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原位 使用液相扫描电镜表征水中的勃姆石颗粒

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DOI：

10.3791/56058

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2017年9月27日

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1Earth & Biological Sciences Directorate, Pacific Northwest National Laboratory

本文内容

摘要

我们介绍了一种对去离子水中的勃姆石颗粒进行实时成像与元素组成分析的方法 原位 液相扫描电子显微镜

摘要

原位 利用液体-真空界面分析系统（SALVI）与扫描电子显微镜（SEM）实现了对水中勃姆石（AlOOH）颗粒的成像与元素分析。本文描述了将真空兼容的SALVI系统与SEM联用的方法及关键步骤，并在高真空条件下获得了液体中颗粒的二次电子（SE）图像。采用能量色散X射线光谱（EDX）对液体中的颗粒、仅含去离子水（DI水）的对照样品以及空通道样品进行元素分析。以悬浮于液体中的合成勃姆石（AlOOH）颗粒作为模型，用于液体SEM成像的示例。结果表明，可在二次电子模式下以良好分辨率对颗粒进行成像（即，400 nm）。与去离子水和空白通道对照相比，AlOOH的EDX谱图显示出明显的铝（Al）信号。 原位 液相扫描电镜是一种用于在液体环境中研究颗粒的强有力技术，具有诸多令人期待的应用。本实验方案旨在提供使用SALVI进行液相扫描电镜成像和EDX分析的技术要点，以减少采用该方法时可能遇到的潜在问题。

引言

扫描电子显微镜（SEM）通过生成高分辨率图像，已被广泛应用于多种样品的观察研究1。与SEM联用的能量色散X射线光谱（EDX）技术可实现元素组成的测定1。传统上，SEM仅适用于干燥且固态样品的成像。在过去30年中，环境扫描电子显微镜（ESEM）被发展用于在蒸气环境中分析部分水合样品2,3,4,5。然而，ESEM无法以理想的高分辨率对湿润的、完全流体状态的样品进行成像6。此外，也已开发出用于在SEM中观察湿润样品的湿式SEM样品室7,8；但这些样品室主要针对生物样品和背散射电子成像而设计，因此更适用于此类特定应用需求9,10。

为了解决在扫描电镜（SEM）中以原位液体环境分析各类样品所面临的挑战，我们发明了一种与真空兼容的微流控装置——液体-真空界面分析系统（SALVI），从而能够在SEM的高真空模式下实现对液体样品的高空间分辨率二次电子（SE）成像和元素分析。该创新技术具有以下独特特点：1）液体直接通过一个直径为1–2 µm的小孔被探测；2）液体依靠表面张力被稳定地保持在孔内；3）SALVI具有便携性，可适配于多种分析平台11,12,13,14,15,16,17,18。

SALVI 由一层厚度为 100 nm 的氮化硅（SiN）薄膜和一个由聚二甲基硅氧烷（PDMS）块体制成的宽度为 200 µm 的微通道组成。SiN 薄膜窗口用于密封该微通道。其制造细节和关键设计考虑已在先前的论文和专利中详细阐述11,19,20。目前，一家显微镜耗材的主要制造商和供应商已获得许可，可将 SALVI 装置用于液体扫描电镜应用的商业化销售21,22。

SALVI在基于真空的分析仪器中的应用已通过多种水溶液和复杂液体混合物得到验证，包括生物膜、哺乳动物细胞、纳米颗粒和电极材料12,14,17,20,23,24然而，上述大部分研究采用飞行时间二次离子质谱法（ToF-SIMS）作为关键分析工具，因此液相 SEM 结合 SALVI 的应用尚未得到充分探索。本研究利用 SALVI，通过液相 SEM 成像和 EDX 元素分析，研究了液体中较大的非球形胶体颗粒。样品为本实验室合成的 AlOOH 颗粒。已知在汉福德场址的高放废液中存在亚微米级的勃姆石颗粒。这些颗粒溶解缓慢，可能在废液处理过程中引发流变学问题。因此，具备在液体环境中表征勃姆石颗粒的能力至关重要25该技术方法可用于在不同物理化学条件下研究勃姆石，以增进对这些颗粒及其相关流变性质的理解。这些颗粒被用于逐步演示如何将SALVI应用于高真空扫描电镜（SEM），以研究悬浮在液体中的颗粒。文中重点阐述了SALVI与SEM联用以及SEM数据采集过程中的关键技术要点。

