非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是分析RNA-蛋白质相互作用的基本工具。传统上，大多数实验采用垂直凝胶。然而，水平凝胶具有多个优势，例如可在电泳过程中实时监测复合物的迁移情况。本文提供了一种制备和使用水平非变性凝胶电泳的详细实验方案。
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摘要
摘要
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学的一项基本工具，已广泛用于RNA-蛋白质相互作用的生化分析。传统上，这些相互作用是通过在两块玻璃板之间制备的聚丙烯酰胺凝胶，并在垂直方向上进行样品电泳来分析的。然而，使用托盘制备并在水平方向上进行电泳的聚丙烯酰胺凝胶具有多项优势。例如，在分析荧光标记RNA底物与特定蛋白质形成的复合物时，可在电泳过程中多次成像水平凝胶，从而能够在实验的多个时间点实时监测RNA-蛋白质复合物的迁移情况。此外，水平凝胶电泳可实现多个样品的平行分析，这大大有利于时间进程实验，以及同时比较不同组分和条件下的多个反应。本文提供了一套详细的实验方案，用于制备和使用水平非变性凝胶电泳来分析RNA-蛋白质相互作用。
引言
电泳迁移率变动分析（EMSAs）已被证明是分析特定蛋白质-核酸相互作用的一种极为重要的生物化学工具1,2,3。该分析方法可提供有关蛋白质与RNA或DNA结合亲和力的重要信息3，核酸-蛋白质复合物的组分化学计量关系1，并通过底物竞争实验为RNA结合蛋白的结合特异性提供重要的新见解1。
这些实验的传统设置包括将纯化的蛋白质与放射性标记的RNA底物混合。随后，通过在两块玻璃板之间灌注的非变性（天然）聚丙烯酰胺凝胶对形成的复合物进行分析，并在垂直电泳装置中进行样品电泳3。尽管该方法已被广泛用于深入揭示蛋白质与核酸结合背后的生物化学机制，但也存在若干局限性。例如，这种基本策略的通量相对较低，难以适应需要平行分析大量结合反应的应用场景。此外，在使用传统的垂直电泳装置时，难以在电泳过程中多个时间点对复合物进行实时监测3,4。
本文介绍了一种对EMSA实验方法的改进，该方法采用在平板装置中制备的天然聚丙烯酰胺凝胶、水平电泳以及荧光标记的RNA底物4,5,6,7。在基本实验策略中引入这些相对简单的改进后，带来了一些显著优势。特别是，水平平板电泳格式可轻松实现数十个样品的同步分析4。此外，对于某些RNA-蛋白质复合物（例如Bicaudal-C蛋白与其RNA底物形成的复合物），在水平凝胶中进行电泳能够更有效地分辨不同的RNA-蛋白质复合物，并将其与未结合的RNA底物区分开来。
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方案
1. 水平天然聚丙烯酰胺凝胶的制备4。
- 准备所需材料。
- 对于水平凝胶装置，使用一个尺寸为 37 cm × 24 cm 的电泳槽，配备 27 cm × 21 cm 的托盘，并可容纳两个 24 孔梳子。此设置可同时分析总共 48 个样品。
- 准备以下试剂：40% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺（19:1）、5× TBE（Tris-硼酸-EDTA，pH 8.0）、TEMED 和 10% 过硫酸铵（APS）。
- 制备 10% 天然丙烯酰胺凝胶。
- 在 500 mL 锥形瓶中加入 80 mL 5× TBE、100 mL 40% 丙烯酰胺溶液，并加水至终体积为 400 mL。
- 加入 4 mL 10% APS 和 400 µL TEMED，充分混匀。
- 将混合液倒入水平制胶托盘中，静置聚合 30 分钟。凝胶厚度约为 2 cm。
注意：可在通风橱中制胶以加快聚合速度。聚合完成后，凝胶表面将残留一层薄液体。 - 倾去液体，并用运行缓冲液冲洗。小心拔出梳子，并使用注射器以运行缓冲液冲洗加样孔。
- 运行缓冲液的配制。
- 为电泳槽配制 2 L 的 1× TBE 运行缓冲液。将 400 mL 5× TBE 用 1600 mL 水稀释并混匀。将 1× TBE 缓冲液置于冷室中冷却。
- 凝胶预电泳。
- 向电泳槽中加入 2 L 冷却的运行缓冲液，并插入凝胶。
- 在冷室中以 4 °C、120 V 预电泳 1 小时。在此期间，准备结合反应体系。
2. 结合反应8
- 2.1. 准备以下反应组分。
20 mM DTT
10 mM BSA
10 mM 酵母tRNA
5X 结合缓冲液（50 mM HEPES pH 8.0，5 mM EDTA，250 mM KCl，0.2% Tween-20）
商业购买的荧光素标记RNA，浓度为100 nM
浓缩的Bicaudal-C蛋白
DEPC处理过的H2O中含50%甘油
DEPC处理过的H2O - 在无RNase的微量离心管中配制结合反应体系。
- 向离心管中加入5 µL 10 mM BSA、5 µL 20 mM DTT、5 µL 10 mM 酵母tRNA以及10 µL 5x 结合缓冲液。
- 加入蛋白，使其终浓度为250 nM，总体积为50 µL；再加入水，使终体积达到45 µL。
- 加入5 µL 荧光标记的RNA底物。使用商业购买的3'端荧光素标记的32核苷酸底物。
- 混匀后避光孵育，室温下反应30分钟。
3. 天然水平聚丙烯酰胺凝胶上样品的分析
- 向每个反应体系中加入 15 µL 的 50% 甘油，并轻轻混匀。
- 小心地将每个反应体系中的 30 µL 加样至凝胶中。单个加样孔可加载的样品量取决于凝胶厚度和加样孔大小。我们曾将 15 µL 至 45 µL 不等的体积加样至使用 24 孔梳、厚度为 2 cm 的凝胶单孔中。
