基于蛋白质的继承在酿酒酵母中的高通量筛选

Summary

此协议说明一种高通量方法来功能屏幕在酿酒酵母中的蛋白质基础继承。

Abstract

对后代是容易接近的生物信息的编码通常被通过 DNA 序列的变化。长寿遗传编码的蛋白质构象 （而不是序列） 长期以来被视为范式转移，但很少。这种表观遗传的元素的最佳的特征的示例包括朊病毒，拥有可以推动新的表型的遗传表现的自组装行为。许多原型朊病毒显示醒目的富含 Q 的 N 序列偏见和组装成淀粉样蛋白的折叠。这些不寻常的特征已通知筛选确定新的朊病毒蛋白的大多数努力。然而，至少三个已知的朊病毒 （包括创始的朊病毒，PrP^Sc） 不要怀有这些生化特性。因此，我们开发了一种替代的方法，探讨基于蛋白质的继承，基于属性的大规模行动的范围: 瞬态的朊病毒蛋白过度表达增加，他们获得自我模板构象的频率。本文介绍了一种分析酵母 ORFeome 能够引出基于蛋白质的继承方法。使用此策略，我们以前发现 > 1%的酵母蛋白质能燃料出现的生物性状，寿命长，性能稳定，并比遗传突变更频繁地出现。这种方法可以从事高吞吐量，横跨整个 ORFeomes 或作为特定遗传网络或环境刺激有针对性的筛选模式。正如前的遗传屏幕定义许多发展和信号转导途径，这些技术提供一种方法来探讨基于蛋白质的继承在生物过程中的影响。

Introduction

生物系统经常经历的瞬态波动蛋白质丰富。这些是否有持久的影响，在塑造的有机体或未来几代人的表型仍不清楚。这个生物学的著名实例涉及一类罕见的蛋白质，朊病毒，开车遗传性基因组原封不动的出现。相反，这些临的 teinaceous 和在发感染粒子传输通过自我延续的变化对蛋白质构象^1，2的表型。这种类型的继承被发现不寻常的继承模式的破坏性的神经退行性疾病的原因。然而，在生物体从真菌到哺乳动物^{3，4，，56，7，8，，910}研究以来发现朊病毒样元素可以赋予自适应值。尽管如此，朊病毒已被视为美丽的向往但罕见生物古怪。

这个普遍的智慧是部分举行因为表征蛋白质基础继承长期以来一直受一小套的示例。最近系统筛查努力扩大这张照片明显确定几个新的善意取得制度朊病毒¹¹和几乎两打蛋白域¹²与燃料朊病毒样构象转化的能力。然而，因为这些方法一般集中在强氨基酸序列偏见，朊病毒被发现分享创始酵母朊病毒 [PSI⁺]^13，14，[URE3]¹⁵和 [RNQ⁺]^11，16的生化性质。这些措施包括: 1） 模块化域，富含长高分子绵延的天冬酰胺 (N) 和谷氨酰胺 (Q) 2） 组装成淀粉样 [朊病毒⁺] 构象^17，，1819，和 3） 完成 disaggregase 忠实传播从母亲到女儿^13，，2021Hsp104 函数依赖。事实上，许多善意朊病毒，包括 [噶尔⁺]，[Het-s]，和甚至原始朊蛋白 (PrP^Sc)，将错过下这样严格的标准。也许更重要的是，他们将无法捕获任何新的机制的蛋白质基础继承²²。因此，真正的生物学宽度，这种现象可能是在自然比以前想象中更为常见。

为了调查这一问题，采用高通量蛋白质组全战略。所有的朊病毒，包括 PrP^Sc，[噶尔⁺]，标志和 [Het-s]，是瞬变的因果蛋白过度表达强烈增加的朊病毒采集^{15，23，，2425，26}率。我们利用此功能，以便系统地问，跨整个酵母 ORFeome，如果稳定的蛋白质基础、 表观遗传状态可以由瞬态诱发个别蛋白质的表达。众所周知，蛋白过度表达可以改变表型²⁷。然而朊病毒蛋白是不寻常的因为他们临时生产过剩产生许多数百代后的初始的过度表达是可遗传的表型变化。我们以前采取了利用此功能，以及基于蛋白质的遗传元件，以查明的蛋白质能够重新 heritably 接线表型景观而不改变基因组²⁸几十件不寻常的继承模式。虽然有一些蛋白质被以前称为朊病毒，大多数没有，彰显了这种方法来发现新的基于蛋白质的继承形式。