本方案为未来有意在液体扫描电镜（liquid SEM）多种应用中使用SALVI技术的研究人员，提供了利用SALVI进行液体样品分析及液体SEM成像的操作示范。

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方案

1. 准备 AlOOH 液体样品

注意：切勿用手直接触碰样品或扫描电镜腔室内的任何部件。在操作 SALVI 装置并将其安装到扫描电镜载物台时，应始终佩戴无粉手套，以避免在表面分析过程中可能发生的污染。

  1. 制备 AlOOH 储备液（1 mg/mL）
    1. 将 10 mg AlOOH 粉末溶解于 10 mL 去离子水（DI 水）中，配制成 1 mg/mL 的 AlOOH 储备液。
    2. 将储备液超声处理 5 分钟。
      注：储备液的 pH 值约为 4.6，通过 pH 计测定。本实验中不调节溶液 pH，直接使用。
  2. 制备 10 µg/mL 的稀释液
    1. 用移液器将 1 mL 1 mg/mL 的 AlOOH 储备液加入 99 mL 去离子水（DI 水）中，稀释至 10 µg/mL。
    2. 将溶液超声处理 5 分钟。
      注：稀释后溶液的 pH 值约为 5.8，通过 pH 计测定。

2. 用碳溅射涂覆 SALVI 氮化硅薄膜窗口

  1. 将碳棒插入棒状支架中。
    注意：棒状支架可识别为连接在铰链盖上的部件。
  2. 使用镊子小心地移除 SALVI 的 SiN 膜窗框上的胶带。
    注意：该胶带用于在表面分析前保护 SiN 膜。
  3. 使用碳导电胶带将 SALVI 装置垂直固定在碳镀膜仪腔室内的样品台上，固定位置为 SALVI 装置的聚四氟乙烯管路部分。关闭盖子。
  4. 按下“POWER”按钮，启动真空泵。
  5. 按下碳镀膜仪前面板上的“VOLTAGE”按钮，并通过调节上升（▲）和下降（▼）按钮将电压值设定为 4.6 V。
    注意：由于不同型号的碳镀膜仪可能存在差异，电压设置值可能有所不同。
  6. 打开镀膜厚度监测仪的“POWER”开关以启动设备。若屏幕上显示的“THICKNESS (nm)”数值不为零，按下“ZERO”按钮将其归零。随后按下碳镀膜仪前面板上的“TIMER”按钮，并通过调节上升（▲）和下降（▼）按钮将沉积时间设定为 30 秒。
  7. 将碳镀膜仪的操作模式通过“AUTO ◄►MANUAL”按钮设定为“AUTO”模式。当碳镀膜仪前面板上的真空计显示真空度达到约 4 × 10-4 mbar 时，将“START/STOP”按钮切换至“START”位置。
  8. 当厚度监测仪显示碳镀层已达到 20 nm 时，按下“stop”按钮以终止镀膜过程并解除真空密封状态。
  9. 打开盖子，佩戴乙烯基手套取出已完成碳镀的 SALVI 装置。
    注意：对样品进行碳镀可在其表面形成一层导电层，以抑制电荷积累效应，并增强 SEM 成像所需的二次电子（SE）信号。将镀膜后的装置妥善存放于带盖的洁净培养皿中，直至准备将其安装至 SEM 样品台。为确保 SiN 膜表面已充分覆盖镀层，建议在镀膜后进行目视检查；若发现镀层厚度不足，可再次进行溅射镀膜，直至累计镀层厚度增加约 10 nm。

