纳米海绵在尺寸和交联密度上的可调性

摘要

本文介绍了一种调节共价交联纳米颗粒尺寸和交联密度的方法，这些纳米颗粒由含有侧链官能团的线性聚酯制备而成。通过调控合成参数（聚合物分子量、侧链官能团引入程度以及交联剂当量），可获得适用于药物递送应用的所需纳米颗粒尺寸和交联密度。

摘要

我们描述了一种合成含侧链环氧基团的线性聚酯的方案，并将其制备成具有可控尺寸的纳米海绵。该方法首先合成一种功能化内酯，这是实现所得聚合物侧链功能化的关键步骤。随后通过开环聚合反应共聚戊内酯（VL）和烯丙基戊内酯（AVL）。在聚合完成后，通过后聚合修饰，在部分或全部侧链烯丙基上引入环氧基团。利用环氧-胺化学反应，在稀溶液中将聚合物与小分子二胺交联剂反应，根据目标纳米海绵的尺寸和交联密度形成纳米颗粒。可通过透射电子显微镜（TEM）成像对纳米海绵的尺寸进行表征，以确定其尺寸大小和分布情况。该方法提供了一条可高度调控的聚酯制备路径，从而获得可调控的纳米颗粒，可用于小分子药物的包封。由于聚合物主链的特性，这些颗粒可通过水解和酶降解实现多种疏水性小分子的可控释放。

引言

基于分子间交联的纳米颗粒，其尺寸和交联密度的精确调控对于影响和引导这些纳米体系的药物释放行为具有重要意义¹设计纳米海绵的可调性， 即通过控制前体聚合物的侧链官能团以及引入的亲水交联剂的当量数，可制备具有不同网络密度的颗粒。该方法中，前体与交联剂在溶剂中的浓度对于形成特定尺寸的纳米颗粒而非块状凝胶至关重要。采用定量核磁共振波谱法（NMR）作为表征手段，可精确测定侧链官能团的引入程度及聚合物的分子量。纳米颗粒形成后，可将其浓缩并溶于有机溶剂中，且不呈现纳米凝胶的特性。

近年来，纳米粒子药物递送领域的研究主要集中在使用聚乳酸-co聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）自组装纳米颗粒^2,3,4,5,6PLGA 具有可降解的酯键，使其适用于药物递送应用，并常因其隐形特性而与聚乙二醇（PEG）联用。⁷然而，由于PLGA颗粒的形成具有自组装特性，这些颗粒无法在有机溶剂中溶解，因而难以进行进一步的功能化修饰。相比之下，本研究所提出的方法通过共价交联形成具有明确尺寸和形貌的纳米颗粒，该纳米颗粒在有机溶剂中稳定，而在水溶液中可降解。¹该方法的优势在于能够进一步对纳米海绵表面进行化学功能化修饰⁸，其在有机溶剂中的稳定性可用于颗粒的药物化合物后负载^1,9通过该方法，疏水性小分子可通过在水相介质中沉淀实现包封。聚酯主链的疏水性与亲水性短交联剂相结合，使这些颗粒在体温下呈现无定形特性。此外，载药后颗粒可在水相介质中形成稳定的细小悬浮液，便于注射使用 体内本研究旨在评估这些聚酯纳米海绵的合成参数，并确定对尺寸和形貌设计与控制至关重要的关键因素。

