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方法文章

一种评估细菌素对小鼠肠道微生物群影响的方法

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DOI：

10.3791/56053

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2017年7月25日

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Biotecnología, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA), Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), 2Department of Food Safety and Infection Biology, Norwegian University of Life Sciences (NMBU), 3Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid (UCM), 4Faculty of Chemistry, Biotechnology and Food Science, Norwegian University of Life Sciences (NMBU)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

细菌素被认为在决定不同生态位中微生物多样性方面发挥关键作用。本文介绍了一种在动物模型中评估细菌素如何影响肠道菌群组成的高效方法。

摘要

随着对肠道菌群组成及其与健康关系的认识不断深入，许多引人深思的问题随之浮现，特别是关于维持菌群平衡的因素。然而，目前可用于评估这些因素的方法学仍十分有限。细菌素是由多种细菌产生的抗菌肽，可能赋予生产菌在营养获取和/或生态位定植方面的竞争优势。许多益生性乳酸菌（LAB）菌株具有显著潜力，可通过抑制病原菌的生长来促进人类和动物健康。此外，由于能够产生细菌素，这些菌株还可用于免疫调节。然而，细菌素的拮抗活性通常是在实验室生物测定中、在定义明确但过度简化的条件下测定的，这与人类和动物复杂的肠道环境存在显著差异——在真实肠道环境中，细菌会受到宿主因素以及数百种共存微生物的多因素影响。本文描述了一种完整且高效的评估流程 在小鼠系统中研究多种具有不同靶向特异性的细菌素。通过16S rDNA组成测序监测细菌素处理期间肠道菌群组成的变化。本方法同时使用细菌素产生菌及其同基因型的非产细菌素突变株，后者可用于区分由细菌素引起与非由细菌素引起的菌群改变。粪便DNA提取与16S rDNA测序方法具有一致性，结合生物信息学分析，构成了一种强大的流程，可用于检测细菌谱的微小变化，并建立细菌种群与健康标志物（如胆固醇和甘油三酯浓度）之间的相关性。本实验方案具有通用性，因此也可用于研究其他可能影响宿主菌群组成的化合物或营养物质，无论是在毒性研究还是有益效应评估中均可应用。

引言

细菌素是由多种细菌物种产生的一类抗菌肽1,2这些化合物及其生产者，尤其是乳酸菌（LAB），数十年来在全球范围内因其在食品保鲜和医学领域的潜在应用而被广泛研究和利用3多种细菌素已被证实可杀死包括某些重要病原菌在内的多种致病微生物 单核细胞增生李斯特菌、肠球菌、葡萄球菌 和 芽孢杆菌属某些细菌素甚至具有调节免疫反应的能力4许多细菌素具有相对较窄的抗菌谱，这一特性在某些应用中备受重视。例如，一些窄谱细菌素可针对特定的问题菌群发挥定向作用，同时对共存于同一生态位中的共生菌或有益菌群影响甚微；这一点在肠道环境中尤为关键，因为大量有益微生物在此以相互关联且动态平衡的方式生长繁殖5细菌素对于预防性或益生菌用途也极具吸引力，因为它们能够抑制可能破坏肠道稳态的病原菌、致病共生菌或机会性细菌的（过度）生长。6,7.

就其性质和理化特性而言，细菌素具有高度多样性，因其结构、靶标特异性及作用机制各不相同， 等等。 大多数细菌素已被深入研究 体外 条件，但在食品基质中进行测试的却很少8,9 或 体内 例如在动物肠道中6,10。该 体外 性质在评估时可能会存在很大差异 体内 由于肠道环境的复杂性以及可能对有益细菌产生的非预期影响，大多数益生菌属于乳酸菌（LAB）。它们能够产生多种代谢产物，包括短链脂肪酸，这些物质不仅可影响宿主的生理功能，还对某些细菌表现出抗菌特性。因此，对于能够产生细菌素的益生菌菌株，最好采用更贴近实际的检测方法，例如使用具有正常微生物群的健康动物进行实验。

在本研究中，我们提供了一种策略，可用于评估不同细菌素产生菌株（其产生的细菌素具有不同的抑菌谱）对健康小鼠的影响。该策略包括使用同基因型的非产细菌素突变菌株喂养小鼠，从而能够区分由细菌素介导的效应与非细菌素介导的效应。通过16S rDNA测序，可追踪肠道菌群的动态变化。随后的统计分析可解析细菌种类之间的相关性，以及细菌种类与所测定的生理参数（例如，体重、血清生化指标，等）之间的关联。我们认为，本研究所展示的实验方案不仅适用于活体动物中细菌素的研究，也可推广应用于其他益生菌或益生元的相关研究。

