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对称与非对称溶液条件下带电囊泡相行为的荧光显微镜监测

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DOI：

10.3791/56034

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2017年10月24日

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1Max Planck Institute of Colloids and Interfaces

本文内容

摘要

关于相分离巨型单层囊泡（GUVs）的实验常常忽略了生理溶液条件。本研究提出了一种方法，用于探究高盐缓冲液对带电多组分GUVs中液-液相分离的影响，该影响随跨膜溶液不对称性和温度的变化而变化。

摘要

由二油酰基磷脂酰甘油、蛋鞘磷脂和胆固醇形成的带电巨大单层囊泡（GUVs），表现出共存的液相有序和液相无序区域，是研究脂筏假说的常用生物物理工具。然而，许多研究忽略了生理溶液条件的影响。因此，本研究展示了高盐缓冲液以及跨膜溶液不对称性对这类带电GUVs中液-液相分离的影响。这些效应在等温及变温条件下均进行了研究。

我们介绍了适用于在对称和非对称高盐溶液条件下监测带电囊泡中共存液相区域稳定性的设备与实验策略。其中包括在高温条件下于高盐缓冲液中制备带电多组分大单层囊泡（GUV）的方法。该方案提供了一种通过简单稀释步骤部分置换外部溶液的选择，同时最大限度地减少囊泡的稀释。此外，还提出了一种替代方法，利用微流控装置实现外部溶液的完全置换。我们还在不同温度条件下研究了溶液对相分离的影响。为此，我们展示了自行构建的温度控制腔室的基本设计及其应用。此外，我们还讨论了GUV相态评估的方法、相关潜在问题及其规避策略。

引言

自从通过荧光显微镜观察到液-液相分离的巨型单层囊泡（GUVs）中存在微米尺度的结构域以来，GUVs 便被 用作研究脂筏假说的模型体系1,2,3。由于其游离双分子层的面积范围与生物细胞相近，因此它们是模拟含有假定脂筏结构的细胞质膜的合适模型。已有大量针对此类 GUVs 的研究在纯水、蔗糖溶液或低盐溶液中分散的囊泡上开展4,5,6,7,8。然而，这些条件并不能反映生物膜在生理条件下所处的高盐环境以及跨膜溶液不对称性，而这正是细胞所处的真实环境。

在本研究及本课题组此前发表的一篇文献9中，研究了盐的存在以及膜两侧溶液不对称性对带电多组分大单层囊泡（GUV）相态的影响。GUV由不同比例的二油酰基磷脂酰甘油（DOPG）、蛋鞘磷脂（eSM）和胆固醇（Chol）混合制备，脂质膜分别置于蔗糖溶液（渗透压为210 mOsm/kg）或高盐缓冲液（100 mM NaCl，10 mM Tris，pH 7.5，210 mOsm/kg）中。选择这些脂质是基于已有研究对该混合物相图所获得的数据6,8。

文献中报道了多种制备GUVs的方法10,11,12（需注意，本文不讨论涉及将脂质从油相转移至水相的方法13,14，因为膜中残留的油分可能影响相行为，存在固有风险）。在高盐缓冲液中制备GUVs面临特定挑战。对于低离子强度溶液，电形成法15,16是一种快速、高产且缺陷较少的GUVs制备方法10,17。该方法基于将脂质层沉积在导电表面（电极）上，干燥后在施加交流电场的同时用水性溶液进行水合。然而，若水溶液中含有盐，则该方法需要进行相应调整18,19。通常认为，电形成过程中囊泡生长的驱动力是电渗作用16，而高电导率会抑制电渗效应20。因此，在高盐溶液中通过电膨胀法制备GUVs并非直接可行，需针对溶胀液中不同的盐浓度进行优化。凝胶辅助囊泡溶胀法21,22是电形成法的一种潜在替代方案，且形成速度更快。该方法利用凝胶（如琼脂糖或聚乙烯醇（PVA））作为基底，增强脂质膜的水合效率。然而，该方法也存在风险，例如基于琼脂糖的溶胀可能导致膜污染23，而基于PVA的溶胀则受限于温度条件。类似地，近期已建立一种在纤维素滤纸基底上生长GUVs的方案24。该方法的普遍问题在于难以控制基底纯度，且需要使用大量脂质。在本研究中，我们将介绍并阐述最传统的GUVs制备方法——即自发溶胀法25,26的优势。该方法包括将脂质层干燥于疏脂性基底上，在水蒸气环境中进行水合，随后在目标溶胀溶液中进行溶胀（见图1及“实验方案”部分的详细说明）。该方法无法控制囊泡的尺寸分布，所得囊泡总体上比使用电场、聚合物基底或微流控辅助方法制备的囊泡更小。然而，其囊泡质量和尺寸适用于本研究中所探讨的膜相态分析。

在囊泡膜两侧形成溶液不对称性也面临某些挑战。一种常用的方法是将囊泡悬浮液直接稀释到目标外部溶液中27,28。然而，这种方法也会降低囊泡的分布密度。另一种策略是缓慢置换沉降在流动池底部的GUVs周围的外部溶液，以实现溶液的流入与流出。为了避免流动干扰甚至丢失囊泡，需采用低流速8，这使得该方法效率较低。此外，上述两种方法均不能保证完全更换外部溶液。一个显而易见的解决方案是固定囊泡，以避免在更换外部溶液时丢失。例如，可将生物素化的GUVs锚定在链霉亲和素包被的表面29。但这种方法可能导致附着区域与非附着区域的膜组成出现差异30,31。利用磁场或电场捕获囊泡会导致膜张力的施加32。使用光镊捕获囊泡需要连接一个手柄（i.e. 微珠），而使用光拉伸器则可能引起局部加热33。GUVs的捕获还可通过在铂丝上生长而不最终分离来实现34。然而，这种方法得到的囊泡并非孤立存在，通常通过细小的脂质管（tethers）与铂丝或其他囊泡相连。

本文介绍了解决上述局限性的策略。我们首先详细描述了一种经过改进和优化的自发溶胀法，该方法适用于在高盐缓冲液中高效制备大单层囊泡（GUVs）。随后，我们提出了两种通过简单稀释或使用微流控装置来有效建立不对称溶液条件的方法。由于我们的目标是在不同溶液条件下分析GUV膜的相态，后续部分阐述了成功进行统计分析的标准，并提供了避免错误分类的建议。

实验在等温条件以及不同温度条件下进行。尽管温度控制在实验中被广泛使用，但关于实验温控腔的详细描述却鲜有报道。本文介绍了一种自行搭建的装置，可用于在不同温度条件下观察GUVs。