Protocol

1. 初始过表达式

1. 将先前在 YPD 液体（每 1 L 10 g 酵母提取物、20 g 蛋白胨和 20 g 葡萄糖）中生长的酵母细胞（在本例中为 BY4741 MAT a 单倍体）与来自 FLEXGene ORFeome 文库的所需候选构建体（在 URA3 标记的着丝粒质骨架中受半乳糖诱导启动子控制的酵母 ORF， pBY011²⁹）中。
2. 使用高压灭菌的牙签从这些转化中挑选四个独立的菌落作为生物学重复。在 96 孔板中，在 150 μL SRaffinose-URA（0.74 g CSM-URA、6.7 g 不含氨基酸的酵母氮碱和每 1 L 20 g 棉子糖）中培养 48-72 小时。接种所有板的 A1 孔中第一个 ORF 的菌落，所有板的 A2 中第二个 ORF 的菌落，等等。
   注：除非另有说明，否则所有生长步骤均在 30 °C 和 CO₂ （407.05 ppm） 大气水平下进行。
3. 确认培养物已饱和（每个孔底部肉眼可见细胞），并使用液体处理机器人将 1：4 的 1 μL 阵列从每个 96 孔板孔接种到装有 45 μL SGal-URA（0.74 g CSM-URA、 每孔 6.7 g 不含氨基酸的酵母氮碱，每 1 L 20 g 半乳糖><。 注：这将创建一个复合板，其中每个 ORF 的 4 个生物学重复以方形图案排列。
4. 同时，准备单独的 384 孔板，每孔含有 45 μL SGal-URA 和感兴趣的压力源（例如，20 mM 的氯化锰）。按照与步骤 1.3.
   中相同的方式接种该板 注意：为了实现表型检测的最大动态范围，建议在给定压力源的 LD50 浓度附近进行 2 倍稀释系列。这可以事先完成，以确定观察生长增强和减少生长的最佳浓度。
5. 作为最终的平行对照，以相同的方式接种第三个 384 孔板，在不会诱导质粒表达的培养基中包含相同的应激源。确保板每孔含有 45 μL SD-URA（0.74 g CSM-URA、6.7 g 不含氨基酸的酵母氮碱和每 1 L 20 g 葡萄糖），并按照步骤 1.3 和 1.4 接种。
6. 立即将带有细胞的板放在微孔板叠板机上，并设置方案进行 72 小时连续循环，在室温和大气 CO₂ （407.05 ppm） 下使用配备叠板器的酶标仪测量 OD₆₀₀<。 注意：生长测量的频率将取决于运行中使用的板的数量（最终由研究者想要探测的基因和条件的数量决定）。使用的板越多，读板器完成一个循环所需的时间就越长，因此测量之间的时间也就越长（每个板的测量时间为 ~45 秒，具体取决于所采用的仪器）。
7. 生长测量后，使用相同的液体处理机器人将每孔 1 μL 的 SGal-URA 诱导的培养物（即经历过蛋白质过表达的培养物）转移到每孔含有 45 μL SD-URA 的新 384 孔板中（不允许质粒蛋白表达的培养基）。