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方案

护理和操作必须在专业的动物护理单元中进行。本文所述操作程序已获得瓦伦西亚大学相应的伦理委员会及当地主管部门批准，遵循欧盟法律和2010/63/EU指令以及西班牙政府关于用于科学目的动物保护的RD 53/2013法令所规定的实验动物护理原则，以尊重动物实验中的3R原则（替代、减少、优化）。

1. 用于接种小鼠的冷冻细菌培养物

  1. 将乳酸菌（LAB）单菌株接种于5 mL脑心浸液（BHI）培养基中，在30 °C下培养20–24小时（过夜）。
  2. 取2 mL过夜培养物转移至200 mL BHI培养基中，使过夜菌液稀释100倍。在30 °C下继续培养20–24小时。
    注意：本研究所用菌株列于表1中。
  3. 在4 °C条件下，以5,000 × g离心20分钟收集菌体细胞。
  4. 弃去上清液，用100 mL冰浴的磷酸盐缓冲液（PBS）重悬每个菌体沉淀，按步骤1.3方法收集细胞，重复洗涤两次。
  5. 第二次洗涤后，将每个菌体沉淀重悬于20 mL冰浴的含15%甘油的PBS溶液中。
  6. 将菌悬液分装至离心管中，每管1 mL，保存于-80 °C备用。
    注意：细胞应在分装保存后1–2个月内使用。
  7. 在储存前及给药前测定细胞数量，以明确给予小鼠的活菌数量。
    1. 进行细胞计数时，将细胞在冰浴的0.9%氯化钠（NaCl）溶液中进行10倍系列稀释。取各稀释液100 µL涂布于BHI琼脂平板上。在30 °C下培养过夜（20–24小时），促进细胞生长并形成菌落，通过菌落计数确定每毫升菌落形成单位（cfu/mL）。
  8. 制备含菌饮水时，将各菌株储备培养物的菌体稀释于100 mL无菌过滤饮水中，终浓度平均为109 cfu/mL。为评估细菌存活率，在稀释后立即以及在细菌处理的前两周内每周一次于24小时后检测活菌数量。

2. 小鼠实验与实验设计

注意：本实验需要无特定病原体（SPF）的 BALB/c 品系年轻雌性小鼠（6 - 8 周龄）；此处共购买了 100 只动物。

  1. 在整个实验过程中为小鼠提供自由摄取的颗粒饲料和饮水。
  2. 设计实验并计算功效。
    1. 若每种处理均有其对应的对照，则采用配对病例-对照设计（t检验）。通过预实验测定待确定的最重要效应的均值与标准误。
    2. 使用不同的方法和免费提供的程序优化检测效能以及每组所需的动物数量11.
    3. 为检测产细菌素菌株与非产细菌素菌株的效应，每种实验条件使用9只动物。
      注：该样本量是根据实验标准误确定的，可提供满意的检验效能（0.7 - 1.0）且显著性水平低于 0.05。
      注意：在本示例中，共设置了11组小鼠，每笼一组。其中10个笼子对应5种产细菌素菌株及其相应的5种同基因型非产细菌素菌株的处理；第11组th 笼内有10只小鼠，作为未处理对照组。
  3. 将小鼠运抵饲养设施后，将其分配至笼具中，并对动物进行耳标标记，以便个体追踪。在继续实验前，让小鼠在饲养设施中适应环境条件一周。
  4. 按照步骤1.8所述制备含细菌的饮用水，并将饮用水瓶放置于相应独立的笼具中，笼具需有明确标识，确保每笼小鼠共用同一水瓶。
    注意：对照组必须饲养在单独的笼子中，不得与待测细菌接触。
  5. 每天准备一瓶新的新鲜饮用水（100 mL），并加入 freshly defrosted 细菌悬液。连续进行 15 天。
  6. 在细菌处理结束后，继续为期两周的观察期，期间小鼠饮用无菌水（图1).