3. 安装装置并使用聚焦离子束（FIB）在 SALVI 的氮化硅（SiN）膜上制备通孔

  1. 打开 SEM 样品室
    1. 在 SEM 仪器控制计算机上打开相应的显微镜控制软件。
      注意：由于不同 SEM 型号的差异，控制软件可能有所不同。
    2. 在“束流控制”选项卡下的图形用户界面（GUI）中点击“Vent”（放气），以对样品室进行放气，从而打开样品室门。
    3. 待放气完成后，小心地打开样品室门。
  2. 将 SALVI 装置安装到 SEM 样品台
    注意：安装前应通过肉眼或光学显微镜检查氮化硅（SiN）膜表面是否完好。安装在 SEM 样品台上的 SALVI 装置不得触碰样品室内 Everhart Thornley 探测器（ETD）。
    1. 选择标准 SEM 样品台载物 stub。使用合适的螺栓和六角扳手将 stub 固定在样品台中心位置。
    2. 在 stub 上贴两条双面碳导电胶带。
    3. 将 SALVI 装置粘附在 stub 的碳胶带上，确保氮化硅膜一侧朝上。
    4. 使用另外两条单面铜胶带将 SALVI 的 PDMS 块牢固地固定在 SEM 金属 stub 上，同时用铜胶带连接氮化硅框架与金属 stub。注意胶带不得完全覆盖氮化硅膜。
      注意：使用碳胶带和铜胶带有助于在 SEM 测量过程中为氮化硅膜提供连续的接地通路，以消除电荷积累。铜胶带在氮化硅框架边缘的位置至关重要，因为它可确保良好接地并减少分析过程中的电荷效应。装置底部也必须通过双面碳胶带与 SEM stub 完全接触。胶带不得覆盖氮化硅膜，以避免操作过程中造成损伤。
  3. 对样品室抽真空
    1. 关闭样品室门。在 SEM 软件 GUI 的“束流控制”页面中选择“高真空”（High Vacuum）模式。
    2. 点击“束流控制”页面上的“Pump”（抽气）按钮开始抽真空，并用手对样品室门施加适当压力，直至达到所需真空度。
      注意：样品室压力必须至少达到 1.0 × 10-5 Torr，并在成像前持续稳定保持在此值或更低。这是实现高分辨率成像的关键步骤。真空度可在 GUI 右上角实时监测。
  4. 使用聚焦离子束（FIB）在氮化硅膜上制备通孔
    1. 点击工具栏上的“Pause”（暂停）图标以激活电子束成像区域。在“束流控制”页面点击“Beam On”（开启束流）按钮以开启电子束。从“Detectors”（探测器）下拉菜单中选择 ETD 探测器和二次电子（SE）模式进行成像。
      注意：探测器类型可能因 SEM 配置不同而异。镜内探测器也可用于液相 SEM 分析。
    2. 点击工具栏上的“Link”（链接）图标，将 Z 坐标值与实际自由工作距离（FWD）值关联。在“Navigation”（导航）页面中，当选择“Actual”（实际）距离时，在坐标“Z”的文本框中输入数字 10，将工作距离（WD）设为 10 mm。
      注意：工作距离可能因不同 SEM 型号而异。
    3. 在电子束成像区域的工具栏对应列表框中，将电子束电流设为 0.47 nA，加速电压设为 8 keV，分辨率设为 1,024 × 884。
      注意：电流和电压设置可能因不同 SEM 型号而异。
    4. 通过手动用户界面（MUI）板上的“X”和“Y”偏移旋钮调节，观察控制显示器上的实时图像，定位微通道（0.2 mm × 1.5 mm）。使用鼠标从微通道一端到另一端绘制一条与之平行的直线。在工具栏“Stage”（样品台）选项卡的下拉菜单中点击“xT Align Feature”（xT 对齐特征），并选择“horizontal”（水平）以对齐微通道。
    5. 在“Navigation”页面的“T”列表框中选择 0°，将样品台倾转角度设为 0°。通过“X”和“Y”偏移旋钮移动样品台，将微通道附近一个明显的颗粒特征置于黄色十字线中心。将该特征放大至 1,000 倍，并调节 MUI 上的“Contrast”（对比度）、“Brightness”（亮度）、“Coarse”（粗调）和“Fine”（细调）旋钮，以优化颗粒特征的图像质量。
    6. 在“Navigation”页面的“T”列表框中选择 15°，将样品台倾转至 15°。样品台倾转后，按住鼠标滚轮使用“Z-control”（Z 轴控制）将特征重新移回黄色十字线中心。
      1. 再次将样品台倾转至 30°，并使用“Z-control”将特征移回十字线中心。然后将样品台恢复至 0°，观察特征位置；若特征未发生明显偏移，则确认已找到共心高度。
        注意：确定共心高度的目的是确保离子束与电子束在相同位置聚焦，以实现精确的 FIB 刻蚀。若样品台恢复至 0°后特征发生明显偏移，需重复步骤 3.4.6。为获得最高精度，每次更换新安装的样品时均应重新调整共心高度。
    7. 在“Navigation”页面的“T”列表框中选择 52°，将样品台倾转至 52°。
      注意：倾转角度可能因不同 SEM 型号而异。
    8. 点击工具栏上的“Pause”图标以取消暂停状态，确保离子束成像区域已激活。在“束流控制”页面点击“Beam On”按钮，开启镓源离子束。
      1. 在工具栏对应的电压和电流列表框中，将离子束加速电压设为 30 keV，束流设为 0.3 nA。将微通道移至该成像区域中心。
    9. 在“Patterning”（图案化）页面的“Pattern”（图案）列表框中选择“圆形”作为图案。在对应的文本框中设置“外径”为 1 µm，“内径”为 0 µm，“Z 尺寸”为 500 nm，“停留时间”为 1 µs。
      1. 在“Application”（应用）文本框中输入“Si”，因为即将刻蚀的检测窗口主要成分为氮化硅。然后点击“Patterning menu/Start patterning”（图案化菜单/开始图案化）按钮，开始在覆盖微通道的检测窗口上刻蚀通孔。重复刻蚀过程多次，以获得一系列圆形孔。实验中可制备多个孔。
        注意：孔间距为 100 µm，从微通道一侧到另一侧。操作应迅速以最小化离子束对氮化硅膜的损伤。SEM FIB 刻蚀通常从微通道最左侧或最右侧开始，以便于追踪和编号通孔。操作者也可根据通道方向和个人偏好选择从底部或顶部开始。应确保 SEM FIB 刻蚀充分完成，以便后续可在通孔区域内对样品进行探测。
  5. 完成 SEM/FIB 操作后对样品室放气
    1. 在“Navigation”页面的“T”列表框中选择 0，将样品台恢复至 0°。激活相应的束流成像区域后，点击“Beam On”按钮关闭电子束和离子束。在“束流控制”页面点击“Vent”按钮对样品室进行放气。

