方法文章

用于肽亲和试剂发现及分离株分析的细菌展示文库半自动生物筛选

13K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/56061

⸱

2017年12月6日

 ,  , 
1Sensors and Electron Devices Directorate, US Army Research Laboratory

本文内容

摘要

生物淘选细菌展示文库是发现肽类亲和试剂的一种成熟技术，可作为抗体的可靠替代方法。本文所述的半自动化分选方法简化了生物淘选流程，降低了假阳性结果的出现频率。本文将阐述在候选分子评估及减少下游分析工作量方面所采用的思路与技术。

摘要

利用细菌展示文库进行生物淘选是发现可识别生物与非生物靶标的多肽亲和试剂的有效技术。多肽亲和试剂可用于类似于抗体的应用，包括检测与治疗，但其稳定性更高，能够在更极端的环境中发挥作用。采用半自动化分选方法可增强针对目标蛋白的多肽捕获试剂的特异性富集，该方法优化了结合与洗涤步骤，从而降低假阳性结合物的出现频率。本文描述了一种适用于商用自动化磁激活细胞分选装置的半自动化分选方法，结合表达随机15肽的非限制性细菌展示分选文库使用。经过轻微修改后，这些方法可推广至其他自动化设备、其他分选文库以及其他生物体。本研究的主要目标是提供一套全面的方法学，并阐明在分析和最小化候选分子库过程中所采用的思维逻辑。这些技术包括使用荧光激活细胞分选（FACS）分析细胞表面结合情况，以评估分选过程中的亲和力与特异性，并用于比较单个候选分子；以及对多肽序列进行分析，以识别趋势和共有序列，从而理解并可能改进对目标分子的亲和力与特异性。

引言

生物淘选是亲和试剂发现的一种成熟技术，而细菌展示文库是获取肽类亲和试剂的便捷来源1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24。与噬菌体展示25,26和酵母展示27,28类似，肽段暴露于细胞表面，可结合生物性或非生物性靶标，其相互作用由肽骨架及氨基酸侧链的独特性质共同驱动29。与噬菌体展示不同的是，细菌自身具有自我复制能力，且携带展示所需全部遗传物质，无需洗脱结合的噬菌体并重新感染细胞。与酵母展示相比，细菌展示速度更快，因为大肠杆菌（Escherichia coli）的倍增时间极短（约20分钟30）。由此获得的肽类亲和试剂可在离体条件下生产，用于多种传感平台16,17,26，也可在细胞表面展示时作为活体材料使用2,31,32。与用于识别特定靶标的单克隆抗体相比，肽段体积更小、结构更灵活，且可在DNA水平上轻松操控肽展示文库，以避免特定氨基酸（如半胱氨酸）的出现33。由于肽类易于发现、可重复地进行合成（离体）生产，并在极端环境中仍能更好地保持性能，即使经历高温处理或长期无需冷藏储存后仍具备功能活性37,38，因此在治疗领域34,35,36及其他原本使用抗体的应用中正日益受到重视。克服试剂储存过程中对冷链依赖的能力，尤其受到美国国防部等机构的关注，因其需在极端环境下开展作业。因此，针对本文所列举的目标分子所开发的亲和试剂，热稳定性是一项理想特性。

近年来，利用半自动化的磁激活细胞分选（MACS 或 MCS）方法，细菌展示文库的生物筛选已变得更加简便且可靠9,14,39。这些方法已在多种相似但各有优势的分选平台上被验证可用于生物靶标，其中包括一种 commercially available 的自动化磁激活细胞分选（autoMACS 或 autoMCS）仪器（参见材料表）1,14,15，以及一些更专业化的设备，可将样品封闭在一次性 cartridge7,9 或芯片39中，这对于处理生物安全等级为 2 级（BSL-2）或更高的生物体或毒素而言是一项重要的技术指标7。如果目标材料具有磁性，或能够包被于磁珠表面，则这些半自动化方法也可拓展用于筛选能够结合非生物材料的多肽；此外，若调整分选与培养条件，该方法还可适用于不同类型的生物体（如厌氧细菌）。除了用于细菌展示文库的分选外，本文所使用的 commercial autoMCS 仪器还曾部分用于在酵母表面展示的人源单链抗体片段的初步筛选，后续再通过荧光激活细胞分选（FACS）进一步分离40。半自动化的主要优势在于显著缩短分选时间并减少人工操作，同时在洗涤步骤中更高效、更可重复地去除未结合的细胞，从而降低假阳性率，减少所需分选轮次，并简化后续分析流程9,14。对于 commercial autoMCS 仪器而言，其内置多种预设程序，可针对不同应用需求进行优化，例如负向预分选（去除非目标细胞）、优先提高纯度、最小化终末样品体积，或调节对稀有细胞分离的灵敏度41。

本研究的重点是展示如何使用市售的 autoMCS 仪器对细菌展示文库进行生物淘选，并阐述在分析和缩小候选分子池时所采用的思维过程，以促进该方法向其他应用的拓展。本研究所使用的展示文库（见材料表）12,13 包含约 109–1011 个独特的15肽，这些肽通过改造后的细菌外膜蛋白 OmpX 以无约束形式展示在细胞表面，若以合成方式生产，其性质预期与溶液中的游离肽相似。该蛋白支架在C末端还包含一个阳性对照P2X肽，可通过其与YPet Mona的结合来监测表达情况。然而，对于特定应用而言，只要具备足够多样性及其他必要特性的商用或新型文库，均可采用类似的生物淘选流程，尽管可能需要进行一些微小调整。本生物淘选方案的示意图见图1。此外，该方案也可适配于其他自动化磁性分选平台及其他分选策略。已有研究成功采用台式磁铁进行手动磁性分选，但因假阳性率升高，后续分析更为复杂且耗时14；尽管如此，若无自动化磁性细胞分选设备，手动方法仍可作为autoMCS步骤的替代方案。

方案

1. 使用 autoMCS 进行细菌展示文库的生物淘选

注意：本基于autoMCS的分选方案此前已有描述14，更详尽的"新用户扩展方案"可在本文的补充材料中获取，其中包含潜在修改方案的说明。若无法获得autoMCS设备进行分选，请参阅Sarkes et al. 2015年的补充方案，该文献中也描述了手动分选方案14。本文提供的autoMCS方案已进一步优化，增加了额外的阴性分选步骤，以提高特异性1,15。该生物淘选方案的示意图见图1。

