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方法文章

使用 在体 内 研究胚胎期和围产期主动脉形态发生与发病机制的组织与细胞外植体方法

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DOI：

10.3791/56039

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2017年9月12日

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1Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 2Department of Neurology, Yale University School of Medicine, 3Department of Neurology, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

本文内容

摘要

利用小鼠胚胎期及围产期主动脉进行研究的实验方案 体内 克隆分析与命运图谱、主动脉外植体以及分离的平滑肌细胞在本文中被详细描述。这些不同的方法有助于研究胚胎期和围产期主动脉在正常发育过程中的形态发生，以及疾病状态下的发病机制。

摘要

主动脉是人体最大的动脉。主动脉壁由内层的内皮细胞、中层交替排列的弹性膜层和血管平滑肌细胞（SMCs），以及外层的成纤维细胞和细胞外基质构成。与广泛研究的病理模型相比例如， 动脉粥样硬化）在成人主动脉中的研究已较为深入，但关于胚胎期和围产期主动脉的研究则相对较少。本文聚焦于平滑肌细胞（SMCs），提供了在正常发育及疾病状态下分析胚胎期和围产期主动脉SMCs形态发生与病理发生过程的实验方案。具体包括以下四个方案：i） 体内 胚胎命运图谱绘制与克隆分析；ii）胚胎主动脉外植体培养；iii）围产期主动脉平滑肌细胞的分离；以及iv）在妊娠（或非妊娠）小鼠中皮下植入渗透压微型泵。因此，这些方法有助于研究主动脉中平滑肌细胞的来源、命运及其克隆结构 体内它们能够调节胚胎主动脉的形态发生 在子宫内 通过持续暴露于药理学试剂来进行研究。此外，可利用分离的主动脉组织外植体或主动脉平滑肌细胞（SMCs），以深入了解特定基因靶点在肌化、增殖和迁移等基本过程中的作用。这些针对分离的SMCs和主动脉外植体开展的假设生成实验，可进一步在体内模型中进行验证。 体内 通过药理学和遗传学方法阐明其背景机制。

引言

多细胞生物的循环系统负责向未与外界环境直接接触的细胞输送营养物质和氧气，并从这些细胞中清除代谢废物和二氧化碳。在脊椎动物中，主要的循环系统由心脏构成，心脏通过一系列血管泵送血液。大血管（如动脉和静脉）的管壁由三层结构组成：i）内膜，即内层的内皮细胞层；ii）中膜，即中层，由环向排列的平滑肌细胞（SMCs）和弹性板层交替构成；iii）外膜，即外层，由结缔组织和成纤维细胞组成。血管生物学领域的绝大多数研究集中于内皮细胞，重点探讨通过血管生成形成新的内皮细胞衬里的管道过程。相比之下，对平滑肌细胞（SMCs）的关注相对较少。然而，平滑肌细胞是构建正常动脉壁以及参与血管病理过程的关键细胞类型。

主动脉是人体内管径最大的动脉，接收来自心脏左心室的血液输出。主动脉会受到多种人类疾病的影响，包括动脉粥样硬化、动脉瘤和主动脉夹层。在成年生物体中，主动脉及其主要分支在血管疾病模型中被广泛研究。例如，缺乏编码低密度脂蛋白受体或载脂蛋白E基因的小鼠在高脂饮食喂养下会发展出动脉粥样硬化，而近期的谱系追踪研究表明，已存在的平滑肌细胞（SMCs）可衍生为动脉粥样硬化斑块中的多种细胞类型1。在主动脉瘤中，病理变化包括平滑肌细胞凋亡和细胞外基质重塑2,3。