方案

1. AVL 的合成与表征

1. 在500 mL双口圆底烧瓶（烧瓶1）中放入一个磁力搅拌子，用适当大小的橡胶隔垫和钢丝密封。通过插入隔垫的进气针通入氮气，同时将出气针打开，用丁烷火焰喷枪沿烧瓶外壁缓慢移动加热，对烧瓶进行火焰干燥以除去水分。
   1. 继续用火焰在烧瓶表面均匀加热，直至烧瓶内壁不再出现水汽雾化现象。移开火焰，在持续通入氮气的条件下，使烧瓶冷却至室温。
2. 加入156.25 mL无水四氢呋喃（THF） 通过 将30 mL注射器连接至1号烧瓶。使用干冰/丙酮浴将1号烧瓶冷却至-78 °C。在整个反应过程中用温度计监测温度，并根据需要添加干冰以维持-78 °C。启动磁力搅拌器，使磁力搅拌子在烧瓶内缓慢旋转，形成温和的漩涡。
3. 添加 N,N二异丙基乙基胺（DIPA）（3.30 mL，2.3 × 10⁻² mol）^-2 mol) 通过5 mL注射器加入，随后逐滴加入2.5 M n-丁基锂（9.34 mL，2.3 × 10^-2 mol 通过 一个带有针头锁定装置和金属针头的10 mL玻璃注射器连接至1号烧瓶。使用磁力搅拌器在-78 °C下继续搅拌15分钟。
4. 用火焰干燥（如步骤1.1所述）并用氩气吹扫（操作参见步骤1.1中关于氮气的描述）一个100 mL圆底烧瓶（烧瓶2）。当烧瓶冷却至可触摸时，同时移除氩气的进气口和出气口。加入56 mL无水四氢呋喃 通过 30 mL 注射器和 δ-戊内酯（VL）（1.97 mL，2.1 × 10^-2 mol 通过 5 mL 注射器
5. 将锥形瓶2中的溶液加入锥形瓶1中 通过 在持续搅拌下，于45分钟内将小导管中的液体逐滴加入 通过 一个磁力搅拌子。当2号烧瓶排空后，移除套管，使1号烧瓶在-78 °C下继续搅拌15分钟。
6. 用火焰干燥（如步骤1.1所述）并用氩气吹扫（操作参见步骤1.1中关于氮气的描述）一个25 mL圆底烧瓶（烧瓶3）。当烧瓶冷却至可触碰时，同时移除氩气的进气口和出气口，以维持烧瓶内部的正压。加入烯丙基溴（2.02 mL，2.3 × 10⁻² mol）。^-2 mol) 和六甲基磷酰胺（HMPA）（4.43 mL，2.5 × 10^-2 mol）各 通过 5 mL 注射器
7. 将烧瓶3加入烧瓶1中 通过 用小导管逐滴加入。当3号烧瓶中的液体排空后，移去导管。
   1. 尽可能使用刮勺和塑料杯将烧瓶1浸入的干冰/丙酮浴中的干冰和冷丙酮移除。加入室温丙酮，使浴液温度升至-40 °C，并让烧瓶1继续搅拌2小时，同时监测温度。如果温度高于-40 °C，可加入少量干冰以冷却丙酮。
   2. 将冷的丙酮和干冰移除，换用室温丙酮，使温度升至-10 °C。
8. 从烧瓶1中移除隔膜，并在搅拌下用150 mL饱和氯化铵溶液淬灭反应 通过 一个磁力搅拌子。将烧瓶1置于-20 °C冰箱中过夜保存。
9. 从冷冻箱中取出1号烧瓶，使其升至室温。将1号烧瓶中的溶液倒入500 mL分液漏斗中。
10. 加入50 mL二氯甲烷（DCM），盖紧分液漏斗，轻轻摇动以混合DCM与水相/四氢呋喃混合液，使产物萃取至有机相。打开分液漏斗活塞，将有机相收集至一个装有适当大小磁力搅拌子的500 mL烧杯中，暂置备用。重复此操作两次。
11. 将所有有机相收集至同一烧杯中，加入无水硫酸镁（以去除残留水分），置于磁力搅拌器上搅拌，直至新加入的无水硫酸镁在溶液中不再结块。弃去水相废液。
12. 使用玻璃漏斗中的滤纸去除有机产物溶液中的硫酸镁固体，并将有机相收集至250 mL圆底烧瓶中。用过量二氯甲烷（DCM）冲洗滤纸和硫酸镁固体，以确保完全回收产物。
13. 在30 °C加热条件下，使用水流抽气泵作为真空源，通过旋转蒸发除去产物中的溶剂。
14. 通过柱层析纯化粗产物¹⁰ 使用硅胶作为固定相，以3%乙酸乙酯/己烷开始洗脱，洗脱1个柱体积（CV），随后在5个柱体积内将梯度逐渐升至29%乙酸乙酯/己烷。用16 × 150 mm试管收集各馏分。² 硼硅酸盐玻璃管
15. 使用20%乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂进行薄层色谱分析，以确定产物组分。
16. 将所有产物馏分合并至适当大小的圆底烧瓶中，在40 °C下通过旋转蒸发除去溶剂。转移至预先称重的产物样品瓶中，置于0.05 torr的高真空条件下干燥，得到纯化的AVL。通过以下方法对产物进行表征： ¹H NMR¹¹ (CDCl₃)₃，400 MHz）：δ 5.75（m，1H），5.06（m，2H），4.26（m，2H），2.54（m，3H），2.28（m，1H），2.03（m，1H），1.87（m，1H），1.54（m，1H）。产率：2.07 g（70.56%）。

