方法文章

使用 在体 内 研究胚胎期和围产期主动脉形态发生与发病机制的组织与细胞外植体方法

DOI：

10.3791/56039

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2017年9月12日

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1Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 2Department of Neurology, Yale University School of Medicine, 3Department of Neurology, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

本文内容

摘要

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利用小鼠胚胎期及围产期主动脉进行研究的实验方案 体内 克隆分析与命运图谱、主动脉外植体以及分离的平滑肌细胞在本文中被详细描述。这些不同的方法有助于研究胚胎期和围产期主动脉在正常发育过程中的形态发生，以及疾病状态下的发病机制。

摘要

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主动脉是人体最大的动脉。主动脉壁由内层的内皮细胞、中层交替排列的弹性膜层和血管平滑肌细胞（SMCs），以及外层的成纤维细胞和细胞外基质构成。与广泛研究的病理模型相比例如， 动脉粥样硬化）在成人主动脉中的研究已较为深入，但关于胚胎期和围产期主动脉的研究则相对较少。本文聚焦于平滑肌细胞（SMCs），提供了在正常发育及疾病状态下分析胚胎期和围产期主动脉SMCs形态发生与病理发生过程的实验方案。具体包括以下四个方案：i） 体内 胚胎命运图谱绘制与克隆分析；ii）胚胎主动脉外植体培养；iii）围产期主动脉平滑肌细胞的分离；以及iv）在妊娠（或非妊娠）小鼠中皮下植入渗透压微型泵。因此，这些方法有助于研究主动脉中平滑肌细胞的来源、命运及其克隆结构 体内它们能够调节胚胎主动脉的形态发生 在子宫内 通过持续暴露于药理学试剂来进行研究。此外，可利用分离的主动脉组织外植体或主动脉平滑肌细胞（SMCs），以深入了解特定基因靶点在肌化、增殖和迁移等基本过程中的作用。这些针对分离的SMCs和主动脉外植体开展的假设生成实验，可进一步在体内模型中进行验证。 体内 通过药理学和遗传学方法阐明其背景机制。

引言

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多细胞生物的循环系统负责向未与外界环境直接接触的细胞输送营养物质和氧气，并从这些细胞中清除代谢废物和二氧化碳。在脊椎动物中，主要的循环系统由心脏构成，心脏通过一系列血管泵送血液。大血管（如动脉和静脉）的管壁由三层结构组成：i）内膜，即内层的内皮细胞层；ii）中膜，即中层，由环向排列的平滑肌细胞（SMCs）和弹性板层交替构成；iii）外膜，即外层，由结缔组织和成纤维细胞组成。血管生物学领域的绝大多数研究集中于内皮细胞，重点探讨通过血管生成形成新的内皮细胞衬里的管道过程。相比之下，对平滑肌细胞（SMCs）的关注相对较少。然而，平滑肌细胞是构建正常动脉壁以及参与血管病理过程的关键细胞类型。

主动脉是人体内管径最大的动脉，接收来自心脏左心室的血液输出。主动脉会受到多种人类疾病的影响，包括动脉粥样硬化、动脉瘤和主动脉夹层。在成年生物体中，主动脉及其主要分支在血管疾病模型中被广泛研究。例如，缺乏编码低密度脂蛋白受体或载脂蛋白E基因的小鼠在高脂饮食喂养下会发展出动脉粥样硬化，而近期的谱系追踪研究表明，已存在的平滑肌细胞（SMCs）可衍生为动脉粥样硬化斑块中的多种细胞类型1。在主动脉瘤中，病理变化包括平滑肌细胞凋亡和细胞外基质重塑2,3。

关于胚胎期和围产期平滑肌细胞的形态....

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方案

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所有小鼠实验方案均经耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 在体 内 胚胎命运图谱绘制与克隆分析

注意：我们已广泛使用这些方法来评估发育和疾病模型中细胞的起源及其克隆结构7,8,9,10。

  1. 在携带 CreER 的小鼠与携带 Cre 报告基因的小鼠之间建立交配。
    注意：使用 CreER 标记平滑肌细胞；Myh11-CreERT2 或 Acta2-CreERT2 小鼠11,12 常用于此目的。我们使用了ROSA26R-CreERT2小鼠13 用于广泛标记胚胎组织。
    1. 用于克隆分析时，使用多色Cre报告基因系统（例如， 彩虹（Rainbow [Rb]）小鼠8,14,

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结果

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在对SMC突变胚胎进行的代表性克隆分析中 Eln （编码细胞外基质蛋白elastin的基因）， Eln(+/-)，Acta2-CreERT2 小鼠被交配以 Eln(+/-) 携带多色 ROSA26R 的小鼠(Rb/Rb) 报告基因。如步骤1所述，检查栓塞后，于E12.5对怀孕母鼠单次注射他莫昔芬（1.5 mg）进行诱导，并于E18.5处死。收集胚胎，固定、冷冻并进行基因分型。制备降主动脉横切面的冷冻切片。选取切片进行 Eln(+/-)，Acta2-CreERT2, ROSA26R(Rb/+) 胚胎表明，积聚在内层的过量SMC Eln-null 小鼠（从 E15.5 开始）以多种颜色标记（图1）因此来源于多种α-平滑肌肌动蛋白（SMA）+