- 将电源连接至凝胶电泳装置后，打开电源并调节电压。在 4 °C 条件下以 120 V 进行电泳。
注意：对于水平电泳装置，这相当于约 5 V/cm；对于垂直电泳装置，则为 16 V/cm。- 为防止荧光标记的 RNA 受损或淬灭，应在避光条件下进行电泳。
- 根据所分析的 RNA-蛋白质复合物的具体情况调整电泳时间。
注意：水平 EMSA 分析的一个主要优势在于，电泳可中途暂停，对凝胶成像后，再将凝胶放回装置中继续进行更长时间的电泳。
4. 凝胶成像
- 使用专为检测和成像荧光底物设计的任何仪器进行分析。
- 将凝胶放置在成像仪上。
- 调整成像仪设置。对于荧光素标记的RNA配体，使用以下设置：FAM（波长473 nm），750 光电倍增管电压（PMT），100 µm 像素尺寸。
- 扫描凝胶以获取图像。
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结果
为了展示水平非变性凝胶电泳的强大功能与广泛应用性，我们分析了结合过程的 非洲爪蟾 Bicaudal-C（Bicc1）蛋白与含有Bicc1结合位点的荧光标记RNA结合。Bicc1蛋白作为mRNA特异性的翻译抑制因子，在动物发育的母源阶段调控细胞命运决定9,10,11,12 以及成人特定器官的功能13,14. 我们在 非洲爪蟾 鉴定出Bicc1蛋白的第一个结合位点8Cripto-1 mRNA 3'非翻译区的一个32个核苷酸的区域8,
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讨论
天然聚丙烯酰胺凝胶是研究蛋白质-RNA相互作用的重要工具，传统上这些凝胶采用垂直电泳方式2,3。我们采用了一种改进的方案，使用水平制备和水平电泳的天然聚丙烯酰胺凝胶1,4,6,7,15。这种改进结合荧光标记的RNA底物，在蛋白质-RNA结合相互作用的生化分析中具有多种优势：与需要泵将缓冲液从下层室转移到上层室的垂直装置相比，水平系统的缓冲液配制更为简便；水平凝胶可制备更大的加样孔，从而提高对较大样本的分析能力；水平凝胶电泳通常比垂直凝胶能提供更佳的RNA-蛋白质复合物分辨效果；此外，水平凝胶电泳还允许在分析过程中对实验进行多个时间点的成像观察。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Laura Vanderploeg 在制备图示方面的工作。Sheets 实验室的工作由美国国家科学基金会（NSF）资助项目 1050395 和美国国立卫生研究院（NIH）资助项目（R21HD076828）支持。Ryder 实验室的工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 R01GM117237 和 R01GM117008 支持。Megan Dowdle 获得威斯康星大学麦迪逊分校研究生院 SciMed GRS 高级机会奖学金以及美国国立卫生研究院下属国家普通医学科学研究所生物技术培训项目（T32GM008349）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 水平凝胶电泳槽 | OWL | N/A | 该产品已停产。类似产品可参见赛默飞世尔科技（Thermo Scientific）A系列凝胶电泳槽，目录号：A2-BP |
| 24孔大型水平凝胶电泳梳子 | OWL | N/A | 该产品已停产。类似产品可参见赛默飞世尔科技（Thermo Scientific）A系列凝胶电泳梳，目录号：A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II 电泳槽 | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| 酵母tRNA | Ambion | AM7119 | |
| 荧光素标记RNA | IDT | N/A | 可根据所需长度和序列定制订购 |
| 乙二胺四乙酸四钠盐水合物 | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | E5391-1KG | |
| HEPES | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | H4034-500G | |
| 超纯Tris碱 | US Biological | T8600 | |
| 硼酸 | 菲舍尔科技（Fisher Scientific） | BP168-500 | |
| 氯化钾 | 菲舍尔科技（Fisher Scientific） | BP366-1 | |
| Tween-20 | 菲舍尔科技（Fisher Scientific） | BP337-500 | |
| DEPC | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | 1609-47-8 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | 3483 12 3 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | 西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich） | 9048-46-8 |
参考文献
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