  1. 负向筛选去除可能与磁珠发生交叉反应的结合物
    1. 接种约 1 x 10 的菌液至 500 mL 含适当抗生素的 Luria Broth Miller（LB）培养基中11多样化细菌展示分选文库的细胞（参见材料表）。
      注意：此处使用的细菌展示肽库（参见材料表）包含约109- 1011独特成员 8,12 并在含有25 µg/mL 氯霉素的LB培养基（LB Cm）中培养25）。本实验方案的其余部分均假设使用该文库。
    2. 在37 °C、225 rpm振荡条件下培养，直至菌液达到指定OD值600 0.5 - 0.55。通过将4%的母液按1:100稀释，加入终浓度为0.04%（w/v）的L-阿拉伯糖以诱导肽段表达，在37°C、225 rpm条件下振荡培养45分钟。
    3. 将诱导培养物置于冰上。离心约 2 x 1011 在4°C、6000 × g条件下离心20分钟，收集细胞。弃上清液，加入1.5 mL PBS，轻轻摇动重悬细胞。
      注意：OD600 约等于 1 x 10 的 1.09 细胞/毫升用于 E. coli.
      注意： 切勿涡旋震荡 以免细胞裂解；在 ≤ 225 RPM、4°C 条件下手动重悬或短暂振荡重悬。
    4. 将细胞转移至微量离心管中，在室温或4°C下以6,000 × g离心5分钟。弃去上清液。用1 mL含0.5%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS-B）重悬细胞沉淀。
    5. 洗涤300 µL链霉亲和素包被的磁珠（约3 x 109 珠粒，见材料表）加入 1 mL PBS-B，以 ≥5,000 × g 离心 5 分钟（室温）。将离心管置于台式磁性粒子分离器中，小心吸除上清液，避免触及沉淀。
    6. 将磁珠重悬于上述制备的细胞与PBS-B混合液中，在4°C旋转平台上孵育45分钟。将样品置于冰上。
    7. 打开autoMCS仪器以初始化系统。通过选择制造商提供的运行和清洗缓冲液（见材料表）来引液。 "立即清洗" 屏幕底部的 "分离" 菜单，然后 "冲洗" 和 "运行".
    8. 用 PBS-B 对系统进行预处理，在接下来的步骤中，同时使用 PBS-B 作为洗涤缓冲液和运行缓冲液。选择 "分离" 从上方导航栏的菜单中选择 "立即清洗"选择 "冲洗" 和 "运行" 用新鲜的PBS-B预冲洗系统。
    9. 将孵育步骤中的细胞和磁珠混合物转移至一个15 mL锥形管中。将该管放入预冷（4°C）的分选架的样本槽内，并在分选架的阳性选择槽和阴性选择槽中分别放入空的15 mL锥形管（参见材料表）。将分选架放置于仪器平台上。
    10. 为样品架上的每个样品指定分离程序（每次运行最多可处理5个样品）。添加 "冲洗" 每个样本之间以及最后一个样本之后均需执行此步骤。选择 "运行" 开始细胞分离。选择 "好的" 以确认有足够的缓冲液可用。
      注意： "Posselds" 分离程序适用于阴性分选以及第一轮阳性分选 "Posseld" 在第2至第4轮分选中更推荐使用，但这两个程序均已成功应用于所有阴性和阳性分选轮次 14,15 其他程序可能在特定应用中表现更优（详见讨论部分）。
    11. 程序完成后，取出层析柱并收集相应组分。此处进行阴性分选时，应保留阴性组分（含无磁珠细胞）。置于冰上。
    12. 使用全部阴性分选组分接种1 L LB 氯霉素培养基25 含0.2%（w/v）D-葡萄糖。在37 °C、225 RPM条件下振荡培养过夜。
    13. 关闭 autoMCS 仪器前，将运行缓冲液和清洗缓冲液更换为制造商指定的运行缓冲液和清洗缓冲液（参见材料表）。选择 "立即清洗"，然后 "冲洗" 和 "运行"完成操作后，务必确保消毒管路中有70%乙醇，然后按下 "电源图标" 屏幕右上角并选择 "是".
    14. 当系统关闭完成（瓶内液体呈紫色）时，关闭仪器。
    15. 第二天，利用过夜培养物制备冻存菌种，菌液浓度约为 1 x 1011每管加入含15%甘油的LB培养基，分装细胞。此外，也可将此培养物用于下一步：额外的阴性分选（第1.2节）或第一轮阳性分选（第1.3节）。
  2. 负向筛选以去除可能与其他目标抗原发生交叉反应的结合分子
    注意：如果无需或不希望进行进一步的阴性分选，可跳过第1.2节。在此情况下，请直接进入第1.3节。任何非目标分子的残余结合可通过FACS评估，方法见第2节：分选轮次的FACS分析。
    1. 针对特定蛋白质靶标（例如可能与所发现的肽段发生交叉结合的相似蛋白质）进行阴性筛选 1,15，重复步骤1.1.1至1.1.3，起始材料选用步骤1.1.15中链霉亲和素耗尽的文库冻存菌种，或步骤1.1.12中的过夜培养物（使用OD600 用于估算并接种 1 × 1011 细胞）
    2. 将细胞转移至微量离心管中，在室温或4°C下以6,000 × g离心5分钟。弃去上清液。用含600 nM生物素化交叉反应蛋白靶标的1 mL PBS重悬细胞沉淀，在4°C旋转平台上孵育45分钟。
      注意：600 nM 为建议的起始浓度，若观察到明显效果，可进行调整。可使用材料表中建议的试剂实现对目标蛋白的生物素标记，并进行定量检测。
    3. 同时，用 100 µL 链霉亲和素包被的磁珠（约 1 x 10⁷）进行洗涤9 在1 mL PBS-B中重悬珠子，于≥5,000 × g离心5分钟（室温）。将离心管置于台式磁性粒子分离器中，小心移除上清液，避免触及沉淀。
    4. 在6,000 × g下离心靶标结合的细胞5分钟（室温或4°C），弃上清，将细胞沉淀重悬于1 mL PBS-B中。将磁珠重悬于已洗涤并结合细胞的全部体积中  交叉反应性蛋白靶标。在4°C下于旋转平台上孵育30分钟。
    5. 将样品置于冰上，并完成步骤1.1.7至1.1.15进行阴性分选，制备相应的冻存菌种。若已完成所有预期的阴性分选，则继续进行第1.3节的阳性分选；否则，重复第1.2节，针对另一种可能的交叉反应蛋白进行阴性分选。
  3. 第一轮阳性筛选
    注意：针对特定蛋白靶标的第1轮阳性分选与针对特定分选靶标的阴性分选（见1.2）类似，不同之处在于保留含有磁珠的阳性组分。
    1. 接种500 mL LB 氯霉素培养基25 约 1 × 1011经链霉亲和素耗尽后过夜培养（来自步骤1.1.12）或冰上解冻的冷冻细胞（来自步骤1.1.15），或根据需要进一步耗尽对其他交叉反应蛋白靶标结合物的细胞（来自步骤1.2.5）的多样化细菌展示筛选文库。
    2. 在37 °C、225 RPM振荡条件下培养，直至菌液达到OD600 OD600 为 0.5 - 0.55 时，通过将 4% 储液按 1:100 稀释加入，使 L-阿拉伯糖终浓度为 0.04% w/v 以诱导肽段表达，在 37°C、225 rpm 条件下振荡培养 45 分钟。
    3. 将诱导培养物置于冰上。离心约 2 x 1011 在 4°C 条件下以 6,000 × g 离心 20 分钟。弃上清液，加入 1.5 mL PBS 轻柔涡旋重悬细胞（手动或在 ≤ 225 RPM 条件下短暂振荡，4°C）。
    4. 将细胞转移至微量离心管中，在室温或4°C下以6,000 × g离心5分钟，弃去上清液。
    5. 将细胞沉淀重悬于1 mL含有600 nM生物素标记的目标蛋白的PBS中，在4 °C下于旋转平台上孵育45分钟。
      注意：600 nM 为建议起始浓度，若观察到明显益处，可进行调整。可使用材料表中建议的试剂实现对目标蛋白的生物素标记，并进行定量检测。
    6. 同时，用 100 µL 链霉亲和素包被的磁珠（约 1 x 109 在1 mL PBS-B中重悬珠子，于≥5,000 × g离心5分钟（室温）。将离心管置于台式磁性粒子分离器中，小心移除上清液，避免触及沉淀。
    7. 目标孵育完成后，在6,000 × g离心5分钟（室温或4°C），以去除未结合的目标蛋白。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL PBS-B中。将磁珠重悬于所有已结合目标蛋白的洗涤后细胞悬液中。4°C旋转孵育30分钟，随后置于冰上。
    8. 打开autoMCS仪器以初始化系统。通过选择制造商提供的运行和清洗缓冲液（见材料表）来引液。 "立即清洗" 在分离菜单底部 "冲洗" 和 "运行".
    9. 使用 PBS-B 对系统进行预冲洗，在接下来的步骤中，将 PBS-B 同时用作洗涤缓冲液和运行缓冲液。从顶部导航栏中选择“分离”菜单，然后选择“立即洗涤”。选择“冲洗并运行”，以新鲜的 PBS-B 对系统进行预冲洗。
    10. 将上述孵育步骤中的细胞和磁珠混合物转移至一个15 mL锥形管中，用额外的500 µl PBS-B冲洗原管，将洗涤液合并入样本中。将该管置于样品槽内，并在阳性选择和阴性选择槽中各放入一个空的15 mL锥形管，置于预冷（4°C）的支架上（见材料表）。将支架放置于仪器平台上。
    11. 为样品架上的每个样品分配分离程序（每次运行最多可处理5个样品）。添加 "冲洗" 每个样本之间以及最后一个样本之后均需执行此步骤。选择 "运行" 开始细胞分离。选择 "好的" 或 "继续" 以确认有足够的缓冲液可用。
      注意： "Posselds" 分离程序在阴性分选和阳性分选第一轮中效果良好 "Posseld" 在第2至第4轮分选中更推荐使用，但这两个程序均已成功应用于所有阴性及阳性分选轮次 14,15 其他程序可能在特定应用中表现更优（详见讨论部分）。
    12. 程序结束后，取出层析柱架并保留相应组分。此处对于阳性分选，应保留阳性组分（含细胞和磁珠），置于冰上。
    13. 关闭 autoMCS 仪器前，需将运行缓冲液和清洗缓冲液更换为制造商指定的运行缓冲液和清洗缓冲液（参见材料表）。选择 "立即清洗"，然后 "冲洗" 和 "运行"完成操作后，务必确保去污染管路中有70%乙醇，然后按下 "电源图标" 屏幕右上角并选择 "是".
    14. 当系统关闭完成（瓶内液体变为紫色）时，关闭仪器。
    15. 使用全部阳性分选组分接种1 L LB 氯霉素培养基25 含0.2%（w/v）D-葡萄糖。在37 °C、225 RPM振荡条件下过夜培养。
    16. 第二天，利用过夜培养物在含有15%甘油的LB培养基中制备冻存菌种，和/或继续进行第1.4节中的第二轮阳性分选。
  4. 后续阳性分选轮次
    注：通常建议进行四轮分选，但一般进行三轮分选已足够 14,15何时停止分选可参考第2节所述的分选轮次FACS分析结果。每进行一轮后续的阳性分选，目标细胞浓度和磁珠体积均会逐渐减少。
    1. 使用上一轮分选的过夜培养物（或该轮次的冷冻细胞储备液），接种于5 mL LB 氯霉素培养基中25 用100 µl细胞（1:50稀释）。在37°C、225 rpm振荡条件下培养，直至菌液达到OD600 0.5 - 0.55
    2. 用0.04%（w/v）L-阿拉伯糖诱导肽表达，在37°C、225 rpm条件下振荡培养45分钟。将诱导后的细胞置于冰上。
      注意：该诱导培养物也可用于评估其来源分选轮次的结合亲和力和特异性，具体方法见下文第2节。
    3. 离心 1 × 108 在室温或4 °C下以6,000 × g离心5分钟，收集细胞。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于50 µL PBS中，PBS中含有所需生物素化目标蛋白浓度的一半（根据建议的起始浓度，第二轮为300 nM，第三轮为150 nM，第四轮为75 nM）。冰上孵育45分钟（或在4 °C旋转平台上孵育）。
    4. 同时，将链霉亲和素包被的磁珠（第2轮15 µL，第3轮8 µL，第4轮4 µL）用1 mL PBS-B缓冲液洗涤，于≥5,000 × g离心5分钟（室温）。将离心管置于台式磁力架上，小心吸除上清液，避免触及沉淀。用50 µL PBS-B缓冲液重悬磁珠。
    5. 在步骤1.4.3中与靶标孵育45分钟后，于室温或4°C以6,000 × g离心5分钟，弃上清，将细胞重悬于步骤1.4.4中洗涤后的50 µL磁珠中。样品置于冰上，并完成步骤1.3.7至1.3.13以进行阳性分选。
    6. 接种5 mL LB 氯霉素培养液25 补充0.2%（w/v）D-葡萄糖，并加入分选所得全部含珠的阳性组分。
    7. 第二天，利用过夜培养物在含有15%甘油的LB培养基中制备冻存菌种，和/或继续进行下一轮阳性分选，返回步骤1.4.1。
      注意：使用1.4.2步骤中诱导培养的样品，按照下文第2节所述评估结合亲和力和特异性，有助于确定何时停止分选。若连续两轮分选显示相似的结合亲和力，或后续轮次中对目标分子的结合亲和力下降，则宜在此时停止分选。完成最后一轮后，返回步骤1.4.1，但停止于1.4.2。