关于胚胎期和围产期平滑肌细胞的形态发生及发病机制，目前所知甚少。本文提供了研究胚胎期和围产期主动脉平滑肌细胞的实验方案 体内在组织外植体和分离细胞中。例如，本方案的第一部分阐述了在胚胎小鼠中进行命运图谱绘制和克隆分析。在细胞特异性启动子调控下表达的Cre重组酶可实现对特定细胞及其子代细胞的标记4,5,6；然而，在小鼠胚胎发育过程中，实现细胞特异性标记的时间控制具有挑战性。在此背景下，利用在平滑肌细胞（SMCs）中特异性启动子驱动下表达条件性 CreER 的胚胎（例如，Myh11 或 Acta2）以及一种Cre报告基因，我们提供了向妊娠母鼠注射他莫昔芬或其活性代谢产物4-OH-他莫昔芬的方法，并介绍了在胚胎或出生后子代中分析标记细胞的技术。此外，与主要使用单一荧光报告蛋白的细胞命运图谱研究相比1,7，使用多色Cre报告系统可显著增强克隆分析。

方案的第二和第三部分分别描述了分离和培养胚胎期主动脉外植体以及新生小鼠主动脉平滑肌细胞（SMCs）的方法。这些方法可针对主动脉外植体或平滑肌细胞中的信号通路进行调控，并用于分析药理学试剂的直接作用效果。因此，相较于传统的小鼠遗传操作，该方法能够更快速地筛选特定基因在目标组织中的功能。此外，分离后的平滑肌细胞研究有助于分析细胞迁移与黏附行为，而这些实验在技术上具有一定的局限性 体内.

最后，第四部分实验方案详细说明了在妊娠（或非妊娠）小鼠体内植入装载药理学试剂的皮下渗透性微型泵的方法。该方法有助于分析因药物代谢迅速而需要持续输注的试剂对胚胎发育造成的影响。频繁注射是另一种替代方式，但对许多试剂而言并不实用，且应尽量避免，因为它可能给妊娠母鼠带来显著不适。

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方案

所有小鼠实验方案均经耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 在体 内 胚胎命运图谱绘制与克隆分析