   1. 同时，对第二组 384 孔板进行类似接种，每孔含有 45 μL SD-URA，来自在压力源存在下在 SD-URA 中生长的培养物（即，来自步骤 1.5 的培养物）。
   2. 将板在30°C下在加湿室中生长48小时至饱和（即，内部有湿纸巾的可密封塑料箱）。
8. 取上一步中的板，在含有 45 μL SD-URA 的 384 孔板中每孔重新接种 1 μL。然后，从同一源板每孔 1 μL 单独接种到含有 45 μL SD-URA 的单独 384 孔板中，并使用 stressor.
   注：这将确定在蛋白质过表达停止后，对应激源的敏感性/抗性表型是否持续存在。
9. 立即将带有细胞的板放在微孔板叠板机上，并设置方案，在室温和大气 CO₂ （407.05 ppm） 下使用酶标仪连续测量 OD₆₀₀ 48 小时。
10. 使用读板器软件将时间与 OD₆₀₀ 测量值导出为 XY 表。将每个生物重复的 OD₆₀₀ 列分组在一起并计算平均值。创建时间与 OD₆₀₀ 的 XY 图以生成生长曲线。
    1. 如前所述，比较过去过表达的培养物（即，在 SD-URA 中再接种之前最初在含半乳糖培养基中诱导的培养物）与未过表达的培养物（即在葡萄糖中繁殖的培养物）的生长速率³⁰。
11. 对于响应给定应激源而显示出显着生长差异的培养物，取决于祖先蛋白过表达，从每个生物学重复中取出 1 μL，用 10 mL 水稀释，然后将 50 μL 接种在含有 5-FOA（0.74 g CSM-URA、1 g 5-FOA、50 mg 尿嘧啶、 每升 6.7 克不含氨基酸的酵母氮碱、20 克葡萄糖和 20 克琼脂）。在 30 °C 下生长 3 天。
    1. 如果这导致每个板的菌落过多或过少，请相应地调整稀释因子。
       注意：5-FOA 通过尿嘧啶生物合成途径转化为毒性中间体。这将导致第一步转化的 URA3 标记表达质粒丢失。
12. 用高压灭菌的牙签挑选 8-32 个单菌落，并将它们固定在含有 150 μL SD-CSM 的 96 孔板上。在 30 °C 的加湿室中生长至饱和 48-72 小时。使用这些培养物接种两组含有 150 μL SD-CSM 的新 96 孔板，有和没有步骤 1.11 中的压力源。
13. 将板放在微孔板堆叠器上，并设置方案以在 48 小时连续循环上测量 OD₆₀₀
。
14. 按照步骤 1.10 分析数据，并确认在质粒丢失后，步骤 1.10 中看到的显着生长差异得以维持><。 注：这些细胞具有稳定的表型状态，这可能表明基于蛋白质的遗传。
15. 测试维持诱导表型的细胞是否具有基于蛋白质的遗传的典型标志（见下文）。