2. 分选轮次的流式细胞分析

  1. 使用第1.4.2步中每个分选轮次的诱导细胞，或使用相同的培养物，将5 µL诱导细胞加入25 µL以下各预配溶液中以进行结合能力评估（参见材料表）：仅含PBS的溶液；含150 nM YPet Mona的PBS（YPet 12,13；表达阳性对照，如可获得）；与荧光染料偶联的900 nM蛋白靶标，例如发射/激发波长为493 nm⁄518 nm的胺反应性染料（Target-488）；用于阴性分选的900 nM交叉反应蛋白靶标（Cross-Reactive Protein-488），使用相同的荧光染料标记；以及900 nM链霉亲和素-R-藻红蛋白（SAPE）。冰上孵育45分钟。
    注意：若直接从第1.4.2步继续操作，则此步骤总是在该轮生物淘选完成后的第二天进行，因为筛选后的文库需过夜培养，次日再进行传代和诱导。也可使用从冷冻保存的各轮分选文库中同样培养并诱导的细胞；在此情况下，所有轮次可在单次实验中同时测试和比较。
  2. 在室温或4°C下以6,000 x g离心5分钟。弃去上清液，并将样品置于冰上保存。
    注意：细胞沉淀可在冰上保存，直至所有样品均准备就绪进行分析。
  3. 开启FACS仪器，打开软件，启动系统，并按照制造商说明进行仪器校准43,44。
  4. 在FACS软件中，点击"Administrator"，选择所需文件夹或创建一个"New Folder"。点击屏幕左上角的"New Experiment"图标。右键点击该图标以"rename"重命名实验。在该实验内，点击"Global Worksheets"。
  5. 点击"Dot Plot"图标，然后点击全局工作表电子表格以创建该散点图。点击散点图本身，然后选择屏幕左上角的"Inspector"图标，并在弹出窗口中勾选"Y Axis"和"X Axis"，将坐标轴调整为双指数显示。点击X关闭双指数显示窗口。
  6. 通过点击屏幕左上角的图标创建一个"New Tube"，然后在"global worksheet"下方右键点击样本图标并选择"rename"，输入适当信息重命名样本。点击(+)号展开样本，然后双击试管图标，右键点击并再次选择"rename"以描述该样本。
  7. 使用默认的SSC-A vs FSC-A散点图，通过双击该试管或点击其旁边的箭头运行仅含PBS的阴性对照样本。在运行样本前，将细胞沉淀重悬于500 µL冰上预冷的FACS运行缓冲液中，并转移至FACS管（参见材料表），通过移液和轻弹管壁充分混匀。将重悬的细胞置于仪器的样本进样管（SIT）上。点击“Acquire Data”，设置“Events to Display”为30,000 - 50,000，“Events to Record”为10,000，流速设为低速（初始设置；必要时可提高），并选择“SIT flush”。
    注意：适当的速度（低、中或高）应使每秒事件数（events/s）保持在约200至2000之间。  所有步骤均应使用此范围。
  8. 在采集过程中，如有需要，通过选择"Threshold"选项卡并点击和更改"Value"来调整光电倍增管（PMT）电压阈值。调节前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）的电压，使仅含PBS的阴性对照细胞略低于中心位置。
    注意：可在"Threshold"选项卡中使用"add"图标添加其他参数（如SSC）。通常，对于E. coli，SSC和FSC的PMT电压在700 V至1000 V之间效果良好。
  9. 若样本读数正常，调整流速使每秒事件数显示为200-2000，然后点击"Record Data"。记录完成后，将试管从SIT上取下并置于冰上。  选择"Polygon Gate"图标，使用鼠标在散点图中围绕大部分细胞群绘制门控区域。右键点击散点图并选择"Show Population Hierarchy"。
  10. 通过在群体层级中点击"P1"，将此"P1"门控设为父代门。按照步骤2.5创建一个新的散点图。右键点击每个坐标轴，将Y轴改为FITC-A，X轴改为FSC-A。使用"polygon gate"图标对阴性对照（仅含PBS）进行门控，门控区域应尽可能紧密地围绕群体的上方和左侧。
    注意：请再次检查群体层级，确保P1门是P2门的父代。若不是，则P2门将与P1门并列，且"All Events"将成为其父代；此时应删除该门并按照步骤2.10重新创建。
  11. 在群体层级中选择"P2"，右键点击并选择"invert gate"。右键点击带有P2门的散点图并选择"Show Populations"。选择显示"P2"和"Not P2"两个群体（落在门控外的细胞应少于1%）。
  12. 右键点击带有P2门的散点图并选择"Create Statistics View"。右键点击统计视图窗口并选择"Edit Statistics View"。点击"Populations"选项卡，根据需要添加或删除群体，包括父代群体P1（P2和Not P2应已显示）。点击"Statistics"选项卡，添加"FITC-A Median"及其他感兴趣的统计参数。点击OK关闭窗口。
  13. 为PE-A vs FSC-A创建类似的散点图，并使用仅含PBS的样本进行门控（可复制并修改之前的图）。使用该电子表格以相同方式运行所有样本（包括与每种荧光标记靶标孵育的阴性对照细胞），每样本记录约10,000个事件。
    注意：与Target-488蛋白、YPet阳性对照等孵育后落在门控外的细胞即为对该蛋白具有结合能力的细胞，"Not PX"（其中X为该图中门控群体的编号）的数值应记录为结合百分比（% bound）。当使用SAPE作为阴性对照时，使用PE-A vs FSC-A图。还应记录P1的中位荧光强度（MFI），因其可提供超出结合百分比的信息，以相对方式反映结合程度，且在存在离群值时更具稳健性45。中位荧光强度可通过将每个肽段的MFI除以仅含支架的阴性对照（无N端肽段）或已知不结合目标靶标的肽段克隆的MFI进行归一化（nMFI），该阴性对照需与相同荧光标记的靶标孵育14。若此类阴性对照细胞不可获得，也可使用与相同靶标和相同荧光染料孵育的未诱导细胞进行归一化。