3. 样品采集

  1. 收集粪便样本。
    1. 准备已高压灭菌的笼子（空笼）、无菌镊子，并为每只小鼠标记无菌的1.5 mL离心管。
    2. 每天在同一时间采集样本，以避免微生物群组成在一天内发生变化。为获得最佳结果，应分别采集新鲜样本。
      注意：最好在清晨收集粪便，因为小鼠通常在此时会自发排便。
    3. 用70%乙醇清洁一个空鼠笼，并将一只小鼠放入其中。待其排便后，使用无菌镊子收集2–4粒粪便颗粒，置于1.5 mL离心管中。
      注意：有时只需将小鼠尾巴向上提起，即可直接从肛门将粪便收集到试管中。
    4. 在为期四周的实验期间，每周从每只小鼠收集一次粪便样本（图1在第1天（T0，零时点）收集初始样本，即在小鼠接触细菌之前采集。随后分别在第7、14、21和28天收集粪便样本。
    5. 将样本置于4 °C冷藏，直至运送至实验室，并在实验室于-80 °C冷冻保存。需提前规划并准备充足的储存盒，因为实验过程中将收集大量粪便样本。
  2. 每周在收集粪便的当天称量所有小鼠的体重。
  3. 从所有小鼠的面静脉采集血液样本，时间为第15天th 第天，即细菌给药的最后一天，检测血清中甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）的水平。
    注意：应由经验丰富的人员采集血液，以减少动物的应激反应。

4. 实验室菌落计数与细菌素活性

  1. 取各样品的一个粪便颗粒，称重后置于1.5 mL离心管中，加入适量冰浴的0.9% NaCl溶液，配制成10%（w/v）的悬液。使用适用于1.5 mL离心管的无菌微型研磨棒充分匀浆粪便悬液，并用冰浴的0.9% NaCl溶液进行10倍系列稀释。
  2. 计数乳酸菌（LAB）总细胞数。
    1. 取稀释后的菌悬液（100 µL）加入4 mL预热的Man Rogosa Sharpe（MRS）软琼脂（50 °C，0.8%琼脂）中，涡旋混匀，然后将混合液倾注至固体MRS琼脂平板（1.5%琼脂）上。
    2. 在超净工作台中打开皿盖，干燥5–10分钟，随后于30 °C培养20–24小时，以促进细胞生长和菌落形成。
  3. 计数产细菌素的细胞。
    1. 取产细菌素菌株的稀释菌悬液（100 µL）加入4 mL预热的MRS软琼脂（50 °C，0.8%琼脂）中，涡旋混匀后倾注于MRS琼脂平板（1.5%琼脂）上；此层称为第一层。
    2. 将另外4 mL无细胞的MRS软琼脂（0.8%琼脂）倾注至第一层之上，使所有细胞包埋于软琼脂中。
      注：该层的作用是防止细胞在琼脂平板表面形成菌落。若细胞在表面生长，在后续倾注指示菌（步骤4.3.4）时容易发生位移，从而干扰结果判读。此层称为第二层。
    3. 在超净工作台中打开皿盖，干燥5–10分钟，随后于30 °C培养20–24小时，以促进细胞生长和菌落形成。
    4. 为鉴定产细菌素的菌落，取适量过夜培养的合适指示菌株（见表1）40 µL，与4 mL预热的软琼脂混合，将混合液倾注至平板上；此层称为第三层。
    5. 在超净工作台中打开皿盖，干燥5–10分钟，随后于30 °C培养20–24小时，以促进细胞生长和菌落形成。
      注：产细菌素的菌落周围会出现清晰的抑菌圈（图2）。

