筛选吞噬性免疫细胞中抑制Toll样受体信号通路的生物活性纳米颗粒

摘要

Toll样受体（TLR）信号通路在多种人类炎症性疾病的病理生理过程中发挥重要作用，而通过生物活性纳米颗粒调控TLR反应有望在多种炎症状态下产生有益效果。基于THP-1细胞的报告细胞系统为筛选新型TLR信号通路抑制剂提供了一个多功能且可靠的筛选平台。

摘要

Toll样受体（TLR）反应的药物调节在多种炎症性疾病的治疗中具有广阔前景。然而，迄今为止可用于减弱TLR信号通路的化合物十分有限，临床上尚无获批使用的TLR抑制剂（除抗疟药羟氯喹外）。随着纳米技术的快速发展，利用纳米装置调控免疫应答可能为治疗这些疾病提供一种新策略。本文介绍一种高通量筛选方法，可用于快速鉴定可抑制吞噬性免疫细胞中TLR信号通路的新型生物活性纳米颗粒。该筛选平台基于THP-1细胞系构建的报告细胞，结合比色法和荧光素酶检测技术。报告细胞由人源单核细胞系THP-1通过稳定整合两个可诱导报告基因构建而成：其中一个在受转录因子NF-κB和AP-1诱导的启动子控制下表达分泌型胚胎碱性磷酸酶（SEAP）基因，另一个在受干扰素调节因子（IRFs）诱导的启动子控制下表达分泌型荧光素酶报告基因。当TLR被激活时，报告细胞中的转录因子被激活，进而产生SEAP和/或荧光素酶，可通过相应的底物试剂进行检测。以我们先前研究建立的多肽-金纳米颗粒（GNP）杂合物文库为例，我们鉴定出一种能够有效抑制TLR4信号通路两条分支的多肽-GNP杂合物，该通路由其典型配体脂多糖（LPS）所激活。研究结果通过免疫印迹等标准生物化学技术得到了验证。进一步分析表明，该优势杂合物具有广谱抑制活性，可作用于包括TLR2、TLR3、TLR4和TLR5在内的多个TLR信号通路。该实验方法可快速评估某种纳米颗粒（或其他治疗性化合物）是否能够调节吞噬性免疫细胞中特定的TLR信号通路。

引言

Toll样受体（TLRs）是先天免疫系统中的关键组分之一，参与抵御感染的第一道防线。TLRs通过识别一系列病原体相关分子模式（PAMPs），并经由信号转导级联反应启动防御反应^1,2。目前已鉴定出10种人类TLRs；除TLR10的配体尚不明确外，每种TLR均可识别一组独特且保守的PAMPs。例如，主要位于细胞膜表面的TLR2和TLR4分别可检测来自革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的脂蛋白和糖脂；而主要存在于内体区室中的TLR3、TLR7/8和TLR9则可感知病毒和细菌的RNA和DNA产物³。当受到PAMPs刺激时，TLRs通过释放促炎介质、募集并激活效应免疫细胞以及协调后续适应性免疫反应来触发重要的免疫应答⁴。

TLR信号转导可简单分为两条主要通路^5,6。其中一条依赖于接头蛋白髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88, MyD88），即MyD88依赖性通路。除TLR3外，所有TLR均利用此通路激活B细胞活化核因子κ轻链增强子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-associated protein kinases, MAPKs），从而诱导促炎介质如TNF-α、IL-6和IL-8的表达。第二条通路利用含TIR结构域的接头蛋白诱导干扰素β（TIR-domain-containing adaptor-inducing interferon-β, TRIF），即TRIF依赖性或MyD88非依赖性通路，激活干扰素（interferon, IFN）调节因子（IFN regulatory factors, IRFs）和NF-κB，导致I型IFN的产生。完整的TLR信号传导对我们日常抵御微生物和病毒感染至关重要；TLR信号通路的缺陷可导致免疫缺陷，并常对人体健康造成严重危害。⁷

