利用二维培养系统对原代大脑皮层细胞进行活体成像

摘要

活体成像是一种用于实时研究细胞行为的强大工具。本文中，我们描述了一种对原代大脑皮层细胞进行延时视频显微镜观察的实验方案，该方法可详细检测从原代神经干细胞向分化神经元和胶质细胞谱系发育过程中各阶段的动态变化。

摘要

在大脑皮层发育过程中，前体细胞会经历多轮对称和不对称细胞分裂，以产生新的前体细胞或终末分裂后的神经元。随后，部分前体细胞会转变为胶质细胞发生命运，补充星形胶质细胞和少突胶质细胞的数量。通过对外源性大脑皮层原代细胞培养物进行延时视频显微成像，可以研究调控前体细胞分裂模式及细胞周期参数的细胞与分子机制。同样，也可利用细胞特异性的荧光报告蛋白或成像后的免疫细胞化学方法，检测终末分裂后细胞的命运。更重要的是，这些特征均可在单细胞水平上进行分析，从而识别出承诺生成特定细胞类型的前体细胞。此外，还可通过病毒介导的转染技术操控基因表达，以研究细胞自主性与非细胞自主性现象。最后，利用荧光蛋白融合技术，可研究特定蛋白在细胞分裂过程中对称或不对称的分布情况，并分析其与子代细胞命运之间的关联。本文中，我们描述了延时视频显微成像方法，用于对原代小鼠大脑皮层细胞进行持续数天的活细胞成像，以分析细胞分裂模式、细胞周期长度以及新生细胞的命运。我们还介绍了一种简单的前体细胞转染方法，可用于操控目的基因，或仅用报告蛋白对细胞进行标记。

引言

神经干细胞（NSC）在大脑皮层发育过程中产生神经元和大胶质细胞。在皮层发生的早期阶段，神经干细胞经历多轮对称性细胞分裂，扩增前体细胞池；随后，神经干细胞通过不对称分裂直接或间接经由中间细胞生成神经元。¹只有在皮质发生的中期至晚期，前体细胞才转变为生成星形胶质细胞和少突胶质细胞^2,3,4然而，调控细胞增殖与分化的完整机制，以及命运受限的前体细胞在生成特定类型神经元或大胶质细胞过程中的作用，仍是激烈争论的焦点。^4,5,6单个皮层神经干细胞生成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能已被广泛研究 体外 和 体内 使用多种技术，例如：单细胞培养中的活体成像^{7,8,9,10,11,12,13}高密度培养物中的活体成像^3,14,15活体成像在脑片培养中的应用^16,17,18利用病毒载体介导的遗传标记在高密度培养物中进行克隆分析^{14,15,19,20,21}克隆分析 体内 使用逆转录病毒^{22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33}；以及克隆分析 体内 使用转基因动物³⁴.

这些技术各自具有优缺点。例如，体内谱系示踪易受到归并错误和分裂错误的影响³，从而导致关于单个皮层前体细胞潜能的相互矛盾的结论。此外，基于在早期时间点标记前体细胞并随后分析细胞谱系的体外和体内研究，可能受到谱系进展过程中未被检测到的细胞死亡事件的影响³⁵。因此，一个合适的系统必须能够识别出单个神经干细胞（NSC）所产生的所有细胞，并对谱系内细胞命运进行准确表征。原代细胞培养与活细胞成像的结合为此提供了理想的条件。通过单细胞培养和延时视频显微技术，Temple et al. 已经展示了单个大脑皮层前体细胞从神经发生向胶质发生转变的过程¹¹。随后，他们利用相同的系统证明了单个皮层前体细胞可以产生多种类型的神经元¹²。然而，该系统存在一个重要局限：在皮层发生的早期阶段分离出的皮层前体细胞中，仅有1%能够生成包含4个或更多子代细胞的克隆⁹。加入FGF2后，产生4个或更多子代细胞的细胞比例提高至8–10%⁹。尽管如此，考虑到在此阶段几乎所有皮层前体细胞都具有增殖能力，这一比例仍然过低。此外，不能排除FGF2对细胞命运决定的潜在影响³⁶。为了克服这些局限性，我们采用了高密度细胞培养体系，该体系可支持室管膜区（表达Pax6）和室下区（表达Tbr2）皮层前体细胞的增殖¹⁵。此外，对这些培养物的实时观察表明，在该条件下可重现NSC谱系进展的多个特征，例如细胞分裂方式、细胞周期延长、单个细胞生成神经元和胶质细胞的潜能等^3,15。最近，我们还利用该系统证明了CREB信号通路影响小鼠未成熟大脑皮层神经元的细胞存活³⁷。因此，我们认为，高密度培养的原代小鼠大脑皮层细胞的延时视频显微技术是一种强大且易于实现的工具，可用于研究细胞周期进展、细胞分裂方式、细胞存活以及细胞命运决定的细胞与分子机制。后者可通过使用转基因动物实现实时识别特定细胞命运^38,39,40，或结合成像后的免疫细胞化学染色进行分析^3,38,41,42。