3. 潜在候选序列的分析及结合亲和力评估

  1. 肽序列测定
    1. 从生物淘选的最终轮次（通常第3轮和/或第4轮已足够）中挑选并测序数十至数百个细菌菌落 14).
    2. 使用我们开发的宏文件分析序列数据（代码详见支持信息， "子程序 eCPX 测序") 专门用于分析通过生物淘选材料表中所列的15肽细菌展示文库所产生的序列。使用材料表中列出的电子表格软件或其他首选的兼容软件。
      注意：有许多在线工具也可辅助进行DNA序列分析 47如 preferred，可采用其他 established 方法进行序列分析，并直接跳至步骤 3.1.3。
      1. 下载序列文件集（.seq 文件，文本文件也可用），并将其解压到一个新文件夹中。如有必要，将该文件夹移动或复制到计算机的本地硬盘驱动器上（而非网络文件夹），以提高运行速度。
      2. 打开一个新的电子表格窗口。如果弹出相关提示，请确保启用宏并启用所有功能。
        注意：步骤 3-6 以下内容仅需在首次使用宏时完成。对于后续分析，直接 "运行宏" 从第7步开始。
      3. 复制在宏中找到的全部内容 "子程序 eCPX测序" 文件。
        注意：当前版本已设置为使用材料表中所列15-mer文库的侧翼序列，并将翻译其间的氨基酸。在运行宏之前，可通过在电子表格的A列粘贴最多10个5'侧翼序列、B列粘贴最多10个3'侧翼序列，以输入额外序列。
      4. 在空白的电子表格文件中，选择 "查看" 标签，然后双击 "宏" 选择 personal.xlb 文件夹。如果该文件夹不可见，请先录制一个宏以使其显示。
      5. 点击 "创建" 或 "步入"，取决于需要突出显示的内容。将整个宏粘贴到模块中。
      6. 单击保存图标，或进入文件菜单并选择保存。退出模块。如果弹出窗口，按确定。
      7. 运行宏：转到所需.seq文件所在的文件夹。点击顶部文件夹图标旁的栏以查看文件夹路径，复制该路径。
      8. 转到新的电子表格窗口。选择“视图”选项卡，然后双击“宏”。选择 "eCPX测序" 从列表中选择并点击 "运行。"
      9. 在弹出的对话框中，粘贴第7步复制的文件路径，然后按回车键。宏将开始处理序列，并将它们整理到不同工作表的表格中。
      10. 使用 "摘要表" 以确定是否需要检查追踪文件中的错误并进行手动校正（如果序列包含 "X" 或无法翻译。
        注意： "摘要表" 显示翻译后的肽序列，按氨基酸序列（从A到Z）排序，除非测序错误导致无法翻译。 "X" 表示无法确定的单个氨基酸。
    3. 序列翻译、整理并校正所有测序错误后，检查已排序的肽序列列表 "摘要表" 检查表格中是否存在重复序列。
    4. 将目标测序菌落（至少包括重复样本及呈现明显趋势的多肽）在 5 mL LB 氯霉素培养基中过夜培养25 在37°C、225 RPM振荡培养，次日按步骤1.4.7制备含15%甘油的LB冻存菌种。使用第3.3节所述FACS方法检测重复序列肽段的结合亲和力与特异性，并以FASTA格式的序列列表（完整列表及仅重复序列）按第3.2节推荐的比对与分析程序进行序列比对。
  2. 使用 Clustal Omega、Kalign 及类似程序进行序列比对
    1. 从宏的FASTA电子表格中复制FASTA格式的序列，或根据待比对序列（如步骤3.1.3中的序列）创建FASTA文件列表。
      注意：A 列按数字顺序包含 FASTA 文件 "序列编号 #" 而B列则按其排序显示 "氨基酸序列" 从 "摘要表" 片。按氨基酸序列排序的肽段序列列表会将不可用序列显示在顶部，例如空载体（如 "# 空"）以及未发现5'或3'搜索条件的序列（作为 "# 价值"这一特性便于从分析中轻松更新或移除这些序列。
    2. 打开 Clustal Omega48 或 Kalign49 通过访问网站获取软件 50,51，或使用其他偏好的序列比对软件。复制FASTA格式的序列列表，并将其粘贴到下方输入框中 "任何支持格式的序列". 变化 "空位开启罚分" 至30以下 "更多选项" 在 Kalign 中进行（Clustal Omega 不支持此操作），其余设置保持默认，然后点击 "提交".
    3. 使用 Jalview 分析序列比对 52,53 通过在 Clustal Omega 和 Kalign 在线软件中选择 "结果概述" 对齐上方的标签，然后单击 "Jalview" 图标。
      注意：如果需要，或需分析由其他程序生成的序列比对结果，可下载 54 分别打开软件，并将比对结果复制粘贴到分析窗口中，该窗口通过点击打开 "文件", "输入比对"，以及 "来自文本框"这提供了一种简便的方法，用于判断输入序列比对中是否存在共识序列。
  3. 使用流式细胞术比较结合亲和力与特异性
    1. 接种5 mL LB 氯霉素培养基25 添加0.2%（w/v）D-葡萄糖，并分别加入感兴趣的各个分离株（来自步骤3.1.4和/或第3.2节进一步序列分析中感兴趣的菌落）， 等等。）以及适当的阴性对照（仅展示支架或不结合靶标的肽段，参见步骤2.13的注释）。在37 °C、225 RPM振荡条件下过夜培养。
    2. 使用过夜培养物接种 3 mL LB 氯霉素培养基25 用60 µl细胞（1:50稀释）。在37°C、225 RPM振荡条件下培养，直至菌液达到OD600 0.5 - 0.55。加入0.04%（w/v）L-阿拉伯糖和2 mM EDTA以诱导肽段表达（有助于肽段展示） 42），在37°C、225 rpm条件下振荡45分钟。
    3. 将诱导培养物置于冰上。对于每个分离株，取5 µL细胞加入25 µL PBS中，或加入含有150 nM YPet的PBS中。 12,13 （如有，作为表达的阳性对照）；250 nM Target-488；250 nM Cross-Reactive Protein(s)-488；以及 250 nM SAPE（详见步骤 2.1）。冰上孵育 45 分钟。
    4. 在室温或4°C下，以6,000 × g离心细胞5分钟。从沉淀对侧小心吸去上清液。将细胞沉淀置于冰上保存，直至所有样品均准备好进行分析。
    5. 将每个细胞沉淀重悬于500 µL预冷的FACS运行缓冲液中，在使用流式细胞仪检测前，通过移液和轻弹管壁充分混匀（见材料表）。
      注意：有关门控和计算nMFI以比较结合亲和力与特异性的进一步说明，请参见步骤2.13的注释。目前可将无结合信号或非特异性结合的样本从后续分析中剔除，而最高亲和力的结合分子应按照第3.2节进行序列比对，以识别在初始测序群体中可能被遗漏的潜在规律。随着新趋势和共识序列的发现，可重复执行第3.2和3.3节的分析。若未观察到明显趋势，该分析可纳入更多随机序列进行。

结果

与手动磁性细胞分选相比，采用自动化磁性激活细胞分选（autoMCS）可显著减少细菌展示文库在生物筛选过程中产生的假阴性候选物9,14。可根据需要增加阴性分选步骤，以减少对目标分子的非特异性结合物；建议至少在前期增加针对磁珠本身的阴性分选。如图2所示，在对选定的细菌展示文库进行四轮针对保护性抗原（PA）结合物的生物筛选之前，已完成了针对磁珠本身的阴性筛选；此外，如图3所示，在针对rivax进行额外的阴性筛选以及对abrax进行四轮阳性筛选之前，也执行了该步骤。此处使用的磁珠偶联有链霉亲和素，用于捕获生物素标记的蛋白质，因此需关注可能意外分离出与链霉亲和素本身结合的肽段，并可通过流式细胞术（FACS）使用与藻红蛋白偶联的链霉亲和素（图3，SAPE）进行监测。在评估候选肽段对目标蛋白的结合能力时，至少应对任何有前景的个体候选物检测其对链霉亲和素的结合情况。在所有分选轮次中，SAPE的结合百分比和归一化平均荧光强度（nMFI）均应保持在较低水平。随着每轮分选的进行，对链霉亲和素的结合水平可能略有上升，如图3所示，这是因为在每轮分选后，细胞群体反复暴露于包被链霉亲和素的磁珠所致。如果链霉亲和素的背景结合水平对后续分析造成干扰，可在链霉亲和素结合群体增加的阳性分选轮次之后，进一步实施针对磁珠的阴性分选，以减少假阳性候选物在后续筛选中的出现。当存在可能因结构和/或序列相似性而与目标分子的亲和试剂发生交叉反应，或可能特异性干扰肽段在特定应用中下游使用的蛋白质或材料时，建议进一步针对该蛋白质或材料进行阴性分选。例如，由于abrax与rivax在结构和序列上具有同源性，因此在分离abrax结合肽之前，建议先对rivax进行阴性分选1,15。同样，可通过FACS分析各轮分选结果，监测候选肽段是否与用于阴性分选的蛋白质发生交叉结合（图3，Rivax-488）。理想情况下，结合百分比和nMFI均应维持在较低水平，如本示例所示。

若有固定阳性对照肽（例如，在代表性结果中所用细菌展示文库产生的展示支架C末端的P2X肽），则有助于判断FACS实验中缺乏结合亲和力是由于展示支架本身表达缺失，而非肽段对靶标的亲和力不足。 图2 和 图3，通过监测YPet Mona与该P2X肽的结合发现，早期筛选轮次中支架蛋白的表达水平较低。这很可能主要归因于随机文库中N端肽段含有终止密码子的频率较高，导致支架蛋白本身未能被表达。此外，其他因素也可能产生影响，例如某些肽段可能对细胞具有意外的毒性作用 E. coli，或由于其他原因（如细菌基因组中的突变）导致生长减缓或肽段展示率降低。在诱导过程中添加EDTA可能有助于在早期分选轮次中提高表达水平 42，但尚未经过测试。在每轮生物筛选群体中，与YPet Mona的结合能力在第3轮时显著增强。比较 图2 至 图3，同样明显的是，通过将诱导时间延长至90分钟（如在 图2，YPet Mona）而不是 45 分钟（如在 图3，YPet Mona），尽管通常45分钟已足够。请注意，YPet Mona的nMFI已归一化至阴性对照细胞的YPet Mona结合水平，因此若表达水平合适，其值通常接近1.0。将同一标本中YPet Mona的MFI归一化至仅PBS的MFI也是一种有效的比较相对表达水平的方法，但所得数值会显著更高（比较 图2 和 图3 与 来自Sarkes的结果 等 2015 15).