注意：我们已广泛使用这些方法来评估发育和疾病模型中细胞的起源及其克隆结构7,8,9,10。

  1. 在携带 CreER 的小鼠与携带 Cre 报告基因的小鼠之间建立交配。
    注意：使用 CreER 标记平滑肌细胞；Myh11-CreERT2 或 Acta2-CreERT2 小鼠11,12 常用于此目的。我们使用了ROSA26R-CreERT2小鼠13 用于广泛标记胚胎组织。
    1. 用于克隆分析时，使用多色Cre报告基因系统（例如， 彩虹（Rainbow [Rb]）小鼠8,14,15 用于命运图谱分析时，使用单色Cre报告基因（例如， ROSA26R-YFP 小鼠16或双色Cre报告基因ROSA26R-mTomato-mGFP（mTmG）17.
      注意：本繁育方案使用 2 - 6 个月龄的成年小鼠（通常约 30 g），可获得携带 CreER 和 Cre 报告基因的胚胎。
  2. 使用金属探针于早晨检查阴道栓，以检测到阴道栓的当天中午定为胚胎发育第 (E) 0.5 天。
  3. 当检测到阴栓时，将雌性与雄性分开。
  4. 配制4-羟基他莫昔芬和他莫昔芬工作液。
    1. 对于4-羟基他莫昔芬，将5 mg溶于50 µL 100%乙醇中，涡旋2分钟，然后加入450 µL玉米油。置于冰上，以输出功率2进行超声处理，每次10秒，循环间歇冷却，直至样品冷却。待样品完全溶解后（通常需超声4–5个循环），取200 µL超声处理后的溶液溶于1,800 µL玉米油中，配制成终工作液（4-羟基他莫昔芬，1 mg/mL）。
    2. 对于他莫昔芬，用100%乙醇稀释至50 mg/mL，涡旋至完全溶解。再用玉米油稀释，配制成终工作液（他莫昔芬，10 mg/mL），于45 °C搅拌以确保完全溶解。
  5. 对于早期胚胎诱导，将4-OH-三苯氧胺经腹腔注射至妊娠母鼠体内。
    1. 在E5.5及之后使用4-OH-他莫昔芬注射（每只妊娠小鼠最多约150 µg，或约5 mg/kg体重），可获得存活的母鼠、胚胎和仔鼠。
    2. 对妊娠约 E9 天及之后的胚胎母鼠，使用他莫昔芬，剂量为 0.5 - 1.5 mg（或 17 - 50 mg/kg）。所有注射均使用 30G 针头。
       注意：通常在注射前通过 0.22 µm 滤膜过滤以对所有混合物进行灭菌。  
  6. 用于克隆分析时，采用腹腔注射高剂量4-OH-三苯氧胺例如，5 mg/kg）或他莫昔芬（例如，50 mg/kg）以标记多种细胞。
    1. 为了标记单个细胞，需梯度降低4-OH-他莫昔芬或他莫昔芬的剂量，使其在目标组织中（即， 主动脉），几乎所有经分析的胚胎（如下所述，本节末尾）均未标记细胞或仅标记单一颜色的细胞；此为阈值剂量。
  7. 为了标记中期至晚期妊娠阶段的细胞，并追踪其在出生后小鼠中的命运或克隆性，可将孕酮与他莫昔芬按1:2（孕酮：他莫昔芬）的剂量比例同时注射至妊娠母鼠的腹腔内。
    注意：他莫昔芬剂量为 17 - 50 mg/kg，孕酮剂量为 8.5 - 25 mg/kg（即，一半的他莫昔芬剂量）。黄体酮注射可使分娩延迟约1-2天。
  8. 采用开放滴注法处死怀有目标日龄胚胎的母鼠，即将母鼠置于含有浸透未稀释异氟烷的棉球或纱布的容器中。通过打开胸腔诱发气胸、摘除重要器官 和/或颈椎脱位来确认死亡。
  9. 用70%乙醇清洁腹部。使用剪刀切开腹部并取出子宫。从子宫中取出胚胎，并用镊子小心地将胚胎与胎盘和卵黄囊分离。
  10. 在E15或更晚阶段通过颈椎脱位或使用手术剪刀或锋利刀片进行断头处死胚胎。
    注意：胎龄小于E15的胚胎在母体安乐死后和/或从母体取出后会迅速死亡。
  11. 将胚胎置于冰上预冷的PBS中，用剪刀剪取少量尾尖组织，用于CreER和Cre报告基因的基因型鉴定。
  12. 在4 °C下用4%多聚甲醛固定胚胎2小时。用PBS洗涤胚胎三次，然后将胚胎置于15 mL离心管中，加入含30%蔗糖的PBS溶液进行孵育，直至胚胎沉底，此过程可能需要长达两天时间。
  13. 将塑料冷冻模具用最佳切割温度（OCT）包埋剂填充至最大容量的2/3。将每个胚胎垂直放入模具中，完全浸没于OCT包埋剂内。室温（RT）孵育10分钟，以尽量减少气泡产生。
  14. 将冷冻组织块直立置于干冰和70%乙醇混合液中速冻，随后于-80 °C保存。
  15. 将冷冻切片机温度设置为 -22 °C，对组织块进行切片，获得贯穿整个主动脉的横切面，厚度为 10–20 µm。切片在室温下干燥 30 分钟，然后于 -80 °C 保存。
  16. 室温避光解冻载玻片，以防止荧光染料淬灭。用含0.1%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤载玻片。
    1. 用于克隆分析时，用DAPI（5 mg/mL）对载玻片进行细胞核染色，并直接成像彩虹Cre报告系统中的其他荧光素（Cerulean：最大激发波长433 nm，最大发射波长475 nm；mOrange：548 nm，562 nm；mCherry：587 nm，610 nm）。
      1. 使用正置荧光显微镜检测荧光染料时，采用以下滤光片：DAPI（激发波长最大值/带宽 350/50 nm，发射波长最大值/带宽 460/50 nm）、Cerulean（激发 436/20 nm，发射 480/40 nm）、Texas Red（激发 560/40 nm，发射 630/75 nm），以及用于区分 mCherry 与 mOrange 的定制滤光片（激发 577/10 nm，发射 630/50 nm）。
    2. 使用mTmG Cre报告系统进行命运图谱分析时，通过直接成像或免疫染色检测GFP（484 nm，510 nm）。若使用正置荧光显微镜成像，请采用GFP滤光片（激发光470/40 nm，发射光525/50 nm）。
    3. 进行免疫染色时，将切片于4 °C与一抗孵育过夜，用含0.1% Triton X-100的PBS洗涤，随后与二抗孵育1小时。使用抗CD31抗体（终浓度0.0016 mg/mL）、抗GFP抗体（终浓度0.006 mg/mL）以及Cy3直接偶联的抗SMA抗体（终稀释度1:500）作为一抗，二抗选用直接偶联荧光染料的抗体（终稀释度1:500）（参见 材料表).
  17. 使用直立荧光显微镜（放大倍数：4X - 20X）或共聚焦显微镜（10X - 63X）拍摄图像。高倍放大时，采用63倍油镜共聚焦物镜，数值孔径为1.4-0.6，帧尺寸为1,024 x 1,024像素。