本文提供了一种逐步操作的实验方案，用于建立支持神经干细胞（NSCs）增殖以及后续神经元和大胶质细胞生成的原代大脑皮层细胞培养体系。我们还讨论了利用逆转录病毒介导的转染技术调控单个细胞的基因表达，并通过活细胞延时视频显微镜在单细胞水平上对这些细胞进行识别和追踪。该方案可用于研究从皮层发生开始至结束各个阶段分离自啮齿类动物的原代大脑皮层细胞，但可能需要根据发育阶段进行少量调整¹⁴。来源于其他组织的神经干细胞也可通过二维培养的活细胞延时视频显微镜进行研究，但应通过比较细胞在体外（in vitro）和体内（in vivo）的行为来确定合适的培养系统^38,43。

方案

本方案中所述所有涉及活体动物的实验均依照国家及国际法律法规进行，并已获得当地大学动物护理与使用委员会（CEUA/UFRN）的批准，许可号为009/2014。以下实验步骤需在无菌环境中操作。操作者应具备基本的细胞培养经验。

1. 背外侧端脑显微解剖

1. 配制解剖培养基（100 mL）：98.5 mL Hank's 平衡盐溶液（HBSS），0.5 mL 5 M HEPES（pH 7.4），1 mL 青霉素/链霉素（10,000 单位/mL 和 10,000 µg/mL）。
2. 对解剖培养基进行过滤除菌。
3. 在异氟烷麻醉下，从怀孕的 C57/Bl6 小鼠（Mus musculus）中取出胚胎发育第14天（E14）的胚胎。
   注意：以检测到阴道栓的当天为 E0。从怀孕小鼠体内取出后，解剖操作应在1小时内完成。本方案同样适用于 E11 至 E17 胚胎。
4. 在无菌条件下通过子宫切除术取出胚胎。
5. 将胚胎转移至含有冷解剖培养基（4 °C）的培养皿中。
6. 沿大脑纵裂剪开颅骨，取出脑组织。通常每次实验可获得5至10个胚胎。每个 E14 胚胎脑组织可获得约 2 × 10⁶ 个细胞，包括前体细胞和终末分裂后神经元（比例约为1:1）。
   注意：后续步骤请使用体视显微镜操作。
7. 使用解剖镊去除脑膜。从中间将端脑分开，分离左右半球。用解剖镊沿背内侧曲线及皮质-亚皮质边界剪切，以分离背外侧端脑。将分离出的背外侧端脑组织转移至含有冷解剖培养基（4 °C）的2 mL 离心管中，待所有脑组织解剖完成后统一处理。