方案

1. GUVs 的自发膨胀

注意：氯仿是一种有害且高度挥发的物质。所有涉及氯仿的操作均应在通风橱中进行。请勿使用塑料实验器具（如移液器吸头或塑料容器）转移和/或储存氯仿溶液，因为氯仿会溶解塑料，从而污染溶液。应使用玻璃注射器和玻璃容器代替。此外，操作过程中应尽可能保持洁净，避免引入杂质，因为杂质可能与膜发生相互作用。需注意，最终大单层囊泡（GUV）制备物中的典型脂质浓度处于微摩尔浓度范围，因此在此浓度范围内的杂质可能对膜的行为产生显著影响。

  1. 除基本设备外，还需准备好以下物品。
    1. 准备一块聚四氟乙烯（PTFE，通常称为特氟龙）板用于脂质沉积，尺寸约为 1.5 cm × 1.5 cm，厚度适宜。用细砂纸将该板一侧表面打磨粗糙。
      注意：聚四氟乙烯（PTFE）具有疏脂性，若表面光滑，则无法被氯仿溶液润湿。可将PTFE板的两侧均进行粗糙化处理，以避免在脂质沉积时混淆正确的一面。应根据操作便利性选择合适的板材厚度。 例如 使其不过于柔软，且能轻易被水合溶液覆盖（参见 图1）。此处我们使用了厚度约为 2 mm 的板材。聚四氟乙烯板经粗化处理后，经过适当清洗（步骤 1.3），可重复用于新的实验。
    2. 准备一个适当体积（约15 mL）的可密封玻璃小瓶，用于最终的脂质膜水合和囊泡生长。
    3. 准备一个可密封的玻璃容器，能够容纳约15 mL的玻璃小瓶；该容器将用于为脂质膜预溶胀提供一个水饱和的环境，参见 图1.
  2. 制备所需比例的1,2-二油酰基-磷脂酰胆碱与4 mM脂质储备液sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油)（钠盐）（DOPG）、卵黄鞘磷脂（eSM）和胆固醇（Chol），另加0.1 mol% 1,1′-二十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiIC）18) 至总脂质浓度为4 mM，使用氯仿作为溶剂。参见 材料清单.
  3. 用商用洗洁精、乙醇和氯仿依次彻底清洗聚四氟乙烯板和玻璃容器，最后将其干燥。
  4. 使用玻璃注射器，滴加并均匀涂布10 - 15 µL 将脂质储备液滴加到PTFE板的粗糙面，形成均匀的脂质膜。必要时可用注射器针头铺展溶液。
  5. 将聚四氟乙烯板置于洁净表面，与沉积的脂质膜一同干燥2小时 60 °C 以去除氯仿。为方便起见，在干燥过程中将培养板放入已清洁且未密封的15 mL玻璃容器中。
    注意：高温确保脂质膜在此步骤及后续所有步骤中均处于均匀的单液相状态。
  6. 干燥后，向预溶胀的玻璃容器中加入去离子水，液面高度以不会因浮力导致约 15 mL 玻璃小瓶（约 1 cm）倾倒为宜，参见 图1.
  7. 将约15 mL的玻璃小瓶连同PTFE板放入容器中并盖好，以形成水饱和的环境，参见 图1B.
    注意：内层容器壁上出现冷凝水是水蒸气饱和成功的一个良好指示。
  8. 让沉积的脂质膜在密闭的玻璃容器内预溶胀 60 °C 4 小时。在此期间内配制所需的肿胀溶液。
    注意：对于可在较低温度下进行的囊泡制备，若在预溶胀步骤中使用温热的饱和氮气或氩气，则此时间可显著缩短至几分钟。
    1. 配制 200 mM 蔗糖或 100 mM NaCl、10 mM Tris（用 HCl 调节 pH 至 7.5），并加热至 60 °C 用于配制肿胀液。
  9. 预溶胀后，将装有PTFE板的约15 mL玻璃杯从容器中取出。用连接至 0.45 µm 过滤后，向15 mL玻璃小瓶中加入约5 mL溶胀溶液，以水合脂质膜。
    注意：将针头固定在滤器上有助于插入溶胀溶液。在加入溶胀溶液前，建议预热注射器和滤器，以确保脂质膜处于单一液相状态。过滤溶液可最大限度减少细菌或盐析等有机或无机污染。 等等。
  10. 将装有水合脂质膜的约 15 mL 玻璃小瓶密封于聚四氟乙烯（PTFE）板上，以尽量减少蒸发。必要时可使用封口膜加强密封。将水合脂质膜静置 60 °C 过夜以完成GUV溶胀。

2. 收获 GUVs

注意：GUVs 从 PTFE 基底溶胀并脱离后发生聚集，形成肉眼可见的微小（约 1 mm）云状团块。若未使用荧光染料，该团块呈白色；否则，其颜色由荧光染料的吸收光谱决定。添加 DiIC18 后，团块呈粉红色（见图 2）。囊泡在聚集体中高度富集，收集该聚集体可最大化囊泡产率。

  1. 在约1小时内将囊泡冷却至室温。剪去活塞式移液器塑料吸头尖端约1/10的长度，以便囊泡簇或聚集体能够通过孔口。
    注意：如果预期发生固-液相分离，则冷却速率尤为关键，因为它会影响固相区域的大小。在此，为了减缓冷却速度，我们将样品与一块尺寸为5 cm × 9.5 cm × 7.5 cm（高×长×宽）的金属块接触，该金属块在1小时内冷却至室温。
  2. 使用适量溶胀溶液将囊泡簇吸起（见图2）。将聚集体重悬于溶胀溶液中，以形成对称溶液条件；或重悬于任意所需的等渗溶液中，以形成不对称溶液条件。
    注意：体积的下限由需完全收获的聚集体大小决定。外部溶液会被稀释，因此为了评估确切浓度，必须考虑囊泡溶液的体积。

3. 使用荧光显微镜观察GUVs以评估其相态

注意：GUVs 中掺入了 DiIC18 作为荧光标记。该荧光探针优先分布于液体无序相（Ld 相），从而可通过荧光显微镜观察 GUVs 中因相分离形成的相区。我们采用落射荧光显微镜进行相态评估。原则上，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）也可实现此类观察，并可用于信号定量分析。例如 以确定膜的单层性）。然而，CLSM 需要更复杂的设备，且在扫描前通常需要进行落射荧光观察，这在任何情况下都有助于实验。