通常在三轮阳性筛选后即可实现文库中结合特定目标靶点的肽段富集，但如图所示，继续进行第四轮筛选可能更有利。 图2 和 图3在此，对于两个示例靶标PA和abrax（图中以红色方框标出），结合细胞百分比和nMFI从第3轮到第4轮持续增加 图2 和 图3，分别。最高亲和力的肽序列可能在第3轮中已经存在，但在第4轮中可能进一步富集，这有助于对潜在候选序列进行缩小筛选 14第4轮的序列分析通常会揭示出重复序列，这些重复序列是进行亲和力与特异性分析以及确定共识序列的极佳起点。本文随附提供的eCPX_Sequencing宏有助于简化这一初步分析过程，如图所示 图4从包含 .seq 或文本文件的文件夹开始，位于选定的 5' 和 3' 序列之间的 DNA 序列将被翻译，并按氨基酸序列进行整理，分析每条肽段中各个氨基酸残基的数量。经排序后的分离肽段序列列表，如“汇总表”工作表截图所示 图4，可用于轻松确定哪些序列重复以及重复频率。该电子表格中包含重复序列的单元格已用不同颜色标出，以便于分析。建议对这些重复序列检查其保守序列及其他趋势。可借助Kalign和Clustal Omega等序列比对软件辅助分析，分析可针对全部序列输出结果（包括重复和非重复序列及其出现频率）进行，也可针对筛选出的重复序列列表（无论是否包含其相对频率）进行。图中展示了PA和abrax重复序列的代表性结果，未考虑频率因素。 图5A 和 5B，分别。请注意，在 图5A 对于PA靶标，多个单独的重复序列本身包含共识序列WFCFTC（或类似序列），该序列以红色下划线标出，是通过对重复序列进行Kalign序列比对后，应用Jalview软件分析确定的。该共识序列以WXCFTC形式此前已被确定为PA结合共识序列，这为筛选方法的可靠性提供了支持 9在 图 5B，其中对abrax靶标的重复序列以相同方式进行了分析，结果却大不相同。首先，在针对abrax结合物的第四轮生物淘选中，仅有五个序列重复出现，而针对PA结合物的第四轮生物淘选中则分离出十五个重复序列（尽管PA组额外测序了44%更多的菌落）。其次，这五个重复序列中均未包含最具潜力的 "共识" 序列（FWAWF，紫色下划线），尽管候选物AX-A15包含最匹配的序列（FWDTWF）。进一步的分析，包括结合亲和力和特异性测定，有助于从排名前五的候选物中确定与abrax结合的共识序列为FWDTWF 图5C，如下所述。

每个重复序列的一个代表性克隆可通过流式细胞术（FACS）进一步分析其在细胞上的亲和力和特异性，如图6A所示，该图展示了针对abrax结合肽进行生物筛选时获得的重复序列的结果。此处可以明显看出，所有五个重复序列对预期靶标abrax的亲和力均高于对结构相似但用于阴性分选的蛋白rivax，也高于因生物筛选过程中使用的磁珠而存在的链霉亲和素（streptavidin）。这一结果与图3中已显示出的良好亲和力和特异性结果一致，在图3中可以清楚地看到，随着每轮生物筛选的进行，对目标蛋白abrax的富集程度逐渐增加，而对结构相似蛋白rivax的亲和力则未见增强。然而，仅使用第四轮筛选获得的重复序列时，并未能确定出令人满意的共有序列（见图5B及上述讨论）。但当重新检查第四轮筛选获得的100个测序克隆时，通过目视比对发现，其中一个额外候选序列AX-A12含有与预测共有序列最匹配结果相似的FWDTWF序列（该序列此前已在克隆AX-A15中发现），而另一个候选序列AX-A14则含有类似序列DWNTWF。这些序列以及其他一些与重复序列具有相似性、与其他非重复序列具有相似性或随机选取的序列，均通过FACS分析了其结合亲和力和特异性。相关测试结果已在Sarkes et al. 2016 1中列出，其中本分析中亲和力最高的前五个结合序列如图6B所示，最终确定的共有序列为FWDTWF，如图5C所示。

对识别PA靶标的肽段在第四轮生物淘选中重复肽序列的结合亲和力进行类似分析，结果表明，根据PA-488 nMFI与SAPE nMFI比值排序的最佳结合肽段含有WXCFTC共识序列或类似序列表1）。利用该比值，序列自动分为包含共识序列和不包含共识序列的两类。所有含有与共识序列相关序列的候选序列作为优先候选，其分析方法与上述阿布拉克辛（abrax）的分析方法类似。 图6，如Sarkes中所述 等 2015 14这些结果表明，对于某些靶标而言，分析具有重复序列的肽段可能足以获得对特定靶标具有显著亲和力和特异性的结合物，并确定一个本身可能足以介导结合的共识序列。然而需要注意的是，重复次数并不一定反映与目标靶标结合亲和力的相对强弱表1）。当仅分析重复序列不足以确定某种模式时，交替进行序列分析与结合分析将有助于缩小候选序列范围，并重新审视高亲和力候选序列中的趋势。即使仅通过分析重复序列观察到了某种趋势，进一步研究仍可能发现额外的非重复序列表现出相同或不同的趋势。

figure-results-1
图1：细菌展示文库生物淘选流程示意图。 如图所示，细菌展示文库的生物淘选是一个循环过程。细菌展示文库中的每个细胞（参见材料表）均含有质粒DNA，只要在含有质粒所携带抗性基因对应抗生素（本例中为氯霉素）的培养基中培养，质粒DNA即可保留在细胞内。每个质粒还编码一种展示支架蛋白，可将随机肽段暴露于细胞外表面。由于每个细胞通常仅含有一种质粒DNA序列，因此每个细胞应仅在细胞膜多个位置展示一种肽段。根据生物淘选开始时及每轮筛选后文库的多样性水平，不同细胞间的DNA序列可能相同也可能不同。生物淘选首先通过培养并诱导细胞文库，使其在细胞外膜展示各自的肽段。这些肽段可与靶蛋白（经生物素化或其他标记以便捕获）发生相互作用。对于磁激活细胞分选（MCS），先去除未结合的蛋白，然后将细胞与包被有捕获蛋白的磁珠（本例中为链霉亲和素，其与生物素具有强相互作用）共同孵育。随后将整个培养物置于磁场中，以分离结合磁珠的细胞与未结合的细胞。推荐使用自动化磁分选装置进行细胞分离，以减少假阳性结果。图中展示的是正向分选，即保留与磁珠结合并随磁珠共洗脱的细胞。对于通常在前期进行的负向分选，操作流程相同，但保留的是被冲洗下来未与磁珠结合的细胞。所关注的文库组分（结合细胞，即正向分选；或未结合细胞，即负向分选）经 overnight 培养后用于下一轮筛选。每一轮后续的正向生物淘选均需降低靶蛋白浓度和磁珠体积，以提高筛选严谨性。每轮生物淘选后，通过荧光激活细胞分选（FACS）评估肽段对靶蛋白的亲和力与特异性，以帮助判断何时终止生物淘选并开始对单个候选肽进行研究。必要时进行DNA测序和肽段序列分析。这些分析步骤本身也可能构成一个循环过程，尤其是在最终轮次生物淘选后揭示单个克隆中的序列趋势时。此时，肽段序列的趋势和/或共有序列将与结合亲和力和特异性相关联。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-2
图2：FACS分析筛选轮次的示例数据：PA靶标。 通过四轮生物淘选（正向分选），从选定的细菌展示文库中筛选出与靶标保护性抗原（PA）结合的肽段，并通过FACS测定其结合亲和力。该过程首先对链霉亲和素包被的磁珠进行负向分选。在结合能力评估中，细胞经0.4% L-阿拉伯糖诱导90分钟，随后与靶标溶液和对照溶液孵育，并通过FACS分析。图中以红色框标出针对目标靶标的结合亲和力分析结果。图中显示了FITC-A与FSC-A的散点图，以及经以下处理后诱导细胞的结合细胞百分比（相对于仅与PBS孵育的门控阴性对照）和标准化中位荧光强度（nMFI，相对于与相同荧光标记蛋白孵育的无肽阴性对照）：仅PBS缓冲液、150 nM YPet Mona（肽表达阳性对照）或250 nM PA-488（标记靶标），孵育时间为45分钟。注意，经过每一轮生物淘选后，对目标靶标的结合亲和力逐步增强。与图3不同，所有autoMCS细胞分选均使用Posselds程序完成。部分数据也可在Sarkes 等 201514中以FITC-H与FSC-H的散点图形式展示，可与本文所示的FITC-A与FSC-A图进行比较。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-3
图3：分选轮次的流式细胞术分析示例数据：abrax靶标。 与图2类似，此处展示了通过流式细胞术（FACS）测定的完整生物淘选实验中的相对结合亲和力。细菌展示文库首先经过包被链霉亲和素的磁珠进行阴性分选（如图2所示），随后在进行针对目标靶标abrax结合肽段的四轮阳性生物淘选之前，额外增加了一轮针对结构和功能相似的同源蛋白rivax的阴性分选。在结合能力评估中，细胞在与靶标、阳性对照及阴性对照结合前，使用0.4% L-阿拉伯糖诱导45分钟，随后在流式细胞仪上检测。目标靶标的结合亲和力以红色方框标出。图中显示了FITC-A与FSC-A（或SAPE情况下为PE-A与FSC-A）的散点图，以及与仅用PBS孵育的门控阴性对照相比，经诱导并孵育45分钟后细胞的结合百分比和nMFI值，所用处理包括：仅PBS缓冲液、150 nM YPet Mona（肽段表达的阳性对照）、250 nM Abrax-488（标记的蛋白靶标）、250 nM Rivax-488（可能交叉反应的标记蛋白靶标）或250 nM SAPE（针对链霉亲和素包被磁珠直接结合的阴性对照）。注意，在每轮生物淘选后，对目标蛋白abrax的结合亲和力逐步增强，而对结构相似蛋白rivax的结合亲和力极低。与图2不同的是，第一轮阳性生物淘选采用autoMCS Posselds程序进行，后续分选轮次则按照本文建议使用Posseld程序完成。该数据也可在Sarkes 等 2016年的研究15中以FITC-H与FSC-H的散点图形式可视化，以便与本图所示的FITC-A与FSC-A图进行比较。请点击此处查看此图的放大版本。