2. 细胞解离与接种

1. 制备增殖培养基（50 mL DMEM+10% FCS）：44 mL 达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM），5 mL 胎牛血清（FCS），0.5 mL 40% 葡萄糖，0.5 mL 青霉素/链霉素溶液（10,000 单位/mL 和 10,000 µg/mL）。使用滤器对增殖培养基进行过滤除菌。
2. 制备分化培养基（50 mL DMEM+2% B27）：48 mL DMEM，1 mL B27 添加剂，0.5 mL 40% 葡萄糖，0.5 mL 青霉素/链霉素溶液（10,000 单位/mL 和 10,000 µg/mL）。使用滤器对分化培养基进行过滤除菌。
3. 从 E14 小鼠中分离出端脑背外侧区后，将含有收集组织和冷解剖液的离心管在 4 °C 条件下以 340 × g 离心 5 分钟，使组织沉淀。
4. 用移液器吸除上清液，加入 1 mL 预热至 37 °C 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液进行化学消化。在 37 °C 下孵育 15 分钟。加入 2 mL 增殖培养基以终止胰蛋白酶活性。
5. 将玻璃巴斯德吸管的尖端在气体燃烧器或本生灯上灼烧数秒，使其开口略微缩小。通过吸取 FCS 清洗吸管，使管尖内壁被 FCS 涂覆。避免产生气泡，使用经火焰抛光并涂有 FCS 的巴斯德吸管对细胞进行机械性解离。
6. 将细胞在 4 °C 条件下以 340 × g 离心 5 分钟。用移液器吸除上清液，加入 1 mL 增殖培养基，并用移液器重悬细胞。重复此步骤一次。
7. 用 0.4% 台盼蓝溶液将细胞悬液稀释至 1:1。死细胞会被染成蓝色。使用血细胞计数板（Neubauer 计数室）计数未染色的活细胞数量。
8. 用增殖培养基将细胞稀释至 10⁶ 个细胞/mL。向 24 孔组织培养板的每孔中加入 500 µL 细胞悬液（约 2.5 × 10⁵ 个细胞/cm²）。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育。
   注意：请勿使用玻璃盖玻片，因其在实验过程中可能发生移动，从而改变观察视野。建议改用玻璃底组织培养板。
   注意：若未使用经过细胞培养处理的多孔板，则需在使用前用聚-D-赖氨酸（Poly-D-Lysin，50 µg/mL）在 37 °C 下预处理 2 小时。经 PDL 处理的培养板在用蒸馏水洗涤后可于 4 °C 保存。

3. 逆转录病毒介导的转染

注意：这是一种仅转染前体细胞的简单方法。然而，也可使用其他病毒载体或化学/电转染方法将目的基因导入培养细胞中。

1. 为了调控基因表达并用荧光报告蛋白标记细胞，在细胞接种后2小时加入携带目的基因质粒的逆转录病毒。
   注意：逆转录病毒载体仅能整合到正在分裂的细胞基因组中。因此，应在细胞增殖活跃时进行感染。
   注意：我们使用了一种包含β-肌动蛋白/巨细胞病毒融合序列（CAG）以及内部核糖体进入位点（IRES）的质粒，其后接绿色荧光蛋白（GFP）的编码序列，命名为pCAG-IRES-GFP⁴⁴。目的基因可克隆至CAG启动子与IRES序列之间³⁷。
2. 将逆转录病毒用分化培养基稀释，以获得每毫升所需的病毒颗粒数。向每个孔中加入500 µL含逆转录病毒的分化培养基。
   注意：所用逆转录病毒的用量取决于其滴度，应计算至每孔感染50至100个细胞为宜。此滴度有助于识别孤立的GFP表达克隆，其谱系关系可通过连续相差显微图像追踪进一步确认（见第6节）。逆转录病毒滴度测定应使用相同的细胞群体进行⁴⁵。

4. 时间序列视频显微镜

注意：此步骤需要配备培养箱的倒置荧光显微镜（参见材料表）。

1. 逆转录病毒感染后，将组织培养板放入连接温度和 CO₂ 控制器的培养箱中。
   注意：成像开始前将培养室预热 3 小时，有助于在采集过程中最大限度减少漂移和失焦。
   注意：培养室应维持细胞处于恒定的 37 °C 和 5% CO₂ 条件下。
2. 在 XY 轴上选择一个位置作为零点（XY = 0），以便将来可再次定位这些位置，例如在成像后的免疫细胞化学染色后（见第 5 节）。
   注意：建议在培养板上绘制一个标记，作为确定零点的参考。
3. 在 10X 放大倍数下选择待成像的位置。
   注意：每孔选择 10–15 个位置，以提高观察到逆转录病毒转染细胞的可能性。
   注意：可使用长工作距离的高倍物镜（20X 或 40X）以获得更高分辨率的图像。根据物镜的工作距离，可能需要使用玻璃底培养板。
4. 每 5 分钟采集一次相差图像，每 3 小时采集一次荧光图像，以减少光毒性。在实验开始的前 3 小时内检查并调整焦距，因为温度平衡过程中焦距可能发生变化。每天检查并调整一次焦距。
   注意：我们观察到焦距在前 24 小时后趋于稳定。但建议持续监测焦距。 或者，可使用基于软件的自动对焦系统。
5. 7 天后停止图像采集，并进行成像后的免疫细胞化学染色（见第 5 节）。
6. 免疫细胞化学染色后，将培养板重新放回显微镜培养箱中，找到零点，重置 XYZ = 0，并加载保存了位置信息的实验文件。使用适当的荧光滤光片采集每个位置的荧光图像。