  1. 确定一个目标（例如 40倍物镜（数值孔径NA为0.6，如本实验所用）观察GUVs，并在比较相同组分在不同溶液条件下相态时保持一致使用。根据所用荧光染料的特性，选择合适的激发和发射波长滤光片，以实现荧光观察。例如 激发波长为 560 ± 40 nm 和 630 ± 75 nm，中间使用 585 nm 二向色镜，适用于 DiIC18).
    注意：相图中相态边界的确定取决于物镜所能达到的分辨率，因为分辨率决定了可检测微区的最小尺寸。
  2. 用于分析时，仅选择满足以下质量标准的GUVs。
    1. 通过肉眼观察不同 giant unilamellar vesicle（GUV）囊泡并比较其荧光强度，以确保 GUV 膜的单层性；荧光发射强度最低的囊泡最可能为单层膜结构。
      注意：自发性溶胀可能产生囊泡批次，其中大部分巨型囊泡并非单层结构。
    2. 通过定量分析假定为单层的巨大囊泡的荧光发射强度，并检测群体中相应的散射信号，进行进一步验证。若在不同GUV之间未观察到整数倍差异，则它们很可能均为单层结构。
      注意：若使用常规脂质并通过自发溶胀等既定方法制备囊泡，则上述用于检测单层囊泡的方法已足够。若建立新的大单层囊泡（GUV）制备方案或使用非常规脂质，则需要进行更详细的研究以确认其单层性。例如，可将新方案制备的标记囊泡的膜荧光信号与通过既定方法制备的GUV进行比较；或可将膜孔蛋白α-溶血素插入囊泡膜中24染料加入囊泡外侧后，是否会进入其内部，取决于囊泡为单层还是多层结构。
    3. 确保GUV具有合理的最小直径，以便仍能识别出相分离的微区结构。
    4. 确保 GUV 几乎无缺陷，例如无突出或粘连部分，也无内部结构。
  3. 将一份GUV悬液转移至显微镜载玻片上，并妥善封片。制备观察用样品室。
  4. 将样品置于显微镜载玻片上，用带有中央圆形切口的硅胶垫片围绕样品。为避免污染，确保垫片不与样品接触。将盖玻片置于硅胶垫片上方，密封内部空间。
    注意：除了硅胶间隔片外，也可使用硅脂或自制的聚二甲基硅氧烷（PDMS）间隔片。密封样品室可最大限度减少样品蒸发，并维持等渗条件。
  5. 让样品静置约 5 分钟，以使可能存在的结构域重新平衡。
    注意：移液操作产生的机械应力可能会混合膜结构域，而这些结构域需要时间重新形成。
  6. 将载有样品的显微镜载玻片置于显微镜载物台上，采用统计学方法分析GUV批次的相态。每批次观察超过30个GUV，并根据以下标准结合DiIC染料对GUV相态进行判定。18 (图3).
    注意：囊泡在生长后，可能由于（例如）膜区室出芽或通过纳米管交换膜材料等原因，导致其个体组分发生变化。因此，同一制备批次内的GUVs会表现出组分上的差异。35.
    1. 单液相，为液相有序（Lo）或液相无序（Ld）：确保GUV整体呈球形且表面光滑，DiIC18 在膜中均匀分布（上排和下排面板中的第一张图像） 图3).
    2. 两相 Lo+Ld 共存状态：确保囊泡显示出呈圆形且边界光滑的结构域；根据 DiIC18 相分离行为区域呈亮红色（Ld）或暗红色/黑色（Lo）（上排和下排面板中的第二张图像） 图3，伪彩色）。检查结构域是否可在囊泡表面自由扩散并发生融合。
    3. 固-液两相（S+Lo 或 S+Ld）共存状态：确保所形成的结构可能呈指状或近圆形，但具有棱角状边界（上排和下排图中第三个图像所示） 图3）。观察固体（黑色）背景上的液相区域（红色），这些液相区域不会表现出扩散现象。相反，在液相背景（红色）上的固体（黑色）区域则能够自由扩散。
    4. 三相 S+Lo+Ld 共存：观察到三种类型的相区出现：(i) 角状黑色相区（S），嵌入于 (ii) 暗色（Lo）和 (iii) 明亮红色（Ld）相区之中。
  7. 将GUV群体归类为在随机样本中确定占主导地位的相态，如以下示例所示：
    1. 若观察到20个单液相GUV和15个Lo+Ld相GUV，则将该批次视为单液相。
    2. 若观察到10个S+L GUVs、30个Lo+Ld GUVs和25个单液相GUVs，则将该批次视为Lo+Ld。

4. 微流控装置中GUV的观察

注意：首先制备微流控装置；微流控装置的设计与组装细节已在其他文献中给出36,37；简要说明见图4。

  1. 制备新鲜的GUV溶胀溶液（根据步骤1.8.1选择盐溶液或蔗糖溶液），并通过滤膜过滤 0.45 µm 过滤器
    注意：流动溶液中的任何杂质都可能堵塞微流控装置。
  2. 切割 200 µL 活塞式移液器塑料吸头，并将其插入装置的PDMS部分的孔中。添加 100 µL 和 5 µL 将新鲜过滤的膨胀液加入储液器中（参见 图 5A）以及每个切割后的移液器吸头。将整个装置置于摆动转子离心机中，以900 × g离心10分钟，以预填充装置并去除空气。
  3. 用1 mL玻璃注射器及其连接管路预先充满溶胀溶液，并将活塞位置调整至0 mL。
  4. 将管路插入装置的流体出口，并将注射器放入注射泵中。
    注意：注射器和注射泵品牌的选择并不重要。然而，玻璃注射器更为精确，且泵应能够运行在 µL/min 流速范围。
  5. 将定制的压力控制装置连接至微流控控制层的8个入口（参见 图 5A将压力控制单元的压力设定为3 bar（空气、氮气或氩气），但将通往微流控装置的阀门置于关闭位置。
  6. 将已连接至注射泵和压力控制单元的微流控装置置于倒置共聚焦显微镜载物台上。
    1. 使用与整体观察期间相同放大倍数和数值孔径（NA）的物镜。若更换其他物镜，需按照步骤3.7所述方法检验相态统计结果是否保持一致，以避免因分辨率差异导致的观察伪影。
  7. 将GUVs加载到装置中。
    1. 首先，用移液器吸去所有液体，仅保留25至 50 µL 储存于储液槽中的溶液。添加 150 µL GUV 溶液的（根据步骤 1.8.1 使用蔗糖或盐溶液，但需与 将步骤 4.1 中用于预填充装置的溶液加入储液器中，轻轻吹打混匀。将注射器设置为 10 µL/min 在撤回模式下以流速运行约 20 分钟，或直至超过 90% 的捕获点被占据。
      注意：切勿让储液槽完全干涸。若发生这种情况，气泡将进入微通道。加样过程中可向储液槽补充更多GUV溶液，但用移液器向装置中加样时需注意避免引入气泡。
  8. 打开所有压力控制单元阀门，以关闭捕获点/GUV周围的微流控环形阀。将注射泵设置为 0 µL/min孵育1小时后，观察GUVs并记录共聚焦图像。根据所使用的荧光染料激发并检测GUVs（例如 561 nm 激发，580 - 620 nm 检测，与 DiIC 相同18）。采用步骤 3.6 中相同的筛选标准。, 并仔细记录每个GUV的位置（即 列数和行数，参见 图4)
  9. 更换溶液 围绕 GUVs.
    1. 将注射泵设置为 0 µL/min 移除除25至 50 µL 从储液器中取出GUV溶液。加入 150 µL 将第二种溶液（根据步骤1.8.1选择蔗糖或盐溶液，取决于GUVs外部所需的溶液）加入储液池中，并通过轻柔吹打混匀。用移液器吸除多余液体，仅保留25至 50 µL 缓冲液从储液槽中流出。
      注意：该溶液必须使用过滤器过滤 0.45 µm 滤膜也同样需要。
  10. 至少重复上一步骤5次，以彻底更换储液槽中的溶液。将注射器调至 10 µL/min 在撤回模式下以流速运行约10分钟，以更换微通道中的溶液。
  11. 降低流速至 1 µL/min. 打开8个压力控制单元阀门2秒，然后再次关闭（从而实现微流控环形阀门的开启与关闭）。将流速设定为 0 µL/min 再次。
  12. 孵育1小时后，观察GUVs并记录共聚焦图像。再次注意记录每个GUV所在微室的列和行位置，以便对同一GUV在外部缓冲液更换前后的状态进行比较。