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讨论

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与成年小鼠主动脉及其主要分支在动脉粥样硬化等病理条件下的广泛研究相比，关于胚胎期和围产期主动脉的形态发生及发病机制的研究仍较为有限。本文聚焦于胚胎期/围产期主动脉，特别是其中的平滑肌细胞（SMCs），并提供了一系列研究主动脉的实验方案 体内、组织外植块及SMC分离方法。这些互补的方法为研究者提供了多种途径来研究胚胎期/围产期主动脉。

克隆分析是一种非常强大的方法，可用于研究单个细胞的行为。我们最近利用该方法帮助鉴定了肺血管中特化的平滑肌细胞10。必须认识到，在携带多色Cre报告基因的小鼠个体中，相同颜色的细胞可能来源于多个独立的重组事件。因此，使用多色报告系统进行克隆分析时，必须对大量小鼠进行评估。由于在妊娠中晚期给予他莫昔芬可能干扰分娩过程，因此对于在妊娠中晚期标记细胞并进行出生后谱系示踪的实验，应同时注射孕酮和他莫昔芬。类似于胚胎实验方案，成年小鼠体内细胞的命运图谱绘制和克隆分析也可通过向成年小鼠腹腔注射他莫昔芬来实现。

平滑肌细胞的克隆分析与命运图谱研究利.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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感谢Dean Li分享其实验室关于主动脉平滑肌细胞分离的实验方案。本研究获得美国国立卫生研究院（R21NS088854、R01HL125815和R01HL133016，授予D.M.G.）、美国心脏协会（资助号14GRNT19990019，授予D.M.G.）以及耶鲁大学（A.M.获得Brown-Coxe博士后奖学金，D.M.G.获得启动资金）的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
他莫昔芬SigmaT5648
玉米油SigmaC-8267他莫昔芬的溶剂
4-羟基他莫昔芬SigmaH7904他莫昔芬的活性代谢产物
孕酮SigmaP8783-5G使用浓度为他莫昔芬的一半
OCT 包埋剂Sakura tissue tek4583用于制备冷冻切片块
冷冻模具Polysciences inc18986
DAPISigmaD9542细胞核免疫组化染色，终浓度为 5 mg/mL
直接偶联 Cy3 的抗-SMA 抗体SigmaA2547SMA 免疫组化染色，终稀释比例为 1:500
抗-CD31 抗体BD Pharmingen550274GFP 免疫组化染色，终浓度为 0.006 mg/mL
抗-GFP 抗体Thermo Fisher ScientificA-11121CD31 免疫组化染色，终浓度为 0.0016 mg/mL
二抗山羊抗兔，Alexa 647 标记Life Technologiesa21244免疫组化染色，终浓度为 0.004 mg/mL
二抗山羊抗兔，Alexa 488 标记Life Technologiesa11008免疫组化染色，终浓度为 0.004 mg/mL
DMEMThermo Fisher Scientific10567-014用于细胞培养
FBSThermo Fisher Scientific10437028
抗整合素 β3 封阻抗体BD Biosciences553343克隆号 2C9.G2，终浓度为 0.02 mg/mL
胶原酶Worthington Biochemical Corp44H14977A用于主动脉消化
弹性蛋白酶Worthington Biochemical Corp34K15139用于主动脉消化
抗生素-抗真菌剂（100 倍浓缩液）Thermo Fisher Scientific15240062
重组人 FGFPromegaG5071
重组人 EGFPromegaG5021
青霉素/链霉素（10,000 U/mL）Thermo Fisher Scientific15140122
两性霉素 BThermo Fisher Scientific15290026
组织培养板CorningCLS430165
Alzet 渗透压微型泵Durect Corporation2001
ECLIPSE 80i 直立荧光显微镜Nikon 
 TCS SP5Leica
Branson Sonifier 450VWR
Myh11-CreERT2 小鼠The Jackson Laboratory 19079
Acta2-CreERT2 小鼠由 Pierre Chambon 博士和 Daniel Metzger 实验室提供
ROSA26R-CreERT2 小鼠The Jackson Laboratory 8463
ROSA26R(mTmG/mTmG) 小鼠The Jackson Laboratory  026862
ROSA26R(EYFP/EYFP) 小鼠The Jackson Laboratory  006148 
ROSA26R(Confetti/Confetti) 小鼠The Jackson Laboratory 13731
ROSA26R(Rb/Rb) 小鼠Dr. Irv Weissman 实验室由 Dr. Irv Weissman 实验室提供

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
  2. Rowe, V. L., et al. Vascular smoo....

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