2. 外植胚胎主动脉培养

注意：该方法此前曾用于评估整合素 β3 在离体 Eln(-/-) 胚胎主动脉狭窄中的作用9,18。

  1. 按照上述步骤 1.8，通过过量吸入异氟烷处死 E15.5 的孕鼠。
  2. 按照上述步骤 1.9 - 1.10，取出并处死胚胎。
  3. 将胚胎仰卧位放置，并用大头针将伸展的四肢固定在解剖板上。在解剖体视显微镜下观察，使用剪刀从腹部经胸骨向上胸部做垂直切口。解剖去除胸腺、气管、肺、食管、肝脏和肠。
  4. 用镊子轻轻将心脏向前腹侧牵拉，使用剪刀从胸腔和腹腔背侧分离主动脉。为释放主动脉，分别在近端根部和远端腹部位置剪断。
  5. 将主动脉置于细胞培养超净台中预冷的无菌 PBS 中。将主动脉转移至 24 孔板，加入含 0.5% FBS 的 DMEM，在 37 °C 下培养最多 24 小时。
    注意：培养基中可添加阻断抗体（例如，抗整合素 αvβ3 抗体，0.02 mg/mL9；参见材料表）或药理学试剂。
  6. 用 PBS 清洗主动脉两次，然后用 4% 多聚甲醛固定 20 分钟。
  7. 用 PBS 洗涤三次，将主动脉转移至含有 PBS 中 30% 蔗糖的 1.5 mL 离心管中。待主动脉沉底后，制备冷冻组织块，切片并进行免疫染色，具体操作如上述步骤 1.13 - 1.15 所述。

3. 从围产期主动脉中分离 SMC

注意：该方法目前正用于比较从Eln(-/-)和野生型围产期小鼠中分离的主动脉平滑肌细胞的生物学特性。

  1. 在出生后第（P）0.5天处死一只小鼠幼崽，可通过颈椎脱位或使用手术剪或锋利刀片进行断头，具体操作如上文步骤1.10所述。
  2. 执行步骤2.3，然后打开胸腔和腹腔，用23G针头穿刺左心室。使用塑料管将针头连接至装有无菌PBS的注射器，注射器垂直置于较高位置，使PBS依靠重力流入左心室。持续灌注无菌PBS直至肝脏变苍白。
    1. 用镊子去除主动脉外膜组织，并按照步骤2.4所述方法解剖主动脉。
  3. 将主动脉置于含DMEM（500 µL）的单一消化液中，其中添加225 U/mL胶原酶、2.25 U/mL弹性蛋白酶和1×抗生素-抗真菌剂，在37 °C下消化45分钟。每5–10分钟手动振荡试管一次。
  4. 在无菌细胞培养操作台中，使用200 µL移液器反复吹打消化后的组织，制备单细胞悬液。将单细胞悬液转移至15 mL离心管中，加入2 mL DMEM，于25°C下以920 × g离心5分钟。
  5. 弃去上清液。将细胞沉淀重悬于3 mL平滑肌细胞（SMC）培养基中（DMEM含10% FBS，并补充1 µg/mL重组人FGF、10 µg/mL重组人EGF、100 U/mL青霉素/链霉素和2.5 µg/mL两性霉素B），转移至35 mm培养皿。
    注意：初次分离时，单根P0.5野生型主动脉可获得约400,000个细胞，其中约300,000个为SMC。
  6. 在37 °C条件下培养细胞，每3天更换一次新鲜SMC培养基。当细胞达到融合状态时，采用胰酶消化等标准技术进行传代。实验中使用第3至第7代的细胞。