5. 温度控制室的设计与校准

注意：合适的温度控制腔室可购买商用产品，也可自行搭建。通常通过将腔室与GUV样品和水浴或帕尔贴元件进行热耦合来实现温度控制。本文介绍了使用外部水浴恒温器的自制温度控制腔室的设计与表征方法。此类恒温器在许多实验室中均有配备，或可从旧设备（如激光器或光谱仪）中回收利用。

  1. 组装一个热流室，此处使用铝块制成，并连接至水浴，如图6所示。将顶部和底部的开口密封，并通过在铝块上粘贴盖玻片，实现对样品的明场观察。
  2. 将流室翻转至待放置样品的一侧，用移液器滴加约100 µL 按步骤1.8.1中所用实验溶液。可选地，插入光纤温度探针（例如 FISO FTI-10）或加入适当浓度的温度敏感染料，例如 500 µM Rhodamine B。
  3. 使用以环形涂抹的硅脂或其它间隔物（如PTFE或橡胶）组装GUV观察室，并用厚度为0.17 µm的盖玻片密封。确保液滴不与密封剂或间隔物接触，以避免引入杂质。
  4. 缓慢将整个装置倒置，并用合适的管路将其连接至外部水浴恒温系统。特别注意检查是否存在漏水现象。
  5. 将外部水浴恒温系统的温度设为所需最低温度，使系统平衡直至温度传感器读数稳定；达到平衡所需的时间可用于估计系统的最小响应时间。
  6. 在开始使用该装置前，至少进行一次对照实验。
    1. 测量溶液温度（例如 使用玻璃光纤探针），并与恒温系统在目标温度范围内的读数进行比较。
    2. 检查实测温度与恒温系统读数之间是否存在微小偏移，以及温度测量的线性关系。
    3. 使用温度敏感染料检测观察室内是否存在温度梯度。通过荧光强度或荧光寿命成像显微技术（FLIM）测量距底部盖玻片不同距离处的溶液温度40。此外，检查GUV观察区域是否存在温度梯度，如图7所示。

6. 不同温度下 GUV 的观察

注意：通常情况下，对于其膜可能发生相分离且在观察温度 Tobs 下呈现均一状态的大单层囊泡（GUVs），当温度降至 Tobs 以下时将诱导相分离（是否观察到相分离取决于所研究的温度范围）。反之，在高于 Tobs 的温度下，已发生相分离的囊泡应转变为均一状态。然而，对于某些（复杂的）脂质组成而言，这一规律未必成立，因此建议始终扫描整个可及的温度范围38。观察和评估相变温度的实验方案并不依赖于所采用的特定温度控制方法。

  1. 按照第5节组装温度观测室，但省略光纤温度探头或温度敏感荧光染料。
  2. 将外部水浴设置为室温（23 °C），使系统平衡10–15分钟。
  3. 使用步骤3.6中的标准统计发生相分离的囊泡数量；GUV群体的整体相态可提示系统相变温度所处的区域。若囊泡群体间的相态较为异质，则直接进入步骤6.5。
  4. 若大多数囊泡处于相分离状态，则升高温度；若大多数囊泡为均一相，则降低温度，调节幅度为粗略区间（例如 1–2 °C），并让系统平衡约2分钟。通过随机取样重新评估GUV群体的相态，并持续调节温度，直至囊泡群体呈现异质相态。
  5. 当群体接近相变点时（即 不同GUV之间的相态差异较大），减小温度调节步长（例如 0.5 °C）以提高分辨率。让系统平衡约2分钟，并通过随机取样重新评估GUV群体的相态。
  6. 一旦越过相变点，继续调节温度，直至所有GUV均变为均一相或完全相分离。
  7. 检查是否存在滞后现象，以评估平衡时间是否充分。
    1. 改变温度扫描方向，即 若先前为升温扫描，则改为降温扫描。
    2. 选择至少一组温度点，用于评估GUV群体的相态比例（例如 80%相分离）。
    3. 若两个方向在相态比例上存在显著偏差，表明存在滞后现象，此时应减小步骤6.4和6.5中的温度步长和/或延长平衡时间。
    4. 若两个方向的相态比例一致，表明无滞后现象，可考虑增大步长和/或缩短平衡时间。
  8. 将相态比例对温度作图。为进行定量分析，将数据拟合至合适的模型（图8）。
    注：相变曲线通常呈S形轨迹，可采用S形Boltzmann模型进行拟合，该模型提供一组合适的拟合参数：
    热变性分析中的S形方程；蛋白质稳定性研究的科学公式。
    y：均一相/相分离GUV的比例
    A1：初始比例值
    A2：最终比例值
    T：温度
    Tmix：y达到半最大值时的温度
    由于y表示均一相GUV的比例，A1和A2应分别固定为0和1。假设混溶性转变呈S形，一旦在某一温度下测得比例值为0，则该温度以下所有温度点的比例值均视为0；反之，一旦在某一温度下比例值为1，则该温度以上所有温度点的比例值均视为1。