2. 朊病毒样遗传的测试

1. 伴侣介导的"固化"
   1. 测试 Hsp104 伴侣依赖性。
      1. 挑选具有稳定表型状态的酵母菌株的菌落，在含有 3 mM GdnHCl 的 YPD 板（每 1 L 10 g 酵母提取物、20 g 蛋白胨、20 g 葡萄糖和 20 g 琼脂）上划线成单个菌落，并在 30 °C 下生长 3 天。同时，以相同的方式在 YPD + 3 mM GdnHCl 上将菌落从幼稚菌株划线到单个菌落作为对照。
      2. 在含有 3 mM GdnHCl 的新鲜 YPD 平板上再重复 2 次。
      3. 由于 GdnHCl 暴露会增加娇小细胞出现的频率，因此挑选在 GdnHCl 上经历 3 次传代的多个菌落，并通过检查它们在 YP-甘油平板上生长成可见菌落的能力来检查功能性线粒体呼吸（10 克酵母提取物、20 克蛋白胨、20 毫升甘油和 20 克琼脂每 1 升）7 天后。
      4. 从 YP-甘油平板中挑选多个菌落，并与未"治愈"和幼稚（即，不携带表型状态的同基因细胞，如 BY4741 MATa 单倍体）对照相比，在压力源存在下使用生长来测试维持稳定表型状态，方式与步骤 1.13 中描述的方式类似。
   2. 测试 Hsp70 伴侣依赖性。
      1. 通过质粒"固化"。
         1. 使用表达 Hsp70 （K69M）^{25，31 显性负等位基因的 URA3 标记质粒转化幼稚细胞和具有稳定表型状态的细胞}。
         2. 为每个转化体挑选单个转化体，在 SD-URA 平板上划线成单个菌落（每 1 L 0.74 g CSM-URA、6.7 g 不含氨基酸的酵母氮碱、20 g 葡萄糖和 20 g 琼脂），并在 30 °C 和大气 CO₂ 下生长 3 天。
         3. 在 SD-URA 板上再重复此传代 2 次。
         4. 挑选多个菌落并在 5-FOA 板上划线到单个菌落以去除质粒。
         5. 为每个分离株挑选多个单菌落，并以与步骤 1.13 中描述的类似的方式测试稳定表型状态的保留（或丢失）。
      2. 通过基因杂交"治愈"。
         1. 杂交 BY4741 MAT一种单倍体菌株，具有稳定的表型状态和相反交配类型的幼稚菌株（在本例中为 BY4742 MATα），在四个酵母 Hsp70 旁系物中的两个 （ssa1Δ ssa2Δ） 中携带基因缺失><。 注意：该菌株缺乏 Hsp70 伴侣功能。
         2. 通过在 SD-LYS-MET（每 1 L 中 0.74 g CSM-LYS-MET、6.7 g 不含氨基酸的酵母氮碱、20 g 葡萄糖和 20 g 琼脂）双缺失培养基上划线到单个菌落来选择二倍体的生长。
         3. 挑选单个二倍体菌落，并在 30 °C 下在 8 mL 预孢子形成培养基（0.8% 酵母提取物、0.3% 蛋白胨、10% 葡萄糖和 100 mg/L 硫酸腺嘌呤）中生长 24 小时。
         4. 将培养物以 3,000 xg 离心 3 分钟，吸出预孢子形成 （pre-SPO） 培养基，并用无菌水洗涤沉淀一次。
         将
         5. 沉淀重悬于 2 mL 孢子形成培养基（1% 乙酸钾、0.1% 酵母提取物、0.05% 葡萄糖和 0.01% 氨基酸反添加混合物（2 g 组氨酸、10 g 亮氨酸、2 g 赖氨酸和 2 g 尿嘧啶））中）。在 25°C 下生长 5 天。
         6. 将培养物移至 30 °C 并再孵育 48 小时。
         7. 通过使用光学显微镜寻找四分体的存在来评估孢子形成的效率³²。
         8. 取 40 μL 培养物，在 1.5 mL 试管中以 3,000 xg 的速度离心 1 分钟，然后重悬于等体积的酶解酶混合物（1 M 山梨醇、0.1 M EDTA 和 10 mg/mL 酶解酶 100T）中
         9. 在 25 °C 孵育 5 分钟。
         10. 将 10 μL 消化的培养物涂在非常干燥、非常水平的 YPD 琼脂平板上，让培养物沿直线缓慢扩散到平板上。
