参考文献

  1. Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
  2. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273 (25), 15866-15871 (1998).
  3. Chou, H. H., et al. A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan divergence. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (20), 11751-11756 (1998).
  4. Rehan, I. F., et al. Large-Scale Glycomics of Livestock: Discovery of Highly Sensitive Serum Biomarkers Indicating an Environmental Stress Affecting Immune Responses and Productivity of Holstein Dairy Cows. J Agric Food Chem. 63 (48), 10578-10590 (2015).
  5. Wang, B., McVeagh, P., Petocz, P., Brand-Miller, J. Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants. Am J Clin Nutr. 78 (5), 1024-1029 (2003).
  6. Yao, H. L., et al. Quantification of sialic acids in red meat by UPLC-FLD using indoxylsialosides as internal standards. Glycoconj J. 33 (2), 219-226 (2016).
  7. Nguyen, D. H., Tangvoranuntakul, P., Varki, A. Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignant immune cells. J Immunol. 175 (1), 228-236 (2005).
  8. Byres, E., et al. Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial toxin. Nature. 456 (7222), 648-652 (2008).
  9. Hedlund, M., Padler-Karavani, V., Varki, N. M., Varki, A. Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (48), 18936-18941 (2008).
  10. Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12045-12050 (2003).
  11. Svennerholm, L. Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method. Biochim Biophys Acta. 24 (3), 604-611 (1957).
  12. Warren, L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids. J Biol Chem. 234 (8), 1971-1975 (1959).
  13. Kakehi, K., Maeda, K., Teramae, M., Honda, S., Takai, T. Analysis of sialic acids by gas chromatography of the mannosamine derivatives released by the action of N-acetylneuraminate lyase. J Chromatogr. 272 (1), 1-8 (1983).
  14. Wheeler, S. F., Domann, P., Harvey, D. J. Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 --> 3)- and alpha(2 --> 6)-isomers. Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (2), 303-312 (2009).
  15. Hurum, D. C., Rohrer, J. S. Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods. J Dairy Sci. 95 (3), 1152-1161 (2012).
  16. Ito, M., et al. An improved fluorometric high-performance liquid chromatography method for sialic acid determination: an internal standard method and its application to sialic acid analysis of human apolipoprotein. E. Anal Biochem. 300 (2), 260-266 (2002).
  17. Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Mol Cell Biol. 27 (8), 3008-3022 (2007).
  18. Manzi, A. E., et al. High-pressure liquid chromatography of sialic acids on a pellicular resin anion-exchange column with pulsed amperometric detection: a comparison with six other systems. Anal Biochem. 188 (1), 20-32 (1990).
  19. Hedlund, M., et al. N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution. Mol Cell Biol. 27 (12), 4340-4346 (2007).
  20. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  21. Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246(2007).
  22. Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
  23. Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar J. 6, 169(2007).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

N N
野生型与CMAH基因敲除小鼠肝脏及乳汁样品中唾液酸的测定
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。