2. VL-co-AVL 的合成与表征

1. 将一个配有磁力搅拌子和橡胶隔膜的25 mL圆底烧瓶用火焰干燥，并用氮气吹扫。
   1. 使用连接在隔膜上的进气针和出气针通入氮气，同时用丁烷火焰灯沿烧瓶外表面轻轻加热，以去除水分并使烧瓶干燥。
   2. 继续用火焰均匀加热整个烧瓶，直至烧瓶内壁不再出现水汽凝结现象。移开火焰，在持续通入氮气的条件下，使烧瓶冷却至室温。
2. 快速取下圆底瓶的隔垫，加入三氟甲磺酸亚锡（2.5 mg，5.9  ×10^-6 使用刮勺将 mol 小心转移至烧瓶底部，然后更换橡胶隔垫。
3. 加入3-甲基-1-丁醇（72.6 µL，6.6 × 10^-3 mol 通过 100 µL 微量注射器和 1.33 mL 无水 DCM 通过 依次加入2 mL注射器中，使用磁力搅拌器搅拌10分钟。
4. 加入 AVL（0.48 mL，3.7 × 10^-3 mol）和 VL（1.37 mL，1.4 × 10^-2 依次加入 mol) 通过 注射器。继续搅拌18 - 20小时。
   注意：此步骤中，通过化学计量比可调节最终共聚物中 AVL 与 VL 的百分比。
5. 通过加入约5 mL甲醇（MeOH）淬灭反应。加入约100 mg固相锡清除剂，搅拌2小时。通过重力过滤除去固体。
6. 在30 °C加热条件下，使用水流抽气泵作为真空源，通过旋转蒸发除去溶剂，直至溶液变为黏稠状。将溶液逐滴加入500 mL预冷的甲醇（用干冰预冷至少1 h）中，析出白色固体片状沉淀。通过真空抽滤，将溶液过滤至装有玻璃砂芯漏斗并铺有滤纸的漏斗中，收集固体产物。
   注意：如果沉淀产生浑浊的上清液或能透过滤纸的细粉，则说明产物溶液浓度过低。应使用水泵作为真空源，在30 °C加热条件下通过旋转蒸发除去全部上清液，直至溶液变得黏稠，然后重新进行沉淀操作。
7. 将固体产物转移至预先称重的样品瓶中 通过 使用刮刀刮下，并在0.05 torr的高真空压力下干燥过夜，以收集白色片状固体。
8. 通过以下方式表征该聚合物： ¹H NMR¹¹ (CDCl₃)₃，400 MHz）：δ 5.71（m，1H），5.03（t，2H），4.08（m，4H），3.65（t，2H），2.15–2.50（m，5H），1.47–1.78（m，9H），0.91（d，6H）。81.42% VL，18.58% AVL，2,940 g/mol，578 g/mol AVL重复单元。产率：1.43 g（73.43%）。