         11. 让板在层流罩中干燥至少 30 分钟。
         12. 使用解剖显微镜，将孢子分成四分体并将它们排列在板上。
         13. 让单个单倍体孢子生长成菌落，并测试它们在 SD-HIS-LEU（每 1L 中 0.67 g CSM-HIS-LEU、6.7 g 不含氨基酸的酵母氮碱、20 g 葡萄糖和 20 g 琼脂）平板上生长的能力，表明它们都含有两种基因缺失 （ssa1Δ ssa2Δ）。
         14. 以与步骤 1.13.
             中描述的类似的方式测试每个在 Hsp70 缺陷背景中维持表型状态 注意：将这些孢子杂交回具有恢复 Hsp70 功能的野生型菌株不应恢复朊病毒表型。
2. 非孟德尔遗传的检测。
   1. 将具有稳定表型状态和同基因初始对照的单倍体菌株 BY4741 MAT与相反交配类型的同基因初始菌株（在本例中为 BY4742 MATα）杂交。
   2. 通过在 SD-LYS-MET 双缺失培养基上划线到单个菌落来选择二倍体的生长。
   3. 挑选单个二倍体菌落，并在 30 °C 下在 8 mL 预孢子形成培养基中生长 24 小时。
   4. 如上所述，重复步骤 2.2.2.3-2.2.2.12。
   5. 让单个单倍体孢子生长成菌落，并使用生长测定法通过减数分裂测试每个孢子是否维持表型状态，如步骤 1.13.
      注意：朊病毒的另一个定义特征是它们可以通过去除原始的偶然蛋白来遗传地消除。因此，将朊病毒菌株与携带原始诱导蛋白基因缺失的菌株类似杂交，将消除继承缺失的孢子中的朊病毒表型。还要注意，如果需要缺失的基因来表现朊病毒表型，但不需要繁殖朊病毒本身，那么在这种突变体中，朊病毒有可能维持在"隐蔽"状态。为了区分这两种可能性，将孢子杂交回幼稚野生型菌株，并测试朊病毒表型是否在二倍体遗传背景中重新出现，其中基因的功能已恢复。
3. 细胞诱导。
   1. 生成初始 BY4742 收件人菌株。
      1. 通过转化，引入一个有缺陷的 KAR 等位基因 （kar1-15），该等位基因在交配过程中阻止核融合²³。
      2. 通过在 YPD 肉汤中接种 0.25% 溴化乙锭的单个菌落，使该菌株"娇小"（即对线粒体呼吸无
      能为力）。
      3. 在 30 °C 下培养培养物直至晚期指数/稳定相 （OD₆₀₀ ~1）。
      4. 用含 0.25% 溴化乙锭的新鲜 YPD 以 1：1,000 稀释，然后重复两次。
      5. 一旦培养物达到晚期指数/早期稳定期 （OD₆₀₀ 0.8-1.2），通过在无菌水中以 1：10,000 的比例稀释并在 YPD 板上接种 50 μL 来接种至单个菌落。在 30 °C 下生长 3 天后，挑选多个菌落，并通过检查它们在 7 天后在 YP-甘油平板上生长成可见菌落的能力来测试每个菌落的呼吸能力不足。
   2. 对 BY4742 进行初始细胞诱导。
      1. 将具有稳定表型状态的供体 BY4741 菌株的细胞与 YPD 琼脂平板表面的幼稚 BY4742 kar1-15 受体菌株的细胞混合。
      2. 在 30 °C 和大气 CO₂ （407.05 ppm） 下生长 24 小时，并转移到含有甘油的蛋氨酸辍学培养基中（SGly-MET：每 1 L 0.74 g CSM-MET、6.7 g 不含氨基酸的酵母氮碱、20 mL 甘油和 20 g 琼脂><）。 注意：这选择了两个 BY4742 核标志物，并允许通过细胞质交换恢复功能性线粒体。
      3. 3-5 天后，挑选多个单菌落并在 SD-MET 上进行另一轮选择（每 1 L 0.74 g CSM-MET、6.7 g 不含氨基酸的酵母氮碱、20 g 葡萄糖和 20 g 琼脂）。
      4. 同时，通过在 SD-LYS-MET 培养基上传代来确认菌落不是二倍体。
   3. 进行反向细胞诱导。
      1. 在 YPD 琼脂上将新的供体菌株（这次是成功的 BY4742 kar1-15 细胞诱导剂）与娇小的幼稚 BY4741 细胞（如上所述生成）混合。