结果

GUV 肿胀

采用此处所述的自发溶胀法，在210 mM蔗糖或100 mM NaCl、10 mM Tris（pH 7.5）溶液中过夜培养由DOPG、eSM和Chol组成的GUVs，形成可见的聚集体。收集该聚集体可确保获得较高的囊泡产率。将聚集体重悬于溶胀溶液中，可实现跨膜两侧对称的溶液环境。为构建不对称环境，分别将聚集体重悬于等渗蔗糖溶液或高盐溶液中（图2）。该过程引起的稀释相当于准外部溶液交换，同时最大程度减少了GUVs数量的稀释。

利用荧光显微镜绘制GUVs的相图

在GUVs中加入0.1 mol%的相特异性染料DiIC18，可通过宽场荧光显微镜观察其相态。使用63x/1.2NA物镜观察表现出S+L相分离的囊泡，能够分辨出精细的指状结构域。其余所有情况均使用40x/0.6 NA物镜。为避免在GUVs目视检查过程中产生伪影，并最大限度提高可重复性，在相态分析中设定了某些标准，以确定应纳入分析的囊泡（实验步骤3.6）。

在室温下，将由不同比例的DOPG/eSM/Chol三元混合物制备的GUVs在蔗糖或高盐溶液中溶胀后观察，可观察到均一的Lo相或Ld相、Lo+Ld相分离以及S+L相分离，见图3。 图9展示了存在缺陷的囊泡示例，此类囊泡不应纳入数据分析，同时展示了如何识别多层囊泡。

由于其未知的历史背景，GUVs 可能表现出批次内的组成差异35。因此，特定组成的总体相态通过统计学方法确定。对于某一特定脂质组成的 GUV 群体，将其归类为在随机样本中观察到的主导相态（方案步骤 3.6）。然而，接近 Lo+Ld 共存区域的组成常导致批次中主导相态仅占微弱多数。对于此类模糊情况，需至少对三个独立样本重复进行目视检查。在随机样本中具有相同相态（例如 显示 Lo+Ld 相分离）的囊泡比例在多次试验中取平均值，并作为最终结果（图 10）。

所述方案在高盐和蔗糖溶液中，于DOPG、eSM和Chol的不同比例范围内均实现了足够的GUV生长。在对称和非对称的高盐溶液条件下，均可绘制出三元相图中的广泛区域（图11）。不同溶液条件下观察到的囊泡相行为差异已在其他文献中详细讨论9。

使用微流控方法完成缓冲液置换后的相行为观察

通过稀释建立不对称溶液条件，导致膨胀溶液的残余物留在外部。我们的微流控方法可实现完全的外部溶液置换。图5A 显示了微流控装置完全组装在共聚焦显微镜载物台上，同时连接流体出口和压力控制入口。通过90°金属管连接管路，以便从上方进行透射光成像时留出空间。

在微流控装置内进行观察时，使用配备63x/1.2NA水浸物镜的共聚焦显微镜。与之前的体相观察一样，采用DiIC18对膜进行染色。在观察装置中被捕获的GUVs相态时，必须注意避免对数据产生误判。由于GUVs靠近微柱，激发光和发射光路径可能部分被PDMS遮挡，从而导致出现假性结构域（图12）。此时，透射光检测有助于确认GUVs在微柱上的位置。这种不良效应在直径小于10 µm的小型GUVs中尤为明显，在这些情况下，相关数据被舍弃。共聚焦图像（图13A）显示了一个穿过GUV囊泡上Lo相结构域的平面截面。在此情况下，若对该截面上方或下方进一步进行平面扫描，则由于该结构域尺寸相对于GUV较小而无法观察到，因此可能遗漏该结构域，导致误判囊泡处于均一相态。因此，应使用共聚焦z轴层扫技术对整个GUV表面进行全面检查。而对于宽场显微镜而言，此问题可能并不显著，因为可一次性成像整个囊泡。

最后，给出了大单层囊泡（GUV）在交换外层溶液前后膜相态清晰可见的示例（图14）。每个装置包含60个腔室（每个腔室有一对用于捕获单个GUV的柱状结构），允许每个装置进行数十次实验（见图4）。然而，在外层溶液交换过程中可能会丢失部分GUV。可通过以下步骤将损失降至最低：1）使用牛血清白蛋白（BSA）包被，防止GUV在柱状结构处发生黏附或破裂；包被方法是将腔室壁暴露于20 mg/mL BSA溶液中60分钟，随后用工作缓冲液冲洗。另一种可使用的黏附分子是聚（L-赖氨酸）-接枝-聚（乙二醇）39。2）仔细匹配内、外溶液的渗透压，以避免GUV变得松弛（可能穿过柱中心）或发生破裂。3）优化GUV制备流程，获得直径大于约8 µm的囊泡，以防止其穿过柱中心。

用于观察GUV相态的温控腔室的设计与表征

我们设计了一个简单的流动腔室，其特点为可连接外部水浴恒温器（图6）。该腔室通过铣削铝块制得。通常情况下，腔室材料无需具备良好的导热性，因为样品是通过下层盖玻片与水浴相连，如图6B和6C所示。

无论具体设计如何，都应对腔室的性能进行评估。具体而言，我们检查了样品温度与外部设定温度之间的线性关系、是否存在系统性温度偏差，以及腔室内是否存在温度梯度。前两点通过光纤温度探针在腔室内直接测量温度来解决（例如 FISO FTI-10）。我们还检测了GUV悬浮液内部是否存在温度梯度。这种梯度可能源于热量向腔室外侧的传递。通过温度敏感型荧光染料可实现空间分辨的温度测量40，参见 图7.

绘制数据并进行拟合，以获得相分离 GUVs 的 Tmix

在观察的温度范围内绘制均匀GUVs的比例，得到呈S形曲线的数据点轨迹。我们将数据拟合到Boltzmann模型（方案部分6.8），由此获得 T混合 可以推断出 (图8).

