筛选吞噬性免疫细胞中抑制Toll样受体信号通路的生物活性纳米颗粒

摘要

Toll样受体（TLR）信号通路在多种人类炎症性疾病的病理生理过程中发挥重要作用，而通过生物活性纳米颗粒调控TLR反应有望在多种炎症状态下产生有益效果。基于THP-1细胞的报告细胞系统为筛选新型TLR信号通路抑制剂提供了一个多功能且可靠的筛选平台。

摘要

Toll样受体（TLR）反应的药物调节在多种炎症性疾病的治疗中具有广阔前景。然而，迄今为止可用于减弱TLR信号通路的化合物十分有限，临床上尚无获批使用的TLR抑制剂（除抗疟药羟氯喹外）。随着纳米技术的快速发展，利用纳米装置调控免疫应答可能为治疗这些疾病提供一种新策略。本文介绍一种高通量筛选方法，可用于快速鉴定可抑制吞噬性免疫细胞中TLR信号通路的新型生物活性纳米颗粒。该筛选平台基于THP-1细胞系构建的报告细胞，结合比色法和荧光素酶检测技术。报告细胞由人源单核细胞系THP-1通过稳定整合两个可诱导报告基因构建而成：其中一个在受转录因子NF-κB和AP-1诱导的启动子控制下表达分泌型胚胎碱性磷酸酶（SEAP）基因，另一个在受干扰素调节因子（IRFs）诱导的启动子控制下表达分泌型荧光素酶报告基因。当TLR被激活时，报告细胞中的转录因子被激活，进而产生SEAP和/或荧光素酶，可通过相应的底物试剂进行检测。以我们先前研究建立的多肽-金纳米颗粒（GNP）杂合物文库为例，我们鉴定出一种能够有效抑制TLR4信号通路两条分支的多肽-GNP杂合物，该通路由其典型配体脂多糖（LPS）所激活。研究结果通过免疫印迹等标准生物化学技术得到了验证。进一步分析表明，该优势杂合物具有广谱抑制活性，可作用于包括TLR2、TLR3、TLR4和TLR5在内的多个TLR信号通路。该实验方法可快速评估某种纳米颗粒（或其他治疗性化合物）是否能够调节吞噬性免疫细胞中特定的TLR信号通路。

引言

Toll样受体（TLRs）是先天免疫系统中的关键组分之一，参与抵御感染的第一道防线。TLRs通过识别一系列病原体相关分子模式（PAMPs），并经由信号转导级联反应启动防御反应^1,2。目前已鉴定出10种人类TLRs；除TLR10的配体尚不明确外，每种TLR均可识别一组独特且保守的PAMPs。例如，主要位于细胞膜表面的TLR2和TLR4分别可检测来自革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的脂蛋白和糖脂；而主要存在于内体区室中的TLR3、TLR7/8和TLR9则可感知病毒和细菌的RNA和DNA产物³。当受到PAMPs刺激时，TLRs通过释放促炎介质、募集并激活效应免疫细胞以及协调后续适应性免疫反应来触发重要的免疫应答⁴。

TLR信号转导可简单分为两条主要通路^5,6。其中一条依赖于接头蛋白髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88, MyD88），即MyD88依赖性通路。除TLR3外，所有TLR均利用此通路激活B细胞活化核因子κ轻链增强子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of ....

方案

1. 细胞培养基和试剂的准备

1. 通过向RPMI-1640培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和1 mM丙酮酸钠，配制完全细胞培养基R10。
   1. 通过向 R10 培养基中添加抗生素 Zeocin（200 μg/mL）配制筛选培养基 R10-Z，以维持在 NF-κB/AP-1 激活调控下 SEAP 的表达。为筛选同时表达 SEAP 和荧光素酶报告基因的细胞，向 R10 培养基中添加 Zeocin（100 μg/mL）和 blasticidin（10 μg/mL）（即 R10-ZB）。
2. 通过将一袋底物粉末（e例如。，将QUANTI-Blue加入100 mL无内毒素的超纯水中，置于洁净的125 mL玻璃烧瓶中。
   1. 轻轻混匀溶液，并在37 °C下孵育1小时，以确保底物完全溶解。
   2. 使用0.2 μm滤膜过滤溶液以确保其无菌性（可选），并于4 °C保存，可在2周内使用。
3. 通过将一袋底物粉末溶解于适当溶剂中来配制荧光素酶底物溶液（例如，将QUANTI-Luc加入25 mL无内毒素的超纯水中，置于无菌50 mL离心管内。
   1. 完全溶解粉末后，应立即使用该溶液。或者，可将溶液于4 °C保存（最多一周）或于-20 °C保存（最多一....