5. DNA 提取、16S rDNA 扩增及测序

注意：DNA 提取步骤以使用商业试剂盒为例进行描述（例如，Realpure "SSS" 试剂盒）。

  1. 将1-2粒小鼠粪便颗粒（约200 mg）悬浮于300 µL裂解液中。
  2. 将样品转移至已预先加入约0.5 g玻璃珠（直径：0.1 mm）的2 mL微量离心管中。
  3. 向每个样品中加入1 µL浓度为10 U/µL的溶菌酶（mutanolysin）和2 µL浓度为20 mg/mL的溶菌酶（lysozyme），于37 °C孵育40-60分钟。随后按照粪便样品DNA提取的标准操作流程之一进行后续步骤12。
  4. 进行两次珠磨（bead-beater）处理，每次1分钟。
  5. 加入2 µL蛋白酶K，并充分混匀。
  6. 孵育20分钟，每隔5分钟涡旋振荡一次。
  7. 将样品冷却至37 °C，加入1 µL浓度为5 µg/mL的RNase A，充分混匀。
  8. 于37 °C孵育30-60分钟。
  9. 将样品冷却至室温，加入180 µL蛋白质沉淀液，以最大速度剧烈涡旋振荡20-30秒。
  10. 在16,000 x g条件下离心5分钟。若上清液中仍有悬浮颗粒，将样品置于冰上孵育5分钟，然后再次离心。
  11. 将含有DNA的上清液转移至一个新的含有300 µL异丙醇的1.5 mL微量离心管中。
  12. 通过反复倒置管子20-30次进行混匀，并于-20 °C孵育1小时。也可选择更长时间孵育（例如，过夜）。
  13. 在16,000 x g条件下离心2分钟。
  14. 弃去上清液，将管子在吸水纸上干燥，加入300 µL 70%乙醇洗涤DNA沉淀。
  15. 在16,000 x g条件下离心1分钟，弃去上清液，让沉淀在空气中干燥约15分钟。
  16. 待沉淀完全干燥后，加入100 µL无菌水或Tris（10 mM）/EDTA（1 mM）缓冲液，重悬沉淀。
  17. 为消除后续步骤中可能存在的抑制性物质，需对DNA进行纯化。将提取的DNA与2倍体积（200 µL）的NTI缓冲液混合，以调节第5.15步的结合条件。
  18. 将含有硅胶膜的PCR纯化柱放入一个2 mL收集管中，然后上样。
  19. 在11,000 x g条件下离心30秒，弃去穿流液。
  20. 用700 µL NT3缓冲液洗涤硅胶膜，并重复第5.16步。
  21. 在11,000 x g条件下离心1分钟，干燥硅胶膜，以去除残留的含乙醇洗涤缓冲液NT3。
  22. 将纯化柱转移至一个新的1.5 mL微量离心管中，于70 °C孵育2-5分钟，以彻底去除乙醇。
  23. 加入30 µL PCR级水，于70 °C孵育5分钟，然后在11,000 x g条件下离心1分钟进行洗脱。
  24. 使用紫外/可见光分光光度计或荧光定量法测定DNA浓度。
  25. 对同一笼内小鼠在每个时间点的DNA样品进行标准化并合并。
  26. 为观察时间过程中的个体差异，在第0、14和28天，从对照组及另外两个随机选择的笼中各随机选取三只小鼠的DNA样品进行测序。

6. 16S rRNA 基因扩增与测序

  1. 制备扩增的16S rRNA基因文库。使用带有适当接头适配子的正向和反向引物扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4区5：
    5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3'
    5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3'
  2. 通过1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带。
  3. 使用磁珠对聚合酶链式反应（PCR）产物进行纯化，以去除杂质。
  4. 根据所使用的高通量测序平台的制造商说明进行后续操作6。

7. 数据分析与统计学

  1. 质量过滤（通常由测序机构完成）。
    1. 使用设备配套软件对原始测序数据进行过滤和去重。
    2. 使用UPARSE流程处理成对末端测序读长13 在 USEARCH 中实现14 （版本 7.0.1090）。合并成对末端并使用最大预期错误值（maxee）为 1.0 进行质量过滤。丢弃长度小于 150 nt 的序列。对序列进行去重复化处理以去除单例序列。
    3. 将序列按97%的序列相似性聚类为操作分类单元（OTUs），并使用UCHIME15 过滤嵌合序列。
  2. OTU挑选、分类学注释、系统发育重建，以及多样性分析与可视化。
    1. 使用定量微生物生态学分析工具（Quantitative Insights Into Microbial Ecology, QIIME）对OTUs进行处理16.
    2. 选取代表性OTU并将其与Greengenes核心数据库进行比对和序列比对17 使用 PyNAST18 最低同源性为75%（默认值）。
    3. 使用核糖体数据库项目（Ribosomal Database Project，RDP）分类器程序对比对后的序列进行分类学指派19 置信度为 0.8。
    4. 将OTU表标准化为测序深度最低样本的序列数。
    5. 使用 Fast Tree 从比对后的序列构建系统发育树20 过滤步骤后，去除高度可变区域以及全为空缺（gap）的位点。利用该系统发育树计算α和β多样性，绘制稀疏曲线并计算Shannon指数。
    6. 生成并可视化未加权的UniFrac距离矩阵21，使用主坐标分析（PCoA）。
      注意：对于统计分析，可使用不同的软件包，例如 R22 或QIIME中实现的统计工具16.
    7. 对于不同处理间香农多样性指数的比较，使用协方差分析（ANCOVA），在R中将时间视为连续型因变量。
    8. 使用双尾 Student's t 检验比较 QIIME 中 PCoA 的处理间距离，并通过 1,000 次 Monte Carlo 置换结合 Bonferroni 校正计算非参数 p 值。
    9. 分析特定OTU的相对丰度与其他测定参数（如血清胆固醇、HDL、LDL水平）之间的相关性， 等等。，使用皮尔逊相关性分析。为此，使用 CoNet23 使用 Cytoscape 3.1.1 进行相关性网络的后续可视化24.