脂双层形成；示意图；聚四氟乙烯板；溶剂干燥；水饱和气氛；溶胀
图1：自发溶胀法实验步骤（上图）及其对应的囊泡生长阶段（下图）。（A）将均匀的脂质膜涂布于表面粗糙化的聚四氟乙烯（PTFE）板上，并彻底干燥以去除所有溶剂。（B）将干燥后的脂质膜置于密闭容器内水饱和气氛中进行预溶胀，以促进脂双层的水合作用；空的玻璃小瓶用于盛放PTFE板，在此水合过程中保持敞口。（C）通过向玻璃小瓶内的脂质涂覆PTFE板上添加所需的溶胀溶液，使预溶胀的脂质膜最终完全水合。为防止蒸发，玻璃小瓶在过夜孵育期间需密封良好。为尽量减少同一批次内组分差异，所有操作步骤均需在脂质混合物完全互溶的温度下进行。请点击此处查看该图的放大版本。

使用盐溶液纯化GUVs的方法；带有移液器和烧杯的实验装置；示意图。
图2：GUVs的收集。 （A）将摩尔比为20/60/20的DOPG/eSM/Chol脂质膜沉积，并添加0.1 mol% DiIC18，在高盐缓冲液（含100 mM NaCl、10 mM Tris，pH 7.5）中溶胀。玻璃容器的盖子 дополнительно用石蜡膜密封。放大显示的感兴趣区域包含形成的GUV聚集体，其呈红色是由于DiIC18的存在所致。（B）使用截短的移液器吸头收集GUVs。在本图中，将聚集体连同50 µL溶胀液一起吸取，并转移至一个新的样品管中。（C）为了形成跨膜不对称的溶液条件，将聚集体稀释至另一种等渗的外部溶液中。此处，将聚集体连同50 µL溶胀液重悬于950 µL蔗糖溶液中，使溶胀液被稀释20倍。请点击此处查看该图的放大版本。

脂质相分离显微图像；盐/蔗糖缓冲液对脂质结构域的影响，显微研究。
图3：GUV成像。 在对称的盐溶液或蔗糖溶液中制备并观察的GUV的宽场荧光图像，GUV中掺入了0.1 mol% DiIC18，脂质成分为不同比例的DOPG、eSM和Chol（盐缓冲液中从左到右：40/20/40；50/20/30；30/60/10；蔗糖溶液中从左到右：30/30/40；20/60/20；40/50/10）。图像展示了根据实验步骤3.6中的标准评估出的不同（共存）相态的GUV。此处通过40X/0.6 NA物镜对囊泡进行成像。比例尺 = 5 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

微流控装置示意图；流体控制；生物分子分析装置；入口-出口通道。
图4：微流控通道设计布局。 巨型囊泡（GUVs）通过储液池下方的入口进入下层流体层（标出的通道）。一个滤膜可阻止不需要的碎片进入装置。随后，GUVs进入一个由60个腔室（8行15列）组成的阵列，每个腔室均含有用于单个GUV捕获的柱状结构（见插图）。每个腔室均可通过流体层上方的控制层（黑色实心通道）中的环形阀进行独立隔离。请点击此处查看此图的放大版本。

微流控装置示意图：用于实验中精确液体操作的流控系统。
图5：微流控装置。（A）用于捕获单个大单层囊泡（GUV）并完全置换外部溶液的微流控装置照片。标签指示用于添加溶液的储液池（1）、连接至压力控制单元的8个压力入口（2）以及连接至注射器和泵的流体出口（3）。图（B）显示了压力控制单元，其包含8个阀门，每个阀门控制一条连接至微流控装置的管路。此处阀门#1和#2处于打开状态，因此相应的环形阀门处于关闭状态。请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜装置、温控流动池、光学检测、流体动力学。
图6：温度控制腔室。（A）组装前的腔室。（B）已组装的腔室（朝上放置），顶部和底部粘有2 mm的盖玻片。橙色橡胶垫片高度为0.5 mm，观察面用0.17 mm的盖玻片密封，用于观察封闭的GUV悬浮液。图中右侧插入了温度探头用于校准（棕色光纤从腔室右侧引出）。（C）安装在倒置显微镜载物台上的最终组装结构（未含温度探头），此时橙色橡胶垫片朝下。橡胶具有足够黏性以固定样品。请注意，光线可穿透样品，从而实现落射荧光和明场观察。请点击此处查看该图的放大版本。

温度与距离关系图，显示盖玻片上的热梯度及数据点与分析结果
图 7：通过温度敏感染料的荧光寿命成像测量（FLIM）获得的观察室内空间分辨温度数据（此处使用 500 µM 罗丹明 B）40。数据点分别在底部盖玻片上方 0、10、30、300 和 400 µm 处获取。红色和蓝色数据点分别对应水浴温度设定为 30 °C 和 12 °C 时的测量结果。黑色数据点表示水浴在室温下自然平衡后的测量结果。在整个腔室内观察到较小的温度波动，但均低于 0.5 °C（灰色条带）。根据间隔层厚度，腔室总高度约为 500 µm（见上文）。误差棒表示标准偏差。请点击此处查看此图的放大版本。

静态平衡；曲线图；温度与均匀 GUVs 比例的关系；科学数据分析；Tmix 18.7°C
图 8：确定混溶温度。 该图显示了由 DOPG/eSM/Chol 以 30/40/30 比例制备并掺杂 0.1 mol% DiIC18 的 GUVs 在均相（单液相）状态下，三个独立随机样本（N = 20 - 40）的单个数据点。误差棒表示均值的标准误。数据点拟合至第 6.8 步中描述的玻尔兹曼模型（黑色实线），从中根据 S 形曲线在纵轴上的半最大值（黑色虚线）推导出相混合温度 Tmix（沿红色实线至横轴）。初始值和最终值（A1 和 A2）分别固定为 0 和 1。请点击此处查看该图的放大版本。

层状囊泡显微镜图像；缺陷囊泡结构；荧光图像；科学分析。
图9：结构缺陷的囊泡。 通过宽场荧光显微镜观察由20/60/20 DOPG/eSM/Chol制备并掺杂0.1 mol% DiIC18的巨型囊泡示例，这些囊泡不符合步骤4.2中设定的标准。每张图像的荧光强度显示范围均针对所显示囊泡的荧光强度进行了优化。由于存在额外的膜材料以及被包裹的小型囊泡，图（A）中囊泡的相态无法明确界定。该巨型囊泡的外观使其无法对层状结构进行任何可靠的视觉判断。图（B）显示的囊泡内部充满了膜物质，导致外层囊泡膜的荧光信号与内部信号重叠，从而无法实现对层状结构及潜在相区的可视化。图（C）在同一强度显示范围内直接比较了三个不同巨型囊泡的荧光强度。该图像表明，与单层巨型囊泡（GUV，3号）相比，多层巨型囊泡（1号和2号）因其更高的荧光信号而可被识别。在此，多层和单层巨型囊泡均表现出Lo与Ld相分离。所有图像均使用40x/0.6 NA物镜拍摄。比例尺 = 5 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。