结果

整体实验方案如图1所示。两种THP-1报告细胞系THP-1-XBlue和THP-1-Dual分别用于通过检测NF-κB/AP-1和IRF的激活来快速筛选TLR反应。NF-κB/AP-1的激活可通过SEAP比色法检测，而IRF的激活则通过荧光素酶发光进行监测。单核THP-1细胞可轻松诱导分化为巨噬细胞，用于筛选纳米器件对固有吞噬性免疫细胞的免疫调节活性。借助该报告系统，筛选可实现高通量进行；该方法具有良好的通用性，适用于发现新的免疫治疗药物，特别是靶向TLR等固有免疫信号通路的药物。

筛选流程及代表性结果如下所示 图2简而言之，将报告细胞接种于96孔板中，并诱导其分化为巨噬细胞（图2A 和 2B）。首先测试不同.......

讨论

由于 Toll 样受体（TLR）参与多种炎症性疾病的发病过程，它们已成为调节免疫反应和炎症状态的治疗靶点。然而，迄今为止，针对抑制 TLR 信号通路的治疗药物在临床开发中取得的成功十分有限。目前临床上使用的抗疟药物羟氯喹可抑制 TLR7 和 TLR9^35,36。 类似地，仅有少数化合物进入临床试验，其中包括 TLR4 拮抗剂依立托兰（eritoran），其在临床前研究中对脂多糖（LPS）介导的炎症反应表现出强效抑制作用^37,38，并在 I/II 期临床试验中显示出积极结果^39,40,41，但最终 III 期试验未能降低重症脓毒症患者的死亡率⁴²。该失败可能由多种因.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
THP-1-XBlue 报告细胞	InvivoGen	thpx-sp	细胞传代次数保持在 20 代以内
THP-1-Dual 报告细胞	InvivoGen	thpd-nfis	细胞传代次数保持在 20 代以内
RPMI-1640（不含 L-谷氨酰胺）	GE Health Care	SH30096.02	使用前预热至 37 °C；添加补充剂配制成完全培养基 R10
胎牛血清（经鉴定合格）	Thermo Fisher Scientific	12484028	热灭活处理；在 RPMI-1640 中终浓度为 10%
L-谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	在完全培养基 R10 中终浓度为 2 mM
丙酮酸钠	Thermo Fisher Scientific	11360-070	在完全培养基 R10 中终浓度为 1 mM
杜氏磷酸盐缓冲液（1×，不含钙、镁离子）	GE Health Care	SH30028.02	用于细胞洗涤和试剂配制
QUANTI-Blue	InvivoGen	rep-qb1	SEAP 底物
QUANTI-Luc	InvivoGen	rep-qlc2	荧光素酶底物
Zeocin	InvivoGen	ant-zn-1	报告细胞筛选用抗生素
Blasticidin	InvivoGen	anti-bl-1	报告细胞筛选用抗生素
分子生物学级二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	用于试剂配制
分子生物学级佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）	Sigma-Aldrich	P1585-1MG	用于细胞分化
大肠杆菌 K12 来源脂多糖（LPS）	InvivoGen	tlrl-eklps	TLR4 配体
Pam3CSK4	InvivoGen	tlrl-pms	TLR2/1 配体
高分子量 Poly (I:C)	InvivoGen	tlrl-pic	TLR3 配体
鼠伤寒沙门氏菌来源鞭毛蛋白（FLA-ST），超纯	InvivoGen	tlrl-epstfla	TLR5 配体
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