4. 在妊娠（或非妊娠）小鼠中植入皮下渗透压微型泵

注意：该方法先前已被用于持续递送药理学试剂（例如， 整合素β3和β5抑制剂cilengitide处理胚胎 在子宫内9泵于E13.5植入妊娠母鼠体内，并维持至分娩。

  1. 使用氧气（流速为1 L/min）中2 - 5%的异氟烷进行诱导麻醉，维持麻醉时使用1 - 3%的异氟烷。通过脚趾夹捏反射监测麻醉深度，并根据需要调整麻醉剂用量。皮下注射布托啡诺（0.05 - 0.1 mg/kg）以提供镇痛。
  2. 使用电动剃毛器剃除小鼠下背部毛发。手术过程中使用无菌铺巾、手套和器械，并将小鼠置于加热手术板上以维持体温。
  3. 将每只小鼠置于俯卧位，用聚维酮碘擦拭背部，随后使用异丙醇脱碘。在尾根部上方下背部约3 - 5 cm处，使用手术刀做一长度为0.5 - 1.0 cm的横向皮肤切口，注意避免损伤下方肌肉组织。
  4. 将止血钳插入切口，通过开合钳头在头侧方向分离形成一个皮下囊袋，用于植入泵体。
  5. 根据制造商说明（见材料表），用所需试剂充满渗透压微型泵。将充满试剂的泵植入皮下囊袋中，并使用钉合器或6-0不可吸收缝线关闭切口。确保总手术时间少于10分钟。
  6. 术后每15分钟监测小鼠一次，直至其从胸卧位恢复。在术后48小时内，每6 - 12小时皮下注射布托啡诺（0.05 - 0.1 mg/kg）一次。当小鼠完全从全身麻醉中恢复后，改为每日观察。术后7 - 10天拆除钉合器或缝线。

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结果

在对平滑肌细胞进行代表性克隆分析时，所用胚胎为突变型 Eln （编码细胞外基质蛋白elastin的基因）， Eln(+/-)，Acta2-CreERT2 小鼠被交配以 Eln(+/-) 携带多色 ROSA26R 的小鼠(Rb/Rb) 报告基因。如步骤1所述，检查栓塞后，对妊娠母鼠在E12.5时通过单次注射他莫昔芬（1.5 mg）进行诱导，并于E18.5处死。收集胚胎，固定、冷冻并进行基因分型。制备降主动脉横断面冷冻切片。获取切片后 Eln(+/-)，Acta2-CreERT2, ROSA26R(Rb/+) 胚胎结果表明，积聚在内层的过量平滑肌细胞 Eln-null 小鼠（从 E15.5 开始）以多种颜色标记（图1）因此来源于多种α-平滑肌肌动蛋白（SMA）...