      2. 如前所述重复细胞诱导（步骤 2.3.2.1-2.3.2.4），除了在缺乏赖氨酸的甘油培养基上选择 BY4741 受体核标记（SGly-LYS：0.74 g CSM-LYS，6.7 g 不含氨基酸的酵母氮碱，20 mL 甘油和每 1 L 20 g 琼脂）。
      3. 选择多种细胞诱导剂并使用生长测定法测试稳定表型状态的维持，如之前的步骤 1.13 中所示。
4. 蛋白质转化。
   1. 准备裂解物。
      1. 在 30 °C 下在 YPD 中培养 50 mL 具有稳定表型状态的细胞 18 小时。
      将
      2. 培养物以 3,000 x g 沉淀 4 分钟，然后洗涤两次：一次在高压灭菌的 H₂O 中，然后在 1 M 山梨糖醇中。
      将
      3. 细胞重悬于 200 mL SCE 缓冲液（每 50 mL 1 M 山梨糖醇、10 mM EDTA、10 mM DTT、100 mM 柠檬酸钠和 1 片不含 EDTA 的小型蛋白酶抑制剂片剂）和 50 U/mL 酵母裂解酶 100T 中。
      4. 将混合物在 35 °C 下孵育 30 分钟。
      5. 用声波分离器在冰上以 20 kHz 和 20% 强度对细胞超声处理 10 秒。
      6. 通过在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 15 分钟来去除细胞碎片。
      7. 将上清液移至干净的试管中，加入 3 倍过量的 RNase I 和生物素化 DNase（由活性单位确定），并在 37 °C 下孵育 1 小时。
      8. 通过添加过量的链霉亲和素-琼脂糖珠子，孵育 5 分钟，然后以 10,000 x g 离心 1.5 分钟沉淀来去除 DNase I。
      9. 将上清液转移到新试管中。
   2. 准备受体原生质球。
      1. 在 YPD 至指数中期（OD₆₀₀ 范围为 0.5-1）中培养 5 mL 幼稚受体细胞。
      2. 离心收获（3,000 x g 4 分钟）并洗涤 4 次：在 H₂O 中两次，在 1 M 山梨醇中两次。
      将
      3. 细胞重悬于含有 200 U/mL 酵母裂解酶的 1 M 山梨醇中，并在 35 °C 下孵育 15 分钟以消化细胞壁。
      以
      4. 600 x g 的离心速度轻轻离心 5 分钟，收获所得的原生质球，然后用 1 mL 的 1 M 山梨糖醇洗涤，然后再次用 1 mL 的 STC 缓冲液（1 M 山梨醇、10 mM Tris pH 7.5 和 10 mM CaCl₂）洗涤。
      将
      5. 洗涤的原生质球重悬于 50 μL STC 缓冲液中。
         注意：用剪刀剪掉移液器吸头的最后 ~0.7 cm;这将产生一个更宽的嘴并防止原生质球裂解。
   3. 用蛋白质转化幼稚细胞。
      1. 用 50 μL 供体裂解物、20 μL 鲑鱼精子 DNA （2 mg/mL） 和 5 μL URA3 标记的选择质粒（例如，pAG426-GFP）转化 50 μL 原生质球等分试样^28，33。
      2. 将混合物在 25 °C 下孵育 30 分钟。
      3. 以 600 x g 离心 5 分钟以收集原生质球，并重悬于 150 μL SOS 缓冲液（1 M 山梨糖醇、7 mM CaCl₂、0.25% 酵母提取物和 0.5% 蛋白胨）中。
      4. 在 30 °C 下恢复 30 分钟。
      5. 将整个培养物接种在 SD-URA 平板上。
      6. 用含有 0.8% 琼脂的温热 （~45 °C） SD-URA 快速覆盖铺板的培养物><。 注意：这将防止原生质球破裂
      7. 将转化板在 30 °C 下孵育 2-3 天。
      8. 使用牙签，从覆盖板中挑选成功生长的细胞，并在 SD-URA 板上重新划线到单个菌落。
      9. 为每个菌落挑选数十个菌落，并在 5-FOA 板上划线以去除 URA3 标记的载体质粒。
      10. 挑选在 5-FOA 平板上生长的菌落，并像以前一样使用生长测定法测试稳定表型状态的转移（步骤 1.13）。