3. 聚合后环氧化反应制备环氧戊内酯（EVL）共聚单元

1. 将 VL-co-AVL 共聚物（500 mg，1.7  × 10^-4 mol，2,940 g/mol）加入一个带有磁力搅拌子的 6 dram 小瓶中。向小瓶中加入 6.15 mL 无水二氯甲烷（DCM），涡旋混合以溶解聚合物。
2. 将间氯过氧苯甲酸（mCPBA）（74.53 mg，4.3 × 10^-4 mol）加入另一个 6 dram 小瓶中。加入 6.15 mL 无水 DCM，涡旋至 mCPBA 完全溶解。
   注：通过调整此步骤中的化学计量比，可改变烯丙基向环氧基的转化率。溶剂中最终烯丙基浓度应为 0.065 M。
3. 将 mCPBA 溶液转移至 VL-AVL 溶液中。密封反应体系，并用塑料封口膜覆盖。持续搅拌 48 小时。
4. 将反应混合物转移至 50 mL 分液漏斗中。加入 15 mL 饱和碳酸氢钠溶液，盖紧分液漏斗，轻轻摇动以混合。收集含有产物的有机层至一个装有适当大小磁力搅拌子的 50 mL 锥形瓶中（产物瓶）。
   1. 向分液漏斗中仍存在的水相中加入 5 mL DCM，盖紧，轻轻摇动。将有机相收集至产物瓶中。弃去水相废液。将有机层重新转移回分液漏斗中。重复水洗操作两次。
5. 在磁力搅拌器上持续搅拌的同时，向产物瓶中加入无水硫酸镁（以去除任何残留水分）。继续分次加入少量硫酸镁，直至新加入的硫酸镁不再结块为止。使用装有滤纸的玻璃漏斗过滤，除去固体硫酸镁，并将滤液转移至 50 mL 圆底烧瓶中。
6. 使用水力真空泵作为真空源，在 25 °C 加热条件下通过旋转蒸发除去溶剂。将圆底烧瓶中的内容物转移至已预先称重的产物小瓶中，并再次通过旋转蒸发彻底除去溶剂。在 0.05 torr 高真空条件下干燥过夜，得到白色蜡状固体。
7. 通过 ¹H NMR¹¹（CDCl₃，400 MHz）进行表征：δ 5.71（m，1H），5.03（t，2H），4.08（m，4H），3.65（t，2H），2.94（d，1H），2.90（s，1H），2.74（s，1H），2.15–2.50（m，5H），1.47–1.78（m，9H），0.92（d，6H）。VL 含量：84.53%，AVL 含量：9.65%，EVL 含量：5.82%，分子量：2,855 g/mol，EVL 重复单元分子量：1,841 g/mol。产率：417.3 mg（83.46%）。

4. 纳米海绵的合成与表征

1. 溶解VL-co-AVL-co-EVL 聚合物（200 mg，7.0 × 10⁻³ mmol）、溶剂、反应条件^-5 mol，2,855 g/mol）溶于20.01 mL无水二氯甲烷中，得到环氧化物浓度为0.0054 M的溶液。转移至带有14/20标准磨口的100 mL圆底烧瓶中。
   注意：为催化反应，可在该步骤中加入100 µL饱和碳酸氢钠水溶液。
2. 将反应烧瓶置于50 °C的油浴中。用快速涡旋搅拌溶液，并加入2,2'-(乙二氧基)双(乙胺)（21.45 µL，2.9 × 10^-4 mol 通过 用微量注射器逐滴加入。在圆底烧瓶口安装通有冷却水的水套冷凝管，并通过14/20接口连接，将溶液回流12小时。确保烧瓶口与冷凝管之间密封严密，以防止溶剂蒸发。
3. 在25 °C下通过旋转蒸发除去反应烧瓶中的过量溶剂，直至得到黏稠溶液。
4. 将一个大磁力搅拌子放入2 L烧杯中。剪取一段约六英寸长的截留分子量为10 K的透析管，将一端折叠后用透析夹夹紧。
   1. 将产物转移至10 K截留分子量（MWCO）透析袋中。用过量二氯甲烷（DCM）冲洗烧瓶，并将冲洗液转移至透析袋内。折叠透析袋顶端，用带金属丝的透析夹封闭。利用金属丝将透析袋悬挂在烧杯壁上，然后向烧杯中加入DCM，直至透析袋完全浸没。
   2. 置于磁力搅拌器上，轻轻搅拌。用铝箔覆盖烧杯，以防止溶剂挥发。将溶剂倒入废液容器中，并在48小时内每天三次更换新鲜的二氯甲烷（DCM），以去除未反应的聚合物和交联剂。
5. 从烧杯中移除所有溶剂，将透析袋中的内容物转移至装有0.45 µm聚四氟乙烯（PTFE）针头滤器的10 mL注射器中。将溶液通过滤器直接推入预先称重的产品小瓶，以去除任何残留杂质。在25 °C下通过旋转蒸发除去溶剂，随后在0.05 torr的高真空条件下放置过夜，得到浅黄色蜡状固体。
6. 表征方法 ¹H NMR¹¹ (CDCl₃)₃，400 MHz）：δ 5.71（m，1H），5.03（t，2H），4.08（m，4H），3.60–3.67（t，14H），2.94（d，1H），2.90（s，1H），2.74（s，1H），2.15–2.50（m，5H），1.47–1.78（m，9H），0.92（d，6H）。产率：176.9 mg（88.45%）。

