利用二维培养系统对原代大脑皮层细胞进行活体成像

摘要

活体成像是一种用于实时研究细胞行为的强大工具。本文中，我们描述了一种对原代大脑皮层细胞进行延时视频显微镜观察的实验方案，该方法可详细检测从原代神经干细胞向分化神经元和胶质细胞谱系发育过程中各阶段的动态变化。

摘要

在大脑皮层发育过程中，前体细胞会经历多轮对称和不对称细胞分裂，以产生新的前体细胞或终末分裂后的神经元。随后，部分前体细胞会转变为胶质细胞发生命运，补充星形胶质细胞和少突胶质细胞的数量。通过对外源性大脑皮层原代细胞培养物进行延时视频显微成像，可以研究调控前体细胞分裂模式及细胞周期参数的细胞与分子机制。同样，也可利用细胞特异性的荧光报告蛋白或成像后的免疫细胞化学方法，检测终末分裂后细胞的命运。更重要的是，这些特征均可在单细胞水平上进行分析，从而识别出承诺生成特定细胞类型的前体细胞。此外，还可通过病毒介导的转染技术操控基因表达，以研究细胞自主性与非细胞自主性现象。最后，利用荧光蛋白融合技术，可研究特定蛋白在细胞分裂过程中对称或不对称的分布情况，并分析其与子代细胞命运之间的关联。本文中，我们描述了延时视频显微成像方法，用于对小鼠原代大脑皮层细胞进行持续数天的活细胞成像，以分析细胞分裂模式、细胞周期长度以及新生细胞的命运。我们还介绍了一种简单的前体细胞转染方法，可用于操控目的基因，或仅用报告蛋白对细胞进行标记。

引言

神经干细胞（NSC）在大脑皮层发育过程中产生神经元和大胶质细胞。在皮层发生的早期阶段，神经干细胞经历多轮对称性细胞分裂，扩增前体细胞池；随后，神经干细胞通过不对称分裂直接或间接地生成神经元，后者可经由中间前体细胞实现¹只有在皮质发生的中期至晚期，前体细胞才转变为生成星形胶质细胞和少突胶质细胞^2,3,4然而，调控细胞增殖与分化的完整机制，以及命运受限的前体细胞在生成特定类型神经元或大胶质细胞过程中的作用，仍是激烈争论的焦点。^4,5,6单个皮层神经干细胞生成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能已被广泛研究 体外 和 在体 使用多种技术，例如：单细胞培养中的活体成像^7,8,9,10,

方案

本方案中所述所有涉及活体动物的实验均依照国家及国际法律法规进行，并已获得当地大学动物护理与使用委员会（CEUA/UFRN）的批准，许可号为009/2014。以下实验步骤均在无菌环境中进行。操作者需具备基本的细胞培养经验。

1. 背外侧端脑显微解剖

1. 制备解剖培养基（100 mL）：98.5 mL Hank's 平衡盐溶液（HBSS），0.5 mL 5 M HEPES（pH 7.4），1 mL 青霉素/链霉素（10,000 单位/mL 和 10,000 µg/mL）。
2. 对解剖培养基进行过滤除菌。
3. 在异氟烷麻醉下，从怀孕的 C57/Bl6 小鼠（Mus musculus）中取出胚胎第14天（E14）的胚胎。
   注意：以检测到阴道栓的当天为 E0。从怀孕小鼠取出后，解剖操作应在 1 小时内完成。本方案也适用于 E11–E17 胚胎。
4. 在无菌条件下通过子宫切除术取出胚胎。
5. 将胚胎转移至含有冷解剖培养基（4 °C）的培养皿中。
6. 沿大脑纵裂剪开，从颅骨中取出脑组织。通常每次实验可获得五至十个胚胎。每个 E14 脑组织可获得约 2 × 10⁶ 个细胞，包括前体细胞和终末分裂后神经元（比例为 1:1）。
   注意：后续步骤请使用体视显微镜。
7. 使用解剖镊去除脑膜。从中间切开端脑以分离左右半球。....

结果

从胚胎E14分离的大脑皮层细胞原代培养物中包含神经前体细胞和神经元细胞。在成像期间，前体细胞经历多轮细胞分裂，使细胞数量增加（图5 和 视频图1）。

通过逆转录病毒介导的少数前体细胞转染，可实现细胞克隆的鉴定（图6）。请注意，GFP 表达在 24 小时后即可被检测到。在此时间点，可在相差图像中识别表达 GFP 的细胞，并追溯其来源以完成谱系分析。此处提供的 GFP 图像对比度较差，原因如下：1）内源性 GFP 表达在逆转录病毒感染数天后才出现；2）图像是通过 24 孔板的塑料底部使用 10X 长工作距离物镜拍摄的；3）荧光曝光时间被设定为在不损伤细胞（光毒性）的前提下可检测到 GFP 信号的最低水平。

讨论

对大脑皮层原代细胞进行实时观察，可分析细胞增殖、细胞分裂方式、细胞周期长度、细胞分化及细胞存活情况^3,14,15,37。更重要的是，该方法可用于研究单个细胞的谱系，从而识别神经干细胞（NSCs）向神经元分化过程中经历的中间阶段³。最后，将该培养系统与调控基因表达的生物工程技术相结合，是一种研究特定靶基因细胞自主性效应的有力手段⁵。本文所述方法可经修改后用于研究在不同发育阶段分离的大脑皮层前体细胞的谱系¹⁴，以及来源于其他组织的神经干细胞^38,42。类似方法也已被用于研究发育中视网膜的细胞谱系^.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Hank's 平衡盐溶液（HBSS）	Invitrogen Life Technologies	14175129
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-25G
青霉素/链霉素	Gibco	15140122
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	12400-024
胎牛血清（FCS）	Gibco	10437028
葡萄糖	Gibco	A2494001
B27	Gibco	17504044
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300054
多聚甲醛	Sigma	16005
山羊血清	Sigma-Aldrich	69023
Triton X-100	VWR International Ltd.	306324N
异氟烷	Sigma	792632
抗MAP2，小鼠	Sigma	M4403
抗GFP鸡	鸟纲	0511FP12
DAPI	Sigma	D9542
山羊抗小鼠Alexa 594	Invitrogen	A11005
山羊抗鸡 Alexa 488	Invitrogen	A11039
ImageJ	美国国立卫生研究院
tTt	苏黎世联邦理工学院
细胞观察显微镜	Zeiss
巴斯德吸管
PBS
追踪工具（tTt）软件		https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html	下载链接