Results

已知蛋白质过表达会显著改变细胞表型²⁷。事实上，通过初步筛选方法，仅使用 10 个应激源，就可以从酵母 ORFeome 克隆的过表达中可重复地恢复了数百种新表型。然而，上述测定允许评估细胞在这种过表达后是否保留任何长期稳定的表型。一种能够编码这种状态的蛋白质是 Psp1。Psp1 是一种功能未知的蛋白质，可以抑制复制机制中的突变体（例如，在 pol alpha^{34 中}）。PSP1 ORF 的过表达调节了多种应激源中的细胞表型。引人注目的是，一种表型（对氯化锰的抗性）在过表达停止后很长一段时间内在细胞中维持了数百代（即，从未直接经历过 Psp1 诱导的后代，但其祖先已经经历过）（图 1A）。Psp1 的半衰期为 ~5 h³⁵，因此抗性表型极不可能是由于长寿、稳定的 Psp1 蛋白在此时间尺度上从母亲传播给女儿（因为原始蛋白质会在几代内降解）。

Discussion

他们不寻常的表型和令人费解的继承模式，确定了第一酵母朊病毒。这些朊病毒特征被用于生成算法和计算工具，屏幕为额外的朊病毒蛋白。在这里描述的方法相反，是实验和依赖瞬态的过度表达，创造一个持久变化一稳定状态编码的蛋白质构象。然而，如果"播种"朊病毒大会由为任何给定的蛋白质表达的效率是很低，这种蛋白质会不断出现作为过度屏幕这种类型的假阴性。一个此类修改要更正此问题会将 2 微米质粒蛋白表达在将来用于实验。最后，每个诱导的朊病毒有其自己独特的增长型集，将不会在每个条件明显测定。因此，不同的条件和剂量测试数目限制点击次数。

重要的是，并非所有类型的基于蛋白质的继承将同样都恢复使用此方法。不能有效地或没有毒性中高表达的蛋白质显然将不断地错过了。毛干不稳定的元素，如"mnemons，"将永远不会传播到女儿后初始过度表达²²。与此相反的是，理论上可以通过瞬时表达^42，43诱导其他类型的长寿命双稳态开关。然而，这些国家通常是不依赖于蛋白质...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
盐酸胍	Sigma	Cat#G3272-25G	化学
氯化锰	Sigma	Cat#M8054-100G	化学
乙锭	Sigma	E1510	化学
5-氟乳清酸	Sigma	Cat#F5013-50MG	化学
BY4741 MATa （his3Δ1 leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0）	Winston et al.， 1995;Brachmann et al.， 1998	N/A	酵母菌株
BY4741 MATα（他的3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0）	Winston et al.， 1995;Brachmann et al.， 1998	N/A	酵母菌株
Hsp70 （K69M）	Jarosz 等人，2014b	N/A	质粒
FLEXGene 文库	胡 等人，2007	N/A	质粒文库
葡萄糖（葡萄糖）	Fisher Scientific	D16-3	培养基成分
棉子糖	Sigma	R0250-25G	培养基成分
半乳糖	Fisher Scientific	BP656-500	培养基成分
CSM	Sunrise科学	1001-100	介质组件
CSM-URA	Sunrise Science	1004-100	介质组件
CSM-LYS	Sunrise Science	1032-100	介质组件
CSM-MET	Sunrise Science	1019-100	介质组件
CSM-LYS-MET	Sunrise Science	1035-100	介质组件
酵母提取物	Fisher科学	BP1422-2	培养基成分
蛋白胨	Research Products International	P20240-5000	培养基成分
细菌蛋白胨	BD	211677	培养基成分
甘油	EMD Millipore	GX0185-2	培养基成分
酵母氮碱，不含氨基酸	BD	291920	培养基成分
琼脂	IBI Scientific	IB49172	培养基成分
硫酸腺嘌呤	Sigma	A3159-25G	培养基成分
乙酸钾	Sigma	P1190-500G	培养基成分
尿嘧啶		Sigma U0750-100G	培养基成分
组氨酸	Sigma	H8000-100G	培养基成分
亮氨酸	Sigma	L8000-25G	介质组件
赖氨酸	Sigma	L5501-25G	介质组件
RNase I	Thermo Fisher Scientific	EN0601	酶
生物素化 DNase	Thermo Fisher Scientific	AM1906	酶
酶解酶 100T（酵母裂解酶）	Sunrise Science	N0766555	酶
酶标仪	BioTek	Synergy H1	设备
微孔板堆叠器	BioTek	BioStack3	设备
板灌装机	BiotTek	EL406	Equipment
液体处理机器人	Beckman Coulter	Biomek FX	Equipment