5. 纳米海绵形态与尺寸的透射电子显微镜成像

1. 将5 mL细胞培养用水通过0.2 µm PTFE注射器滤器过滤。
2. 将0.5 mg纳米海绵放入1.5 mL离心管中，加入1 mL过滤后的细胞培养用水。使用探头式超声仪（20 kHz，40 a）在室温下以每次2秒的脉冲超声处理4–5次，直至颗粒形成均匀悬浮液。避免长时间超声或使溶液升温，以免引起颗粒聚集。
3. 在1.5 mL离心管中，将30 mg水合磷钨酸（PTA）加入1 mL过滤后的细胞培养用水中。涡旋振荡器调至最高档，振荡10秒或直至PTA完全溶解，制成3% PTA溶液。
4. 使用带22 G针头的1 mL注射器吸取0.5 mL 3% PTA溶液。向颗粒悬液中加入4滴该溶液，立即在最高档涡旋振荡10秒。用一对自闭合镊子夹取透射电镜（TEM）载网，迅速浸入颗粒悬液中三次。将载网置于盖子下静置干燥5小时，以减少灰尘在载网上的沉积。
5. 采用高对比度模式和40 µm物镜对样品进行透射电镜（TEM）成像¹²。

结果

为了评估纳米海绵的合成参数与其最终粒径之间的关系，每种聚合物前体的浓度及其侧链官能团特性至关重要。图1展示了在二氯甲烷（DCM）中加入聚合物前体和二胺交联剂后，在回流条件下反应12小时成功实现的纳米海绵合成路线。溶液中环氧基团的浓度对于形成离散颗粒同样关键。纳米海绵合成完成后，采用透射电子显微镜（TEM）成像来确定一组颗粒的精确尺寸。图2分析了一系列不同的纳米海绵实验，依据其聚合物前体的分子量以及侧链官能团的引入情况，以判断这两者之间是否存在影响纳米海绵尺寸的关系。在图2中，当每摩尔环氧基团使用一个二胺交联剂（即每摩尔环氧基团含两个胺基）时，无论是6%还是8%的EVL引入量，均观察到随着分子量的增加，颗粒尺寸呈现增大的趋势。

图3

讨论

在药物递送应用中，获得可重复的纳米海绵尺寸至关重要。聚合和纳米海绵合成过程中的多个参数会影响最终颗粒的尺寸和交联密度。我们的分析确定了三个重要参数：聚合物分子量、环氧基侧链官能度以及交联剂当量。为了在纳米海绵合成中获得一系列不同的分子量和环氧基官能度，必须调整VL-共聚-AVL共聚物的化学计量比。在共聚物环氧化过程中，可通过调节烯丙基官能团的浓度，实现对特定比例烯丙基或全部烯丙基的环氧化。若使用过量的氧化剂，可能导致聚合物链降解；然而，通过减少氧化剂用量可避免该问题。当所有烯丙基均被环氧化后，纳米海绵表面将无剩余的侧链烯丙基用于进一步功能化。此外，在溶液中进行纳米海绵合成时，环氧基的浓度需控制在0.0054 M，这对纳米海绵的合成同样至关重要。