figure-results-4
图4：使用“eCPX_Sequencing”宏进行序列分析的示例输出。 图中显示了采用Posselds方法对选定的细菌展示文库进行第四轮生物淘选后，所获得的48个克隆的测序结果截图。此处展示的是“汇总表（Summary Table）”工作表。请注意，这些克隆在测序过程中根据其文件名的字母顺序进行了编号，且至少重复一次的序列被不同颜色的框线标出，以便于数据分析。“eCPX_Sequencing”宏作为补充代码文件提供。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-5
图5：两种不同蛋白质靶标的序列比对及共识序列确定。 所示图像均使用Kalign在线分析软件进行序列比对后，再通过Jalview软件并采用Clustal_X着色方法生成51。A）PA生物淘选第4轮中重复序列的比对结果（对应于表1）。B）abrax生物淘选第4轮中重复序列的比对结果（对应于图6A）。C）根据FACS对单个候选序列的分析结果，从abrax生物淘选第4轮中筛选出的前5个候选序列的比对结果（对应于图6B）。在A和C中，红线标注了共识序列；而在B中，紫线标注了仅基于重复序列分析所确定的abrax结合共识序列的前体序列，提示在某些情况下，需在确定共识序列前通过FACS检测结合亲和力。使用不同分析软件生成的类似比对结果可参见Sarkes et al. 2015 14 和 Sarkes et al. 2016 1。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-6
图6：通过FACS分析的单个候选分子结合亲和力与特异性的示例。 图中显示了通过FACS测定的归一化中位荧光强度（nMFI），分别为A）重复序列和B）前5个候选分子，这些候选分子是根据第四轮生物淘选中对靶标abrax的相对结合亲和力确定的。数据代表了三次独立重复实验的平均值（柱状图）和标准差（误差线）。请注意，图中所有候选分子对abrax（abrax-488，绿色柱）均表现出较高的特异性，而对结构相似的蛋白rivax（Rivax-488，红色柱）以及链霉亲和素阴性对照（SAPE，黑色柱）的结合较弱。尽管A部分中的两个重复序列（AX-07和AX-15）也出现在B部分的前5个候选分子中，但A与B结果的比较表明，仅分析重复序列可能不足以筛选出亲和力最高的肽段。此处展示的数据改编自Sarkes et al. 2016 1。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-7
表1：各重复候选序列的特异性结合与非特异性结合比率。 本示例展示了来自PA生物淘选第4轮的重复候选序列的重复次数，以及PA（靶标）nMFI与SAPE（阴性对照）nMFI的比值。数据按PA nMFI与SAPE nMFI的相对比值排序，并分析其中是否存在已知的WXCFTC共识序列或类似序列，此类序列以粗体并加下划线标出。可见，序列呈现自我归类现象：含有共识序列的候选序列具有最高的PA nMFI:SAPE nMFI比值，因而与靶标发生更特异性的相互作用。所示结果来自一次单独的FACS实验。在Sarkes et al. 201514发表的研究中，对靶标亲和力最低的肽段未被纳入后续重复实验及分析。

补充文件 1：请点击此处下载该文件。

补充文件 2：请点击此处下载该文件。

讨论

利用细菌展示文库进行生物淘选（biopanning）已被证明是分离亲和试剂的有效方法，而多肽在需要特定条件（如在极端环境中保持稳定性）时，可作为识别分子的有用替代抗体的选择。通过本文所述的自动磁性细胞分选（autoMCS）方法，这些文库的生物淘选过程已得到简化，且市售的autoMCS平台进一步将该技术推广至更广泛的用户群体。与传统的交替使用磁性细胞分选（MCS）和荧光激活细胞分选（FACS）的方法相比，autoMCS方法成本更低，因其无需购置价格更高的FACS分选仪器来分离结合细胞，而仅需使用本文所采用的仅具备分析功能的流式细胞仪即可14。通过autoMCS实现成功生物淘选的关键步骤包括：分选程序的选择、针对潜在交叉反应物进行阴性分选以减少假阳性结果、利用FACS监测文库富集程度以确定生物淘选的终止时机，以及对候选克隆池进行智能分析，以避免对数百个候选子进行繁琐的筛选。

本文所述实例展示了针对两种不同靶标PA和abrax，成功对选定的细菌展示文库进行生物淘选的结果，尽管由于四轮生物淘选后各候选克隆池的肽序列存在差异，分析策略略有不同。PA的分析相对直接，通过对144个克隆中至少重复出现一次的肽序列进行分析，可明显观察到序列趋势。仅此一点就足以确定PA靶标的共识序列，且含有该共识序列或类似序列的克隆在结合PA与结合链霉亲和素阴性对照的比值方面表现最佳。然而，情况并非总是如此。对于abrax靶标，测序100个克隆后得到5个重复序列，但这些序列中的趋势不如PA明显，仅能观察到倾向于含有芳香族氨基酸残基以及天冬氨酸或天冬酰胺。仅基于重复序列预测出的"共识"序列虽可被合成并检测其对abrax的亲和力，但由于没有任何亲本序列包含该精确的共识序列，我们重新审视了测序克隆列表，发现其他一些候选序列彼此之间具有更多共通趋势。事实上，有两个克隆的序列与仅基于重复序列得出的"共识"序列（FWDTWF而非FWAWF）相似，其同样具有色氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸残基的趋势，但残基间距不同。其中一个肽序列是重复出现的，另一个则不是。这两个序列以及第三个含有类似变体的序列，在检测的候选物中均为对abrax亲和力最高的前五名结合肽之一。总体亲和力最高的结合肽AX-A05也表现出类似的趋势。abrax的结果表明，针对某些靶标，可能需要在序列分析与亲和力及特异性分析之间多次交替进行。abrax靶标的结果还表明，可在高度相似的蛋白质（rivax 1,15）之间实现较高的特异性识别水平。

本研究选用的自动磁性细胞分选（autoMCS）程序为Posselds和Posseld，二者均适用于初始群体中频率较低（低于5%）的标记靶细胞的正向筛选。在这两种程序中，细胞均需通过两个磁性柱。然而，在Posselds程序中，细胞通过第一个磁性柱的速度更慢，以延长暴露时间41。除了参考商用autoMCS设备制造商提供的程序说明（见材料表）41外，我们还通过初步比较多个潜在程序后选择了上述两种程序。比较内容包括：各程序在均一的阴性对照细胞培养物中避免非特异性捕获假阳性细胞的能力，以及从含有递减比例已知结合物的混合培养物中成功分离出针对目标分子的已知结合物的能力。若新应用与本文所述应用场景存在显著差异，则进行类似的比较可能有助于选择合适的程序。然而，已有发表的研究比较了这两种程序（Posseld与Posselds）在分离针对PA的肽亲和试剂中的表现，结果显示，在四轮生物淘选中均使用任一程序，均可获得对PA具有相似亲和力和特异性的肽，并确定出WXCFTC共有序列。主要差异在于：Posseld因流速较快，分选速度更快，因此仅经过两轮生物淘选即可获得较高的靶标结合亲和力；而使用Posselds则在四轮生物淘选后可获得更多的独特序列14。基于此经验，我们在筛选abrax结合肽时略微调整了策略，以兼顾两种程序的优势：第一轮使用Posselds程序，以便在多样性最高的关键步骤中延长暴露时间；随后在第二至第四轮切换为Posseld程序，以更快地分离出亲和力最高的结合物1,15。该策略对abrax而言似乎更为理想，尤其是第四轮分选中abrax的nMFI值和结合百分比均高于使用任一程序进行PA第四轮分选的结果（图2 和图3，以及Sarkes et al. 201514）。然而，若要得出更具结论性的比较结果，还需针对同一靶标直接比较两种策略。对于特定应用而言，最佳程序的选择可能取决于具体靶标、所用分选文库，以及在本文所述条件基础上进行任何调整后所实现的肽表达水平。