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结果

乳酸菌（LAB）产生细菌素的能力被认为是一种有益的益生特性，因其被认为可抑制机会性细菌和病原菌的生长。本研究旨在通过小鼠模型展示细菌素调节肠道菌群组成的能力。为此，我们建立了一种方法，用于比较摄入产细菌素菌株与其同源非产细菌素菌株所产生的效应。接种程序及实验持续时间如图1所示。小鼠分为11个笼组：一组为空白对照组（不进行任何处理），五组给予产细菌素菌株处理，另五组给予相应的同源突变株处理（这些突变株的细菌素产量降低或完全丧失）。所测试的产细菌素乳酸菌、其在饮水中及粪便中的菌落计数（cfu/mL）汇总于表1。从粪便中回收的乳酸菌产生细菌素能力的测定结果如图2所示。当综合考虑所有样本和所有细菌类群时，产细菌素处理组与同源菌株组之间未观察到显著差异（图3）。然而，当独立分析特定细菌属时，可能存在差异，如图4所...

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讨论

本文所述方法已被用于确定微生物群的变化是否与健康或年龄相关。该实验方案的各个步骤均具有重要性，但其中粪便取样、目标DNA片段的选择与测序分析，以及DNA提取和生物信息学分析可能是最关键的环节。取样至关重要，因为出于伦理考虑应避免小鼠产生应激反应，且已知应激会改变肠道菌群的比例。样品应尽快处理，或在使用前冷冻保存，因为某些细菌对脱水和/或氧气极为敏感。从扩增的16S rRNA基因中选择待测序的DNA片段是关键步骤。本研究中选择了V3-V4可变区25。DNA提取方法的重要性不容忽视，因为样品中的细菌细胞对不同的裂解方案敏感性不一，不完全裂解可能导致细菌种群丰度估算出现偏差。因此，必须引入珠磨裂解步骤。可通过基因敲低或质粒调控构建同基因型菌株，但在某些难以转化的菌株中，染色体编码的细菌素可能成为问题。本方法可结合不同的特异性培养技术进行调整，例如厌氧培养方法26。

该方案的大多数步骤均可根据所要研究的因素变化类型进行调整。接种程序可以缩短，但血清参数的变化可能需要一定时间才能显现。该方法的一个...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢欧洲经济区资助项目NILS科学与可持续发展协调研究人员流动计划（编号017-ABEL-CM-2013）。C.B.和G.P.-M.的研究得到了西班牙经济与竞争力部AGL2015-70487-P项目的资助。O.C.O.U.和D.B.D.获得了挪威生命科学大学（NMBU）食品科学研究战略奖学金项目（项目编号1205051025）的支持。我们还要感谢Inmaculada Noguera在动物护理与取样方面的协助，以及Jesus Dehesa在保障动物实验设施中实验室材料供应方面提供的帮助。同时，我们感谢Lars-Gustav Snipen教授在统计学方面的建议。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Balb/c小鼠（雌性）Harlan小鼠年龄应为6至8周
塑料培养皿Thermo Scientific101VR20
脑心浸液肉汤Conda1400.00
欧洲细菌琼脂Pronadisa1800.00
低电渗琼脂糖D1Pronadisa8010.00
1x TAE缓冲液Thermo Scientific15558042
MRS肉汤Difco288130
PBS片剂SigmaP4417-100TAB
天平Mettler ToledoPB602-S
无菌镊子Levantina de Laboratorios S.L.260-3710014
微量离心机Eppendorf5424
离心机HermleZ383K
氯化钠AppliChem Panreac121659.1211
Realpure SSS试剂盒Real Life Science Solutions, Durviz, SpainRBME04 (300 ml)
异丙醇AppliChem Panreac131090.1611
乙醇AppliChem Panreac131086.1214
Qubit荧光计Invitrogen
Qubit dsDNA HS检测试剂盒InvitrogenQ32851
AMPure XP磁珠Beckman Coulter Genomics, USAA63881 (60 ml)
PerfeCta NGS文库定量试剂盒Quanta BioSciences, Maryland, USA733-2300
MiSeq v3试剂盒Illumina, San Diego, California, USAMS-102-3003
16S rRNA基因扩增引物引物包含细菌16S rRNA基因的V3-V4区及Illumina接头序列：5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ 和 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’
Nextera XT Index试剂盒FC-131-1002索引序列及Illumina测序接头
适用于1.5 mL离心管的微型研磨杵，Eppendorf / Sigma，货号SigmaZ317314-1PAK
玻璃珠，直径0.1 mmBiospec Products11079-101
NucleoSpin凝胶与PCR纯化试剂盒Macherey-Nagel740609.25
Omni Bead Ruptor 24Omni International Inc.19-040
溶菌酶MutanolysinSigmaM9901-10KU
溶菌酶LysozymeRoche10837059001
蛋白酶KRoche3115887001
RNase ASigmaR4875

参考文献

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