相分离组成分析；柱状图；比较蔗糖与盐条件。
图10：至少三个独立样本的Lo+Ld相分离GUVs比例的平均值。囊泡组成为接近Lo+Ld共存区边界的30/40/30 DOPG/eSM/Chol。对称蔗糖条件下的误差棒表示批次间的离散性。纵坐标标签描述囊泡内/外的溶液；蔗糖：210 mM 蔗糖；盐：100 mM NaCl、10 mM Tris，pH 7.5；误差棒表示标准差。请点击此处查看此图的放大版本。

脂质混合物的三元相图；稀释法；蔗糖和盐分布；示意图。
图11：在不同溶液条件下，由DOPG、eSM和Chol制备的GUV的相图，使用210 mM蔗糖（蔗糖）和100 mM NaCl、10 mM Tris、pH 7.5（盐）进行映射。 GUV的相态在蔗糖/蔗糖（A；上部区域）、蔗糖/盐（内外）（A；下部多边形区域）、盐/盐（B；上部区域）以及盐/蔗糖（B；下部多边形区域）条件下进行研究。示意图展示了高亮区域内的主要结构模式及相应的溶液条件。下部多边形区域所示的囊泡相态是在不对称溶液条件下，经20倍稀释GUV后观察到的。改编自参考文献9。 请点击此处查看该图的放大版本。

波的干涉图样，圆形结构示意图；关于波动动力学、衍射分析的研究。
图12：被捕获GUV中的伪影。 一个小型GUV的示例，由于与柱状结构（posts）距离较近，出现假性相分离结构（DOPG/eSM/Chol 60/20/20）。明场透射光图像显示了柱状结构（灰色），并叠加了GUV的共聚焦荧光图像（橙色）。可见柱状结构在明场图像中产生干涉图样。靠近柱状结构的荧光信号（右侧）减弱，从而呈现出相分离的假象。比例尺 = 5 µm。

环状结构的显微图像、荧光检测、科学分析、实验结果
图13：由PDMS微柱捕获的两种不同GUV的示例，其相态清晰可见。（A）由DOPG/eSM/Chol 60/20/20组成的Lo + Ld相分离囊泡。（B）由40/30/30组成的囊泡，呈现Ld或Lo单相。通过共聚焦z-stack扫描整个囊泡，确认不存在（失焦的）结构域。图像右侧可见微柱边缘（灰色）。比例尺 = 5 µm。

显示处理前后荧光环形成的显微镜图像；实验结果。
图14：使用微流控装置进行完整流体交换后的相行为结果。 同一个GUV在溶液交换前和交换后的情况分别显示于（A）对称盐/盐（内/外）转变为盐/蔗糖（内/外）（DOPG/eSM/Chol 60/20/20，比例尺为2 µm）和（B）对称蔗糖/蔗糖（内/外）转变为蔗糖/盐（内/外）（DOPG/eSM/Chol 30/40/30，比例尺 = 3 µm）。改编自参考文献9。

讨论

在对称和非对称高盐条件下成功制备用于相态观察的GUVs

本文介绍的方案提出了一种策略，用于评估高盐缓冲液和溶液不对称性在广泛组分范围内对带电GUVs膜相态的影响。实现这一目标的主要挑战之一是在高盐缓冲液中制备带电GUVs。

我们通过一种简单的自发溶胀法，在蔗糖溶液和高盐缓冲液中成功制备了大单层囊泡（GUVs），该方法包括脂质膜的预水合步骤以及过夜的最终水合生长步骤。需要注意的是，脂质沉积应于经粗糙化处理的聚四氟乙烯（PTFE）板上进行，以确保脂质均匀铺展，从而形成单层囊泡。此外，囊泡制备过程中的每一步操作都必须在脂质膜处于均一且流动相态的温度下进行；否则，囊泡群体可能在组成上呈现多分散性，进而影响最终群体相态分析的准确性。该自发溶胀法的具体方案所获得的囊泡呈团块状，一方面可将其重悬于小体积溶液中以获得高浓度的囊泡分散液，另一方面可在膜两侧形成不对称的溶液环境，同时最大限度减少囊泡的稀释8,28。在进行囊泡稀释或外部溶液置换时，必须确保内外渗透压保持一致，因为渗透压失衡所引起的形态变化可能诱导或抑制Lo与Ld相的分离41，或在低渗条件下导致囊泡破裂。

在此，尝试在高盐溶液中优化电形成方案未能生成任何GUVs，而采用PVA辅助溶胀法则产生了多层囊泡。尽管自发溶胀法制备带电囊泡所需时间较长，且所得囊泡批次质量较低10,17，但其成功制备仍具额外优势。该方法操作简便，即可获得足够用于统计批次分析的产量；与电形成法不同，无需复杂设备或优化过程。此外，未观察到脂质氧化污染现象42,43。根据文献报道，囊泡与其来源脂质储备液之间的脂质组成无差异7,17。此外，在PTFE基底上形成囊泡不会引入任何污染物，而凝胶辅助溶胀法可能因基底引入外来分子23。电形成法还存在其他缺陷，例如在建立不对称溶液条件时会导致囊泡过度稀释。通过电形成法制备的GUVs通常呈均匀分散状态（与自发溶胀过程中形成的高浓度团状囊泡悬浮液相反）。对外部溶液的任何稀释均会显著降低囊泡数量。此外，在本研究过程中观察到，通过电形成法在蔗糖溶液中制备的DOPG/eSM/Chol GUVs，若稀释于高盐缓冲液中则变得不稳定。显微镜载玻片上脂质斑块的荧光表明，囊泡在被观察前即已破裂。此类不稳定性可归因于电形成法制备的囊泡膜张力高于自发溶胀法制得的囊泡10。

尽管通过囊泡稀释来创建不对称的大单层囊泡（GUV）溶液条件是一种简便快速的方法，但该方法仅能实现部分外部溶液的置换，尽管置换比例较高（此处为95%，图2），因为在稀释过程中，仍会残留少量溶胀溶液。外部溶液置换程度的选择需在以下两者之间权衡：一是将囊泡团块连同溶胀溶液一并吸起（第2节），二是避免过度稀释。因此，我们引入了一种替代性的微流控方法，该方法在其他地方已有详细讨论37，可在观察GUV相态时实现快速且完全的外部溶液置换，以验证在稀释囊泡中所获得的相态观察结果。实验确实观察到，从对称到不对称溶液条件转变时的相态变化结果一致。此外，本文所示的两种生成不对称溶液条件的方法均同样快速（参见文献8），且均无已知的局部组成改变风险（参见文献30,31）、膜张力升高风险（参见文献32）或局部加热风险（参见文献33），而这些风险存在于引言中讨论的其他替代方法。在微流控捕获过程中，囊泡内外的渗透平衡不仅对于避免上述相态伪影至关重要，而且由高渗溶液条件引起的脱水可能导致囊泡在外部溶液置换后从捕获柱间滑脱。