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讨论

与成年小鼠主动脉及其主要分支在动脉粥样硬化等病理条件下的广泛研究相比，关于胚胎期和围产期主动脉的形态发生及发病机制的研究仍较为有限。本文聚焦于胚胎期/围产期主动脉，特别是其中的平滑肌细胞（SMCs），并提供了一系列研究主动脉的实验方案 体内、组织外植块及SMC分离方法。这些互补的方法为研究者提供了多种途径来研究胚胎期/围产期主动脉。

克隆分析是一种非常强大的方法，可用于研究单个细胞的行为。我们最近利用该方法帮助鉴定了肺血管中特化的平滑肌细胞10。必须认识到，在携带多色Cre报告基因的小鼠个体中，相同颜色的细胞可能来源于多个独立的重组事件。因此，使用多色报告系统进行克隆分析时，必须对大量小鼠进行评估。由于在妊娠中晚期给予他莫昔芬可能干扰分娩过程，因此对于在妊娠中晚期标记细胞并进行出生后谱系示踪的实验，应同时注射孕酮和他莫昔芬。类似于胚胎实验方案，成年小鼠体内细胞的命运图谱绘制和克隆分析也可通过向成年小鼠腹腔注射他莫昔芬来实现。

平滑肌细胞的克隆分析与命运图谱研究利...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Dean Li分享其实验室关于主动脉平滑肌细胞分离的实验方案。本研究获得美国国立卫生研究院（R21NS088854、R01HL125815和R01HL133016，授予D.M.G.）、美国心脏协会（资助号14GRNT19990019，授予D.M.G.）以及耶鲁大学（A.M.获得Brown-Coxe博士后奖学金，D.M.G.获得启动资金）的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
他莫昔芬SigmaT5648
玉米油SigmaC-8267他莫昔芬的溶剂
4-羟基他莫昔芬SigmaH7904他莫昔芬的活性代谢产物
孕酮SigmaP8783-5G使用浓度为他莫昔芬的一半
OCT 包埋剂Sakura tissue tek4583用于制备冷冻切片块
冷冻模具Polysciences inc18986
DAPISigmaD9542细胞核免疫组化染色，终浓度为 5 mg/mL
直接偶联 Cy3 的抗-SMA 抗体SigmaA2547SMA 免疫组化染色，终稀释比例为 1:500
抗-CD31 抗体BD Pharmingen550274GFP 免疫组化染色，终浓度为 0.006 mg/mL
抗-GFP 抗体Thermo Fisher ScientificA-11121CD31 免疫组化染色，终浓度为 0.0016 mg/mL
二抗山羊抗兔，Alexa 647 标记Life Technologiesa21244免疫组化染色，终浓度为 0.004 mg/mL
二抗山羊抗兔，Alexa 488 标记Life Technologiesa11008免疫组化染色，终浓度为 0.004 mg/mL
DMEMThermo Fisher Scientific10567-014用于细胞培养
FBSThermo Fisher Scientific10437028
抗整合素 β3 封阻抗体BD Biosciences553343克隆号 2C9.G2，终浓度为 0.02 mg/mL
胶原酶Worthington Biochemical Corp44H14977A用于主动脉消化
弹性蛋白酶Worthington Biochemical Corp34K15139用于主动脉消化
抗生素-抗真菌剂（100 倍浓缩液）Thermo Fisher Scientific15240062
重组人 FGFPromegaG5071
重组人 EGFPromegaG5021
青霉素/链霉素（10,000 U/mL）Thermo Fisher Scientific15140122
两性霉素 BThermo Fisher Scientific15290026
组织培养板CorningCLS430165
Alzet 渗透压微型泵Durect Corporation2001
ECLIPSE 80i 直立荧光显微镜Nikon 
 TCS SP5Leica
Branson Sonifier 450VWR
Myh11-CreERT2 小鼠The Jackson Laboratory 19079
Acta2-CreERT2 小鼠由 Pierre Chambon 博士和 Daniel Metzger 实验室提供
ROSA26R-CreERT2 小鼠The Jackson Laboratory 8463
ROSA26R(mTmG/mTmG) 小鼠The Jackson Laboratory  026862
ROSA26R(EYFP/EYFP) 小鼠The Jackson Laboratory  006148 
ROSA26R(Confetti/Confetti) 小鼠The Jackson Laboratory 13731
ROSA26R(Rb/Rb) 小鼠Dr. Irv Weissman 实验室由 Dr. Irv Weissman 实验室提供

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