纳米海绵反应此前已进行过评估，以确定获得目标纳米海绵尺寸范围的最佳浓度¹³。该浓度是基于聚合物中环氧基团的重复单元值计算得出的。重复单元是指每个反应性单元所对应的聚合物质量，用于计算一摩尔聚合物中反应性单元的摩尔数。例如，如下所示，若通过定量核磁共振（NMR）测定，分子量为 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,2'-(乙二氧基)双(乙胺)	Sigma-Aldrich	385506-100ML
3-甲基-1-丁醇	Sigma-Aldrich	309435-100ML	无水，≥99%
丙酮	Sigma-Aldrich	179124-4L
烯丙基溴	Sigma-Aldrich	A29585-5G	≥99%
氯化铵	Fisher Scientific	A661-500	去离子水中饱和溶液
细胞培养用水	Sigma-Aldrich	W3500-500ML	经0.45 μm 注射器滤器过滤
二氯甲烷（DCM）	Sigma-Aldrich	270997-100ML	无水，≥99%，含40–150 ppm 戊烯作为稳定剂
乙酸乙酯	Fisher Scientific	E145SK-4
EZFlow 0.2 μm 注射器滤器	Foxx Life Sciences	386-2116-OEM	亲水性PTFE，13 mm
EZFlow 0.45 μm 注射器滤器	Foxx Life Sciences	386-3126-OEM	亲水性PTFE，25 mm
Fisherbrand 一次性硼硅酸盐玻璃试管（平口）	Fisher Scientific	14-961-31
Fisherbrand 微量离心管	Fisher Scientific	14-666-318	1.5 mL
Hamilton 微量注射器，100 μL	Hamilton Company	80600	型号 710 N SYR，固定针头，22s 规格，2 英寸，2 型针尖
六甲基磷酰胺	Sigma-Aldrich	H11602-100G	≥99%，含 ≤1,000 ppm 环氧丙烷作为稳定剂
己烷	Fisher Scientific	H292-4
无水硫酸镁	Fisher Scientific	M65-500
间氯过氧苯甲酸	Sigma-Aldrich	273031-100G	经缓冲液洗涤纯化至 ≥99%
甲醇（MeOH）	Sigma-Aldrich	322415-100ML	无水，≥99%
正丁基锂溶液	Sigma-Aldrich	230707-100ML	2.5 M 己烷溶液
N,N-二异丙基乙胺	Sigma-Aldrich	550043-500ML	≥99%
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
PELCO Pro 反向（自闭式）镊子	Ted Pella, Inc.	5375-NM
磷钨酸水合物	Alfa Aesar	40116
Q55 超声波破碎仪	Qsonica	Q55-110	55 瓦，20 kHz
SiliaMetS 半胱氨酸	Silicycle	R80530B-10g
SnakeSkin 透析夹	Thermo Scientific	68011
SnakeSkin 透析管，10K 截留分子量	Thermo Scientific	68100
碳酸氢钠	Fisher Scientific	5233-500	去离子水中饱和溶液
TEM 载网	Ted Pella, Inc.	01822-F	超薄碳膜A型，400目，铜网，网格孔径约：42 µm
四氢呋喃（THF）	Sigma-Aldrich	401757-1L	无水，≥99.9%，无抑制剂
三氟甲磺酸亚锡（II）	Sigma-Aldrich	388122-1G
Vortex-Genie 2 涡旋振荡器	Scientific Industries	SI-0236
Whatman 滤纸，1号	Fisher Scientific	09-805H	圆形，185 mm
δ-戊内酯	Sigma-Aldrich	389579-100ML	经减压蒸馏纯化