4. 使用液体样品装载 SALVI

  1. 使用去离子水清洗 SALVI
    1. 待 SEM 腔体完全通气后，小心打开腔体门，并将 SALVI 装置保留在载物台上原位不动。
      注意：为节省安装装置和聚焦的时间，强烈建议在加载样品时将装置保留在载物台上。
    2. 用无菌注射器吸取 1 mL 去离子水，通过聚四氟乙烯管路接头将注射器连接至微流控装置的入口，并缓慢注入液体 3 - 5 分钟。
      注意：在所有需要向 SALVI 注入溶液的步骤中，均推荐使用注射泵。本步骤中可将装有 1 mL 溶液的无菌注射器设置为 100 - 250 µL/min 的流速。使用注射泵并保持恒定流速可降低对氮化硅（SiN）膜造成损伤的风险。
    3. 重复步骤 4.1.2 三次，每次使用 1 mL 浓度为 10 µg/mL 的 AlOOH 溶液（按步骤 1 制备），以确保样品浓度不会因预装的去离子水而被稀释。
    4. 注射完成后，取下注射器。使用聚醚醚酮接头将 SALVI 的入口和出口连接，用实验室擦拭纸擦干 SALVI 外表面的液体。若聚四氟乙烯管路或微通道内存在气泡，需重新进行 AlOOH 样品注射，直至聚四氟乙烯管路中无可见气泡。
      注意：聚醚醚酮接头用手拧紧即可。拧紧时切勿用力过大，以免导致 SALVI 装置内部压力显著升高，从而损坏氮化硅（SiN）膜。
      注意：微通道内的气泡可能影响扫描过程并导致图像漂移。装置外部的任何液体均会影响真空状态，因此在将 SALVI 插入真空腔室前，必须彻底擦干其外表面及聚四氟乙烯管路。此外，装置不应有任何物理损伤（e.g.，管路切口、氮化硅膜窗口破裂），否则可能导致泄漏。若存在泄漏，腔室压力可能无法达到所需的高真空状态，管路中会产生气泡，且在抽真空过程中液态样品将丢失。