5. 成像后免疫细胞化学

1. 培养 7 天后，在室温下用 4% 多聚甲醛（PFA）固定液固定细胞培养物 15 分钟。
   注意：PFA 具有毒性，应在化学通风橱中操作。
2. 用 0.5 mL 0.1 M PBS 洗涤 5 分钟，重复 3 次。
3. 在 4 °C 下，使用含 0.5% 曲拉通和 10% 正常山羊血清的 0.1 M PBS 溶液，与一抗共同孵育过夜。
   注：使用抗微管相关蛋白 2（MAP2）抗体确认神经元表型（小鼠 IgG1，1:1,000），使用抗 GFP 抗体标记转导细胞（鸡抗体，1:500）。也可使用其他抗体检测前体细胞或胶质细胞。
4. 用 0.5 mL 0.1 M PBS 洗涤 5 分钟，重复 3 次。
5. 将二抗稀释于含 0.5% 曲拉通和 10% 正常山羊血清的 0.1 M PBS 溶液中，室温孵育 2 小时。推荐稀释比例：1:1,000。
6. 用 0.5 mL 0.1 M PBS 洗涤 5 分钟，重复 3 次。
7. 进行细胞核染色时，使用含 0.1 µg/mL 4′6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）的 0.1 M PBS 溶液孵育细胞 5 分钟。
8. 用 0.5 mL 0.1 M PBS 洗涤 5 分钟，重复 3 次。
9. 将细胞保存在 0.1 M PBS 中，并避光保存（例如，用铝箔包裹培养板）。

6. 细胞追踪

注意：此处简要描述使用软件 The Tracking Tool (tTt) 分析延时视频显微数据的主要步骤，该软件可通过材料表中提供的链接获取。

注意：如果图像采集使用其他软件完成，请使用 tTt 安装程序中提供的 tTt 转换器（链接见材料表）导入图像数据。仅支持 png、tif 或 jpg 图像格式。启动 tTt 转换器后，请按照图 1 A - B 所示步骤操作。

1. 启动软件 tTt 并选择一个用户名。点击 "添加用户" 和 "继续" 按钮（图 2A）。浏览并选择 "TTTWorkFolder"（图 2B）。谱系树、统计结果和导出的图像将保存在此文件夹中。接下来，选择要分析的实验并加载它（图 2B）。
2. 如果图像之前已由 tTt Converter 转换，请点击 "LogFileConverter"（图 3A），并在 LogFileConverter 窗口中指定连续两个时间点之间的秒数。点击 "为整个实验转换日志文件"（图 1C）。
3. 在 tTt 窗口中出现的图像列表中，选择所需图像，可通过手动加载或使用程序中显示的选项进行加载。加载图像（图 3）。
4. 选择 文件 > 打开 > 新菌落。点击 "追踪"，然后点击 "开始追踪"，以在选定位置开始追踪。
5. 将出现一个视频窗口（图 4）。使用追踪圆圈选中细胞，然后按下数字键 0。软件将跳转到下一帧。继续使用鼠标将追踪圆圈定位在目标细胞周围，并在每一帧中按下 0 键，以在细胞上添加追踪标记。
6. 使用数字键 1 和 3 分别跳转到前一帧或后一帧。若要删除一个追踪标记，只需点击正确的标记位置并按下 0 键。
7. 如果细胞发生分裂，请点击 "分裂" 按钮（图 4 中的红色矩形）。通过按下 Shift+D 继续追踪其中一个子代细胞。要追踪第二个子代细胞，请在细胞编辑器中选中该细胞并按下 F2。
8. 如果细胞在显微视频过程中死亡，请选择 "凋亡"（图 4 中的蓝色矩形）。
   注意：尽管软件将该事件标记为 "凋亡"，但细胞死亡可能由其他机制引起。
9. 如果细胞移出观察视野或与邻近细胞混杂而无法继续追踪，请选择 "丢失"（图 4 中的绿色矩形）。
10. 若要暂停追踪并稍后继续，请点击 "中断"（图 4 中的紫色矩形）。
    注意：在细胞编辑器窗口中，追踪过程中将生成一棵谱系树。要保存该谱系树，请在细胞编辑器窗口中选择 文件 > 保存 > 当前谱系树。
11. 若要开始追踪另一个细胞，请使用鼠标右键点击该细胞，或使用鼠标左键选中细胞后，点击 追踪 > 开始追踪。
12. 要导出包含追踪数据的视频，软件不应处于 "追踪模式"。要关闭追踪模式，请执行步骤 6.10。在视频窗口中选择 导出 > 视频。设置格式、帧范围、每秒帧数和比特率。点击 "开始导出"。