本文未讨论与非生物材料进行生物淘选的潜在结果，但我们已使用相同的细菌展示文库对块体铝进行生物淘选2。该研究未使用autoMCS完成，但如果材料可直接存在于磁珠上，或可包被或偶联至磁珠，则类似研究可通过autoMCS实现。在块体铝的研究中，单个氨基酸分析和二级结构建模有助于理解分离出的肽段结合亲和力的驱动因素，因为未确定共识序列2。即使针对生物靶标，也可能需要此类分析来阐明某些靶标结合亲和力的驱动机制，因此由"eCPX_Sequencing"宏生成的电子表格中包含一个标签页，提供单个残基频率分析。然而，如果除缺乏共识序列外，未观察到重复序列，且残基频率也未显示任何模式，则可能需要其他类型的分析。此外，可能需要进行更多轮次的分选，以避免在筛选大量候选序列时难以进一步缩小具有足够靶标亲和力的候选范围。

随着下一代测序技术的日益普及，可以在进行亲和力测试前更全面地研究以确定最具潜力的候选序列，并可在每轮生物淘选后评估富集程度。然而，进入结合分析阶段的序列可能需要通过克隆重新构建，如果其频率不够高，无法通过常规的数十或数百个菌落测序轻松分离获得。随着该技术的发展，成本不断降低并变得更加常规化，特别是若能结合菌落分离选项，这很可能成为分析生物淘选数据的最佳方法。该技术可能有助于阐明单个序列乃至整个文库的演化过程。此外，分选文库中的细菌可能随时间发生突变，这可能导致分选偏向于生长速度更快的细胞，或偏向于过度表达基因组蛋白的细菌——这些蛋白即使在没有展示支架和肽表达的情况下也能与材料结合。因此，一旦发现有前景的候选序列，值得分离质粒DNA，重新转化新鲜的 E. coli，并通过流式细胞分选（FACS）验证肽的结合能力。如果计划将肽用于无细胞体系，还应评估游离肽的亲和力。例如，通过细菌展示技术发现的针对靶标SEB的肽亲和试剂，已被合成为无细胞形式，并采用更传统的方法（如酶联免疫吸附测定，ELISA）进行分析；同时通过FACS（细胞上）和ELISA（无细胞）两种方法测定Kd值，比较其在细胞上与无细胞状态下的亲和力7。

尽管生物素-链霉亲和素相互作用的强结合力使其成为捕获蛋白质靶标及其结合肽的理想策略，但该方法也可根据其他捕获策略进行调整。将蛋白质直接偶联至磁珠（如环氧基或羧酸基磁珠）已被成功应用，并可省去一个结合步骤。然而，直接连接可能以特异或非特异性方式阻碍潜在的结合位点，具体取决于偶联策略。使用链霉亲和素磁珠的另一个优势在于，稳定性较差的蛋白质靶标可在30分钟内新鲜生物素化，必要时亦可冻存；而磁珠本身通常需要较长的孵育时间以实现蛋白质交联，且一般保存于2–8°C。本文建议的生物素化蛋白质靶标起始浓度为600 nM，该浓度已成功适用于多种靶标，但若降低该浓度，可能有助于分离出亲和力更高的肽捕获试剂。此外，本方法还可拓展并修改用于其他细菌展示文库及其他生物体。例如，这些步骤可在无氧条件下进行以适用于厌氧菌，或在其他特殊环境中进行以适用于嗜极菌，从而分离具有独特性质的肽。针对特定目标所获得的肽序列和/或保守序列，可潜在地作为活体材料在细胞上直接使用，或在体外合成生产。合成制备的肽可进一步优化，用于开发亲和力更高、更稳定的蛋白质催化捕获（PCC）试剂，应用于传感器，或替代抗体用于结合与识别的其他应用场景。 关键词：生物素-链霉亲和素系统，磁珠偶联，蛋白质捕获，肽展示，细菌展示文库，蛋白质催化捕获（PCC），合成肽，亲和筛选，极端环境微生物，厌氧菌 38,55分子建模也可用于辅助确定肽段与其靶标结合的位置，近期针对abrax结合肽段及其中所列共识序列的研究即采用了该方法 图5C 1总体而言，利用细菌展示文库进行生物淘选以获得多肽亲和试剂，是一种快速、直接且强大的抗体替代方法，可用于靶蛋白的识别与检测；这种半自动化的生物淘选方法已产生可靠结果，并具有广泛的应用前景。

披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

作者谨此感谢美国陆军研究实验室（ARL）博士后研究基金项目的支持，该项目由橡树岭联合大学通过与 ARL 的合同负责管理，并资助了 Justin P. Jahnke 博士的任命。其余经费由 ARL 传感器与电子器件理事会提供。作者还感谢加州大学圣塔芭芭拉分校（UCSB）的 Daugherty 实验室分享了细菌展示文库以及 YPet Mona 试剂的克隆信息，感谢 ARL 的 Bryn Adams 博士在 ARL 完成 YPet Mona 试剂克隆工作期间提供的支持，感谢 Joshua Kogot 博士在细菌展示文库的生物筛选（biopanning）方面的初期工作和培训，感谢 Edgewood 化学与生物中心的 Alena Calm 分享用于表达和纯化 abrax 和 rivax 蛋白的质粒，感谢 Brandi Dorsey 在 PA 结合肽分离方面的技术支持，感谢 Qin Guo 在分离 abrax 结合肽的初步实验中提供的技术支持，以及感谢 Jessica Terrell 博士对本手稿撰写过程中提出的有益讨论。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
autoMACS Pro 分离仪Miltenyi Biotec130-092-545用于磁珠的自动化细胞分离仪
LB 培养基（Miller 配方）Fisher ScientificBP1426-500生长培养基
氯霉素Fisher BioReagentsBP904-100抗生素
琼脂Fisher ScientificBP2641-500增稠/凝胶剂
eCPX 3.0 细菌展示肽库Cytomx TherapeuticsN/A; http://cytomx.com/contact/细胞表面肽展示文库。由美国加州大学圣塔芭芭拉分校（USCB）合作者提供。
L-阿拉伯糖SigmaA3256-500G糖类，用于诱导蛋白表达
磷酸盐缓冲液 pH 7.4（PBS）Amresco0780-10L缓冲液
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素，无需称量Thermo ScientificPI21327将生物素分子添加至伯胺基团
Pierce 生物素定量试剂盒Thermo ScientificPI28005确保生物素分子共价结合至蛋白
Dynabeads MyOne 链霉亲和素 T1 磁珠Invitrogen65601用于捕获生物素偶联蛋白的磁珠
牛血清白蛋白（BSA）SigmaA9647-100G蛋白，用作阻断非特异性结合的封闭剂
D-葡萄糖SigmaG8270-1KG糖类，用于细菌生长并抑制可诱导蛋白表达
Ypet MonaUCSB 和 ARLN/AeCPX 3.0 表达监测的阳性对照。由作者及合作者制备；参见参考文献 12 和 13。
Dylight 488 NHS 酯Thermo Scientific46403用于将目标蛋白与荧光染料偶联
链霉亲和素-R-藻红蛋白偶联物（SAPE）Thermo ScientificS866监测链霉亲和素非特异性结合的阴性对照
BD FACSFlow 缓冲液Becton, Dickinson, and Company342003FACS 仪器运行用缓冲液
autoMACS 柱Miltenyi Biotech130-021-101用于 MACS 分离
autoMACS 运行缓冲液 – MACS 分离缓冲液Miltenyi Biotech130-091-221用于 autoMACS 仪器维护。危险：含 0.09% 叠氮化钠。
autoMACS Pro 洗涤液Miltenyi Biotech130-092-987用于 autoMACS 仪器维护
70% 乙醇VWRE505-4LautoMACS 的去污剂
甘油SigmaG6279-1L用于细菌冻存菌种
Chill 15 架Miltenyi Biotec130-092-952用于 MACS 分离
BD FACSCanto IIBecton, Dickinson, and Company744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview用于评估肽与靶标的结合情况
BD FACSDiva 软件Becton, Dickinson, and Company659523用于评估肽与靶标的结合情况
Dynabeads MPC-S 磁性粒子浓缩器Thermo ScientificA13346用于磁珠的台式细胞分离器
菌落测序GenewizN/A; https://www.genewiz.com/DNA 及菌落测序服务
ExcelMicrosoft323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400用于序列分析宏
炭疽保护性抗原（PA）List Biological Laboratories, Inc.171作为代表性结果示例所用的目标蛋白。
AbraxECBC 和 ARLN/A作为代表性结果示例所用的目标蛋白。由作者及合作者制备；参见参考文献 1 和 15。
RivaxECBC 和 ARLN/A作为代表性结果示例所用的目标蛋白。由作者及合作者制备；参见参考文献 1 和 15。