尽管自发溶胀法已成功用于从DOPC/eSM/Chol体系生长出不带电荷的囊泡，但在其他情况下，由于缺乏各双分子层之间的排斥作用，无电荷可能导致GUV溶胀效果不佳44。延长预溶胀时间或引入体积较大的脂质头基可能有助于缓解这一问题45。此外，囊泡在不同于溶胀所用溶液的介质中稀释后的稳定性，可能因脂质组成和稀释介质的不同而有所差异，这一点我们尚未研究。我们亦未探索通过本研究中所介绍的制备方法调节GUV平均直径的可能性。但囊泡组成和溶胀溶液等参数可能会影响实验结果。采用其他替代方法46可能在本研究使用的脂质和溶液条件下产生更大的囊泡，但这些方法可能伴随其他与技术本身相关的问题。上述在对称和非对称高盐条件下制备GUV的方法，为研究由不同脂质组成构成并分散于不同介质中的囊泡提供了潜在工具。由于我们尚未探索这些可能性，未来实验将揭示该GUV制备与稀释方法的普适性程度。

在不同温度下观察相分离现象

存在多种适用于在不同温度下研究GUV的实验装置。尽管这些装置在文献中通常未被详细描述，但本研究介绍了一种适用于此类研究的基础组装方案。

对照测量结果表明，该自行设计和搭建的腔室温度由恒温器精确控制，腔室内部的温度梯度在实验温度分辨率范围内。这确保了实验热条件与恒温器读数一致。

在对 GUV 相态进行宽温度范围评估时，重要的是在温度改变后，所观察的囊泡应达到充分的平衡状态。确保这一点的一种可行方法是检测滞后现象。如果存在滞后现象，应减小温度变化步长和/或延长平衡时间。由于本研究中的温度控制是通过水浴恒温系统实现的，因此工作温度范围理想情况下应限制在 0 - 100 °C该范围可通过使用其他温控液体（如油）或采用其他装置进一步扩展， 例如 一个帕尔帖装置。实际上，工作温度还受限于可能发生的冷凝或蒸发现象。此外，当温度远离室温时，观测腔内出现稳定的温度梯度的可能性增加。同时，成像设备在极端温度下可能受到损害。对于脂质囊泡研究通常适用的温度范围（~10 - 50 °C7,9) 应考虑对观测设备造成损坏的可能性，但通常情况下并不预期会发生。

囊泡结构域观察中的伪影

使用宽场荧光显微镜时，存在多种可能导致观察伪影的来源。首先，应认识到用于囊泡相态目视检测的物体其最大分辨率 r 决定了脂质结构域的检测极限，其关系如下：
分辨率极限公式：r=0.61λ/NA，用于显微镜中确定光学分辨能力。
其中 λ 为发射波长，NA 为物镜的数值孔径。一个典型的 40 倍放大、NA 为 0.6 的物镜，在检测波长约为 560 nm 的绿色发射光时，其光学分辨率约为 0.6 µm。因此，在不同条件下比较由特定脂质混合物制备的囊泡相态的研究中，应针对同一种脂质混合物使用相同的物镜。

另一种伪影是由于长时间暴露于激发光下导致脂质发生光氧化，从而形成脂质区域41。光损伤优先发生在不饱和的脂质烃链部分。事实上，对于某些脂质组成，在长时间激发光照射后（约30秒），原本均一的囊泡中出现了相分离区域。为避免这一问题，在评估相态时，激发光仅在同一视野内聚焦数秒。因此，DiIC18适用于本研究目的。然而，其他染料可能对光更为敏感，需在更低的激发光强度下操作，并缩短激发光照射时间。

移液器转移囊泡时产生的机械剪切应力可能会暂时混合相区，从而扭曲囊泡相行为的真实表观。在某些批次中，不同囊泡在移液转移至显微镜盖玻片后0分钟和5分钟时表现出不同的相行为。此外，微流控装置中流体流动所诱导的剪切应力也已被证明会导致相区混合47。在观察前，应让囊泡保持静置足够长的时间以达到平衡状态。在本研究中，囊泡加载并完成溶液置换后，微流控装置上被捕获的囊泡在观察前保持静置1小时。

为避免上述部分困难以及光衍射极限所带来的限制，可采用核磁共振波谱法48或超分辨率显微成像技术49等替代方法。

结论与展望

本研究展示了一系列方法，可用于分析高盐对称与不对称溶液条件对膜相分离的影响。所有所述方法均适用于其他应用场景。例如，微流控装置提供了一个平台，可用于研究在诱导溶液不对称性后，相区形成与消失的动力学过程。此外，也可通过该方法考察相区出现与盐浓度之间的关系。所有这些方法还可用于研究其他感兴趣溶液对相行为的影响。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作属于 MaxSynBio 联盟的一部分，该联盟由德国联邦教育与研究部和马克斯·普朗克学会共同资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油)，钠盐Avanti Polar Lipids840475C文中简称为 DOPG
鸡卵鞘磷脂Avanti Polar Lipids860061简称为 eSM
胆固醇（绵羊毛，> 98%）Avanti Polar Lipids700000简称为 Chol
1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐Molecular ProbesD-282简称为 DiIC18
氯仿，HPLC 级（≥ 99.8%）Merck
NaCl（> 99.8%）Roth
HCl（37%）Roth
Tris（≥ 99.9%）Roth
蔗糖（≥ 99.5%）Sigma Aldrich
Parafilm
螺纹瓶，45×27 mm，15 mLKimble平底苏打玻璃瓶，白色螺旋盖
pH 计Mettler ToledoMP220
渗透压仪GonotecOsmomat030
落射荧光显微镜ZeissAxio Observer D1
共聚焦激光扫描显微镜LeicaTCS SP5
40倍物镜，0.6 数值孔径ZeissLD Achroplan
40倍物镜，0.75 数值孔径Leica506174
63倍物镜，0.9 数值孔径Leica506148
显微镜载玻片，56×26 mm，0.17 ± 0.01 mmMenzel-Gläser
盖玻片，22×22 mm，0.17 ± 0.01 mmMenzel-Gläser
Parafilm "M"Bremix Flexible Packaging
注射器，5 mL，10 mLBraun
0.45 µm 注射器滤器GVS North AmericaCameo 25AS, 1213723醋酸纤维，无菌

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