5. 进行液体环境扫描电镜成像与元素分析

  1. 使用 ETD 检测器和 SE 模式采集图像
    1. 关闭样品室门。选择 "高真空" 在SEM软件的图形用户界面（GUI）中选择模式 "束流控制" 页。单击 "泵" 按钮上的 "束流控制" 启动真空泵以开始抽真空，并用手按压腔室门，直至达到所需真空度。
    2. 通过点击激活电子束成像区域 "暂停" 工具栏上的图标。通过点击开启电子束 "开启电子束" 按钮 "束流控制" 页面。选择ETD探测器和SE模式进行成像 "探测器" 下拉菜单
      1. 在电子束成像区域的图形用户界面工具栏中，从相应的下拉列表框中将加速电压设置为 8 keV，束流设置为 0.47 nA。通过输入数值将工作距离（WD）设为 7 mm "7" 进入坐标文本框 "Z" 在 "导航" 页面当 "实际" 选择距离。
        注意：由于不同扫描电子显微镜的差异，电子束电压、电流和工作距离的参数可能有所不同。
    3. 将特征放大至 1,000 倍 × 并扭转 "对比", "亮度", "粗略"，以及 "精细" 使用MUI上的旋钮优化颗粒特征的图像。
    4. 通过旋转将电子束成像区域实时图像中的第一个孔居中 "X" 和 "Y" 调整 MUI 板上的移位旋钮。将含有颗粒的图像放大至 200,000 倍× 通过扭转 "放大倍数" MUI 板上的旋钮。选择屏幕分辨率 "1,024 × 884" 从工具栏的列表框中。
    5. 将扫描速率设置为30 µ从工具栏的列表框中选择。按下 F4 键，以获取电子束成像区域中当前图像的快照。
    6. 按 Ctrl + S 键，将图像以 .tif 文件格式保存至指定位置，文件名需包含定义的名称及递增编号。
    7. 通过旋转扭动来缩小视野 "放大倍数" 旋转旋钮以定位下一个相邻的孔。重复步骤 5.1.4 - 5.1.6 的操作，对剩余孔中的 AlOOH 颗粒进行成像。
  2. 使用EDX进行元素分析
    1. 将能量色散谱（EDS）探测器插入腔室。
    2. 在显微镜控制显示器上选择ETD探测器，并设置二次电子（SE）模式以在电子束成像区域观察样品。按照步骤5.1.2所述，将加速电压设为8 keV，电流设为0.47 nA，工作距离（WD）设为7 mm。
    3. 以 200,000 倍放大倍数旋转调节，放大每个孔中的 AlOOH 颗粒 "放大倍数" MUI 板上的旋钮
      注意：将电子束聚焦在同一位置，以提供更局部化的元素信息。AlOOH 的图像如下所示 图1a.
    4. 打开相关的EDAX软件。
      注：相关软件可能因不同仪器的配置而有所不同。
    5. 点击 "开始记录新光谱" 在用户界面（UI）中收集EDX谱图。选择 "峰标识" 选择谱图中可能存在的元素。输入观察到的元素， 例如，本例中为氧，进入 "元素" 视野。单击 "添加" 将元素应用于谱图。
    6. 点击 "文件" 然后点击 "另存为"将光谱数据以所需的文件名保存为 .csv 格式，以便使用绘图软件进行后续作图。
    7. 重复步骤 5.3.3 至 5.3.6 的操作，以记录每个孔的 EDX 谱图。
    8. 完成每个孔的成像和谱图记录后，通过点击关闭电子束 "开启电子束" 按钮上的 "束流控制" 电子束成像区域开启时的页面。通过点击使SEM腔室通气 "通气" 在同一页上。打开腔室门后，移除所有胶带，小心地将样品从载物台上取下。
    9. 重复该步骤，使用去离子水和空微通道进行对照实验。