参考文献

  1. Sarkes, D. A., Hurley, M. M., Stratis-Cullum, D. N. Unraveling the Roots of Selectivity of Peptide Affinity Reagents for Structurally Similar Ribosomal Inactivating Protein Derivatives. Molecules. 21 (11), 1504(2016).
  2. Adams, B. L., Finch, A. S., Hurley, M. M., Sarkes, D. A., Stratis-Cullum, D. N. Genetically Engineered Peptides for Inorganics: Study of an Unconstrained Bacterial Display Technology and Bulk Aluminum Alloy. Adv. Mater. 25 (33), 4585-4591 (2013).
  3. Bessette, P. H., Rice, J. J., Daugherty, P. S. Rapid isolation of high-affinity protein binding peptides using bacterial display. Protein Eng. Des. Sel. 17 (10), 731-739 (2004).
  4. Daugherty, P. S. Protein engineering with bacterial display. Curr. Opin. Struct. Biol. 17 (4), 474-480 (2007).
  5. Getz, J. A., Schoep, T. D., Daugherty, P. S. Peptide Discovery Using Bacterial Display and Flow Cytometry. Methods Enzymol. 503, 75(2012).
  6. Kenrick, S. A., Daugherty, P. S. Bacterial display enables efficient and quantitative peptide affinity maturation. Protein Eng. Des. Sel. 23, 9-17 (2010).
  7. Kogot, J. M., et al. Screening and characterization of anti-SEB peptides using a bacterial display library and microfluidic magnetic sorting. J. Mol. Recognit. 27 (12), 739-745 (2014).
  8. Kogot, J. M., Pennington, J. M., Sarkes, D. A., Stratis-Cullum, D. N., Pellegrino, P. M. Population Enrichment and Isolation with Magnetic Sorting, DTIC Document No. ARL-TN-0452. Report No. ARL-TN-0452. , US Army Research Laboratory, Sensors and Electron Devices Directorate. Adelphi, MD. (2011).
  9. Kogot, J. M. Screening of peptide libraries against protective antigen of Bacillus anthracis in a disposable microfluidic cartridge. PLOS ONE. 6 (11), e26925(2011).
  10. Little, L. E., Dane, K. Y., Daugherty, P. S., Healy, K. E., Schaffer, D. V. Exploiting bacterial peptide display technology to engineer biomaterials for neural stem cell culture. Biomaterials. 32 (6), 1484-1494 (2011).
  11. Pennington, J. M., Kogot, J. M., Sarkes, D. A., Pellegrino, P. M., Stratis-Cullum, D. N. Isolation and characterization of anti-SEB peptides using magnetic sorting and bacterial peptide display library technology. SPIE Defense, Security, and Sensing. 83581Z-1-83581Z-6 International Society for Optics and Photonics. , (2012).
  12. Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Eng. Des. Sel. 21 (7), 435-442 (2008).
  13. Rice, J. J., Schohn, A., Bessette, P. H., Boulware, K. T., Daugherty, P. S. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Sci. 15 (4), 825-836 (2006).
  14. Sarkes, D. A., Dorsey, B. L., Finch, A. S., Stratis-Cullum, D. N. Method for Discovery of Peptide Reagents Using a Commercial Magnetic Separation Platform and Bacterial Cell Surface Display Technology. J. Anal. Bioanal. Tech. 6 (4), 1(2015).
  15. Sarkes, D. A. Rapid discovery of peptide capture candidates with demonstrated specificity for structurally similar toxins. SPIE Commercial+ Scientific Sensing and Imaging. 986305-1-986305-10 International Society for Optics and Photonics. , (2016).
  16. Stratis-Cullum, D., Kogot, J. M., Sarkes, D. A., Val-Addo, I., Pellegrino, P. M. Chapter 30, Bacterial display peptides for use in biosensing applications. On Biomimetics. Pramatarova, L. , InTech. 629-642 (2011).
  17. Stratis-Cullum, D. N., Finch, A. S. Current Trends in Ubiquitous Biosensing. J. Anal. Bioanal. Tech. S7 (009), (2013).
  18. Rockberg, J., Löfblom, J., Hjelm, B., Uhlén, M., Ståhl, S. Epitope mapping of antibodies using bacterial surface display. Nature Methods. 5 (12), 1039-1045 (2008).
  19. Francisco, J. A., Campbell, R., Iverson, B. L., Georgiou, G. Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10444-10448 (1993).
  20. Georgiou, G. Display of heterologous proteins on the surface of microorganisms: from the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines. Nat. Biotechnol. 15 (1), 29-34 (1997).
  21. Löfblom, J., Wernérus, H., Ståhl, S. Fine affinity discrimination by normalized fluorescence activated cell sorting in staphylococcal surface display. FEMS Microbiol. Lett. 248 (2), 189-198 (2005).
  22. Kjærgaard, K., Sørensen, J. K., Schembri, M. A., Klemm, P. Sequestration of zinc oxide by fimbrial designer chelators. Appl. Environ. Microbiol. 66 (1), 10-14 (2000).
  23. Kishimoto, J., Fukuma, Y., Mizuno, A., Nemoto, T. K. Identification of the pentapeptide constituting a dominant epitope common to all eukaryotic heat shock protein 90 molecular chaperones. Cell stress & chaperones. 10 (4), 296-311 (2005).
  24. Westerlund-Wikström, B. Peptide display on bacterial flagella: principles and applications. International journal of medical microbiology. 290 (3), 223-230 (2000).
  25. Gaskin, D. J., Starck, K., Turner, N. A., Vulfson, E. N. Phage display combinatorial libraries of short peptides: ligand selection for protein purification. Enzyme Microb. Technol. 28 (9), 766-772 (2001).
  26. Goldman, E. R. Phage-displayed peptides as biosensor reagents. J. Mol. Recognit. 13 (6), 382-387 (2000).
  27. Boder, E. T., Wittrup, K. D. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat. Biotechnol. 15 (6), 553-557 (1997).
  28. Cherf, G. M., Cochran, J. R. Applications of Yeast Surface Display for Protein Engineering. Yeast Surface Display: Methods, Protocols, and Applications. , 155-175 (2015).
  29. London, N., Movshovitz-Attias, D., Schueler-Furman, O. The structural basis of peptide-protein binding strategies. Structure. 18 (2), 188-199 (2010).
  30. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
  31. Jahnke, J. P., Terrell, J. L., Smith, A. M., Cheng, X., Stratis-Cullum, D. N. Influences of Adhesion Variability on the "Living" Dynamics of Filamentous Bacteria in Microfluidic Channels. Molecules. 21 (8), 985(2016).
  32. Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature materials. 13 (5), 515-523 (2014).
  33. Löfblom, J., Frejd, F. Y., Ståhl, S. Non-immunoglobulin based protein scaffolds. Current opinion in biotechnology. 22 (6), 843-848 (2011).
  34. Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discov. Today. 9 (12), 525-529 (2004).
  35. Pini, A., Falciani, C., Bracci, L. Branched peptides as therapeutics. Current Protein and Peptide Science. 9 (5), 468-477 (2008).
  36. Gongora-Benitez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. Peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2013).
  37. Coppock, M. B., et al. Peptide-based protein capture agents with high affinity, selectivity, and stability as antibody replacements in biodetection assays. SPIE Sensing Technology+ Applications. 910711-1-910711-6 International Society for Optics and Photonics. , (2014).
  38. Coppock, M. B. Protein Catalyzed Capture Agents with Tailored Performance for In Vitro and In Vivo Applications. Peptide Science. , (2016).
  39. Bessette, P. H., Hu, X., Soh, H. T., Daugherty, P. S. Microfluidic library screening for mapping antibody epitopes. Anal. Chem. 79 (5), 2174-2178 (2007).
  40. Chao, G. Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat. Protoc. 1 (2), 755-768 (2006).
  41. Miltenyi Biotec GmbH. autoMACS™ Pro Separator User Manual, Version 1.1. , Miltenyi Biotec GmbH. Bergisch Gladbach, Germany. (2007).
  42. Henriques, S. T., et al. A novel quantitative kinase assay using bacterial surface display and flow cytometry. PLOS ONE. 8 (11), e80474(2013).
  43. BD FACSCanto II Operator Course Workbook. , Becton, Dickinson and Company. (2007).
  44. BD FACSCanto II Instructions For Use. , Becton, Dickinson and Company. (2007).
  45. Chan, L. Y., Yim, E. K., Choo, A. B. Normalized Median Fluorescence: An Alternative Flow Cytometry Analysis Method for Tracking Human Embryonic Stem Cell States During Differentiation. Tissue Eng. Part C Methods. 19 (2), 156-165 (2012).
  46. Genewiz. DNA Sequencing Services. , Available from: https://www.genewiz.com/ (2017).
  47. Honegger, A., PluÈckthun, A. Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool. Journal of molecular biology. 309 (3), 657-670 (2001).
  48. Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol. Syst. Biol. 7 (1), 539(2011).
  49. Lassmann, T., Sonnhammer, E. L. Kalign-an accurate and fast multiple sequence alignment algorithm. BMC bioinformatics. 6 (1), 298(2005).
  50. EMBL-EBI. Clutal Omega. , Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (2017).
  51. EMBL-EBI. Kalign. , Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/kalign/ (2017).
  52. Clamp, M., Cuff, J., Searle, S. M., Barton, G. J. The jalview java alignment editor. Bioinformatics. 20 (3), 426-427 (2004).
  53. Waterhouse, A. M., Procter, J. B., Martin, D. M., Clamp, M., Barton, G. J. Jalview Version 2-a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics. 25 (9), 1189-1191 (2009).
  54. Jalview. , Available from: http://www.jalview.org/Download (2017).
  55. Farrow, B., et al. A chemically synthesized capture agent enables the selective, sensitive, and robust electrochemical detection of anthrax protective antigen. ACS Nano. 7 (10), 9452-9460 (2013).

重印与许可

标签

用于肽亲和试剂发现及分离株分析的细菌展示文库半自动生物筛选
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。