我们描述了一种基于高效液相色谱法（HPLC）的方法，用于测定小鼠肝脏和乳汁中的N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸。
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本文内容
摘要
摘要
CMAH（胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶）负责哺乳动物体内胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸的氧化反应。然而，由于人类CMAH基因发生了一个主要的外显子缺失，无法将胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸氧化为胞苷单磷酸-N-羟乙酰神经氨酸。为了更深入地理解CMAH活性缺失所带来的影响及其意义，在基础与应用研究中，构建小鼠的Cmah基因敲除模型具有重要意义。本文详细描述了用于确定该小鼠模型表型的分析方法，该方法基于检测野生型和Cmah基因敲除小鼠肝脏及乳汁中N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸的存在情况。内源性唾液酸被释放后，与邻苯二胺（o-phenylenediamine）进行衍生化反应，生成具有荧光特性的衍生物，随后可通过高效液相色谱（HPLC）进行分析。本方案也可应用于来自其他多种来源的乳汁和组织样本的分析，有助于研究N-羟乙酰神经氨酸对营养与健康的影响。
引言
N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）和N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）是大多数哺乳动物中最常见的唾液酸1。尽管人类能够内源性合成Neu5Ac，但由于编码CMP-Neu5Ac羟化酶的CMAH基因发生外显子缺失，无法产生Neu5Gc2,3。然而，动物源性食品可作为Neu5Gc的膳食来源4,5,6，导致机体产生抗Neu5Gc抗体，从而引发针对Neu5Gc的免疫反应7。这种Neu5Gc的膳食效应被认为可能促进慢性炎症及其他多种疾病的发生8,9,10。为了全面理解Neu5Gc对人类的影响，建立一种用于系统研究食源性唾液酸效应的动物模型具有重要意义。虽然基于聚合酶链式反应（PCR）的基因敲除小鼠分析方案已较为成熟，并可便捷地进行基因型鉴定，但对表型在代谢水平上的功能分析则需要更特异的分析方法。Cmah基因敲除小鼠模型的表型可通过分....
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方案
涉及动物实验的操作已获得南京农业大学实验动物中心伦理委员会批准，符合《国家实验动物福利伦理指南》（中华人民共和国科学技术部，2006年）的要求，动物饲养于SPF级设施中（许可证号：SYXK-J-2011-0037）。
1. Cmah 基因敲除小鼠模型
- 使用扬州大学比较医学中心（中国）提供的野生型 C57Bl/6 小鼠。
注意：Cmah 基因敲除小鼠是根据以往 Cmah 基因敲除研究提供的信息构建的17,19，并通过 CRISPR/Cas920 技术策略商业化获得，该策略通过删除 Cmah 基因第6号外显子中的92个碱基对实现，而该区域在人类 CMAH 基因中同样缺失19。将阳性 F0 代小鼠（2只）与野生型小鼠杂交，获得杂合子 F1 代小鼠。再将杂合子 F1 代小鼠（5只）相互交配，成功获得纯合子 Cmah 基因敲除 F2 代小鼠（3只）。 - 采用商业化的DNA纯化试剂盒，按照Zangala
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结果
所描述分析方法的示意图如图1所示，包括从野生型和Cmah基因敲除突变小鼠的乳汁和肝脏样本中分离唾液酸，以及这些成分的荧光衍生化和高效液相色谱（HPLC）分析。图2和图3展示了纯合子和杂合子Cmah基因敲除小鼠（-/- 和 +/-）及野生型小鼠乳汁和肝脏样本中衍生化唾液酸的代表性HPLC色谱图。图4显示了根据HPLC峰面积计算出的各小鼠样本中N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）的相对含量。
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讨论
本方案通过分析和定量乳汁及肝脏样品中 Neu5Gc 的相对含量，实现对纯合子 Cmah 基因敲除小鼠的表型评估。分析采用配备荧光检测器的标准高效液相色谱（HPLC）系统进行。该实验最关键的步骤是阴离子交换柱的制备及阴离子交换色谱操作；正确装填树脂并准确收集洗涤和洗脱组分需要一定的实践经验。
或者，本文所用的衍生化试剂OPD可轻松替换为成本较高的衍生化试剂DMB（1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯）。此外，步骤6.5中获得的唾液酸衍生化产物也可采用质谱检测替代荧光检测进行分析即 Shimadzu Nexera UPLC系统连接MS-2020检测器）。在执行步骤7.2至7.6后，直接采用正离子化模式检测唾液酸衍生物，扫描m/z值为382.0和398.0（这两个值分别为H+分别为 Neu5Ac-OPD 和 Neu5Gc-OPD 的加合物。
该方法的一个局限性在于，Neu5Gc 含量只能相对于 Neu5Ac 的量进行定量，而无法实现绝对定量。要实现绝对定量，需在样品制备的初始.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分得到了中国国家自然科学基金（资助号：31471703、A0201300537 和 31671854，授予 J.V. 和 L.L.）以及千人计划（资助号：JSB2014012，授予 J.V.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 化学试剂： | |||
| N-乙酰神经氨酸 | Sigma | A0812 | |
| N-羟乙酰神经氨酸 | Sigma | 50644 | 1 mg 分装量已足够 |
| 邻苯二胺 | Sigma | 694975 | |
| 亚硫酸氢钠 | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
| 仪器/材料： | |||
| 3 mL 固相萃取管 | Supelco | Sigma 57024 | 空的固相萃取柱 |
| 鲁尔止流阀 | Sigma | S7396 | 用于控制固相萃取管的流速 |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200 - 400 目 |
| 杜恩斯组织研磨器 | Sigma | D8938 | 紧密配合型 |
| 高效液相色谱分析： | |||
| 高回收率 HPLC 小瓶 | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
| HPLC 系统 | Shimadzu | Nexera | |
| HPLC 荧光检测器 | Shimadzu | RF-20Axs | |
| HPLC 色谱柱 | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250 x 4.6 mm |
| LCMS 级 H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS 级乙腈 | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
| 氢氧化铵溶液 | Fluka | #44273 | 优级纯 |
参考文献
- Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
- Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A.
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重印与许可