6. 绘制EDX谱图

  1. 将.csv谱图文件导入绘图软件。
  2. 以能量水平为横轴，以EDX接收并处理的强度为纵轴绘制谱图，以显示重建后的谱图，如图2a、2b和2c所示。

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结果

代表性结果展示了如何利用成像和分析技术对颗粒进行观察和分析 原位 液相SEM成像结合EDX分析。结果包括二次电子（SE）图像和EDX能谱。SE图像在100,000倍和200,000倍放大倍数下获得 图1. 图1a 展示了 AlOOH 的 SE 图像， 图1b 去离子水，以及 图1c 空通道中的孔洞。图像通过应用SE、8 keV加速电压和0.47 nA束流获得。所使用的屏幕分辨率为1,024 × 884，扫描速率为 30 µs相应地， 图2 显示在水中检测到的 AlOOH 颗粒的 EDX 谱图（图2a），去离子水样品（图2b...

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讨论

扫描电子显微镜（SEM）是一种在纳米（nm）尺度上以高分辨率对有机和无机材料表面进行表征的强大技术1。例如，它被广泛用于分析固体和干燥样品，如地质材料26和半导体材料27。然而，由于液体与电子显微镜所需的高真空环境不兼容，SEM在表征湿润和液态样品方面存在局限性1。对于含水样品，尤其是生物样品，SEM样品制备通常需要进行脱水或冷冻干燥处理2。因此，难以准确获取天然含水或液态样品的信息，因为在样品制备过程中可能会丢失其本征信息28,29。这些信息可能包括但不限于细胞内的生物活性、溶液中纳米颗粒的合成过程、复杂液体中颗粒的聚集行为以及电化学反应过程。尽管环境扫描电镜（ESEM）可在受控的蒸气环境中对含水样品成像，但其图像分辨率无法达到高真空模式下对固体样品进行SEM成像时的水平

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢太平洋西北国家实验室（PNNL）核过程科学计划（NPSI）-实验室自主研究与发展（LDRD）基金的支持。Sayandev Chatterjee 博士提供了合成的勃姆石颗粒。仪器使用权限通过 W. R. Wiley 环境分子科学实验室（EMSL）一般用户提案获得。EMSL 是由 PNNL 生物与环境研究办公室（BER）资助的国家级科学用户设施。PNNL 由 Battelle 公司为美国能源部（DOE）依据合同 DE-AC05-76RL01830 运营。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
碳镀膜仪Cressington208 Carbon配备厚度监测仪 MTM-10。
扫描电子显微镜（SEM）FEIQuanta 3D FEG提供高分辨率扫描电子显微成像和元素分析功能。
液相-真空界面分析系统（SALVI）太平洋西北国家实验室N/ASALVI 是一种独特的、与真空兼容的微流控芯片，可实现利用基于真空的科学仪器对液体样品进行表征。
PEEK 连接头ValcoZU1TPK聚醚醚酮连接头用于连接 SALVI 的进样口和出样口。
注射器BD3096591 mL
移液器赛默飞世尔科技21-377-821量程：100 至 1,000 mL
移液器吸头 1Neptune2112.96.BS1,000 µL
移液器吸头 2Rainin1700186520 µL
注射泵哈佛仪器70-2213用于将液体样品注入 SALVI 装置中。
pH 计费舍科学/accumet13-636-AP72用于测量去离子水中 AlOOH 的 pH 值。
Barnstead 超纯水系统，带 UV/UF 功能赛默飞世尔 BarnsteadNanopure diamond D11931用于制备去离子水。
离心管费舍科学/Falcon15-527-9015 mL
Bransonic 超声清洗器西格玛奥德里奇2510用于对 AlOOH 液体样品进行超声处理。
天平梅特勒-托利多11106015XS64
AlOOH太平洋西北国家实验室N/A由太平洋西北国家实验室的科研人员合成。
xT 显微镜控制软件FEIQuanta 3D FEGSEM Quanta 3D FEG 的默认显微镜控制软件。
EDAX Genesis 软件EDAXN/A该软件用于采集样品的 EDX 元素信息。
聚四氟乙烯（Teflon）管SUPELCO58697-U用于将样品引入微通道，并容纳足够的液体体积。

参考文献

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