7. 定量分析

注意：可使用视频显微镜数据进行多种测量⁴⁶。本文将介绍三种测量方法，并在后文的"代表性结果"部分予以示例说明。

1. 通过将不同时间点存活的细胞数量除以各单个克隆在达到这些时间点之前产生的细胞总数，来量化每种细胞谱系的细胞存活率³⁷。
2. 量化对称性前体细胞（SP，两个子细胞均继续增殖）、不对称分裂（A，一个子细胞继续增殖，另一个子细胞进入有丝分裂后状态）或对称性终末分裂（ST，两个子细胞均进入有丝分裂后状态）的比例^15,38。
3. 通过计算增殖细胞从生成到分裂所经历的时间间隔，测定细胞周期长度¹⁵。

结果

从胚胎E14分离的大脑皮层细胞原代培养物中包含神经前体细胞和神经元细胞。在成像期间，前体细胞经历多轮细胞分裂，从而增加细胞数量（图5 和 视频图1）。

通过逆转录病毒介导转染少量前体细胞，可实现对细胞克隆的鉴定（图6）。请注意，GFP 表达在 24 小时后即可被检测到。在此时间点，可通过相差成像识别表达 GFP 的细胞，并追溯其谱系以完成分析。此处提供的 GFP 图像对比度较差，原因如下：1）内源性 GFP 表达在逆转录病毒感染数天后才出现；2）图像是通过 24 孔板的塑料底部，使用 10X 长工作距离物镜拍摄的；3）荧光曝光时间被设定为在不损伤细胞（光毒性）的前提下，能够检测到 GFP 信号的最低水平。

讨论

对大脑皮层原代细胞进行实时观察，可分析细胞增殖、细胞分裂方式、细胞周期长度、细胞分化及细胞存活情况^3,14,15,37。更重要的是，该方法可用于研究单个细胞的谱系，从而识别神经干细胞（NSCs）向神经元分化过程中所经历的中间阶段³。最后，将该培养系统与调控基因表达的生物工程技术相结合，是一种研究特定靶基因细胞自主性效应的有力手段⁵。本文所述方法可经修改后用于研究在不同发育阶段分离的大脑皮层前体细胞的谱系¹⁴，以及来源于其他组织的神经干细胞^38,42。类似方法也已被用于研究发育中视网膜的细胞谱系

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Hank's 平衡盐溶液（HBSS）	Invitrogen Life Technologies	14175129
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-25G
青霉素/链霉素	Gibco	15140122
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	12400-024
胎牛血清（FCS）	Gibco	10437028
葡萄糖	Gibco	A2494001
B27	Gibco	17504044
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300054
多聚甲醛	Sigma	16005
山羊血清	Sigma-Aldrich	69023
Triton X-100	VWR International Ltd.	306324N
异氟烷	Sigma	792632
抗MAP2，小鼠	Sigma	M4403
抗GFP鸡	鸟纲	0511FP12
DAPI	Sigma	D9542
山羊抗小鼠Alexa 594	Invitrogen	A11005
山羊抗鸡 Alexa 488	Invitrogen	A11039
ImageJ	美国国立卫生研究院
tTt	苏黎世联邦理工学院
细胞观察显微镜	Zeiss
巴斯德吸管
PBS
追踪工具（tTt）软件		https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html	下载链接