然而，TLR 信号通路是一把“双刃剑”，过度且不受控制的 TLR 激活是有害的。过度活跃的 TLR 反应参与了多种急性和慢性人类炎症性疾病的发病机制^8,9。例如，脓毒症以全身性炎症和多器官损伤为特征，主要由对感染产生的急性、强烈的免疫反应所致，其中 TLR2 和 TLR4 在脓毒症的病理生理过程中起着关键作用^10,11,12。此外，TLR5 被发现参与囊性纤维化患者慢性肺部炎症的发生^13,14。而且，内体 TLR 信号通路的失调（如 TLR7 和 TLR9）与多种自身免疫性疾病（包括系统性红斑狼疮（SLE）和类风湿关节炎（RA））的发生和发展密切相关^15,16。这些汇聚的证据表明，TLR 信号通路可能是治疗多种炎症性疾病的潜在靶点¹⁷。

尽管在许多炎症性疾病中，药物对 TLR 反应的调控被认为具有治疗益处，但遗憾的是，目前临床上可用于抑制 TLR 信号通路的化合物非常有限^9,17,18。这部分归因于 TLR 通路在免疫稳态和疾病病理过程中的复杂性与冗余性。因此，寻找能够靶向多个 TLR 信号通路的新型强效治疗剂，有望填补这一关键空白，并克服将 TLR 抑制剂推进临床应用所面临的挑战。

鉴于纳米科学与纳米技术的快速发展，纳米器件因其独特性质正成为新一代 Toll 样受体（TLR）调节剂^19,20,23纳米级尺寸使这些纳米治疗剂具有更优的生物分布和持久的循环特性^24,25,26可进一步进行功能化修饰，以满足所需的药效学和药代动力学特征^27,28,29更令人振奋的是，这些新型纳米器件的生物活性源于其内在特性，这些特性可根据特定的医学应用进行定制，而不仅仅作为治疗剂的递送载体。例如，一种类似高密度脂蛋白（HDL）的纳米颗粒被设计用于通过清除TLR4配体LPS来抑制TLR4信号通路²³. 此外，我们开发了一种多肽-金纳米颗粒杂化系统，其中修饰的多肽可改变金纳米颗粒的表面特性，使其具备多种生物活性^30,31,32,33这使得它们成为一类特殊的药物（或 "纳米药物"作为下一代纳米治疗剂。

在本实验方案中，我们介绍了一种用于鉴定新型肽-金纳米颗粒（peptide-GNP）杂合物的方法，这类杂合物可有效抑制吞噬性免疫细胞中的多条 Toll 样受体（TLR）信号通路^32,33。该方法基于 commercially available THP-1 报告细胞系。报告细胞包含两种稳定的可诱导报告基因构建体：一种携带在 NF-κB 和激活蛋白 1（AP-1）转录因子可诱导启动子调控下的分泌型胚胎碱性磷酸酶（SEAP）基因；另一种包含在干扰素调节因子（IRFs）可诱导启动子调控下的分泌型荧光素酶报告基因。当 TLR 被激活后，信号转导将导致 NF-κB/AP-1 和/或 IRFs 的活化，从而启动报告基因表达并分泌 SEAP 和/或荧光素酶；这些事件可通过分光光度计或发光仪使用相应的底物试剂轻松检测。利用该方法筛选我们先前建立的 peptide-GNP 杂合物文库，我们鉴定出能够强效抑制 TLR4 信号通路的候选分子。随后，我们通过免疫印迹等其他生化方法验证了这些先导 peptide-GNP 杂合物的抑制活性，并进一步评估了其对其他 TLR 通路的作用。该方法可实现对靶向 TLR 信号通路的新型分子的快速、高效筛选。

方案

1. 细胞培养基和试剂的准备

1. 通过向RPMI-1640培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和1 mM丙酮酸钠，配制完全细胞培养基R10。
   1. 通过向 R10 培养基中添加抗生素 Zeocin（200 μg/mL）配制筛选培养基 R10-Z，以维持在 NF-κB/AP-1 激活调控下 SEAP 的表达。为筛选同时表达 SEAP 和荧光素酶报告基因的细胞，向 R10 培养基中添加 Zeocin（100 μg/mL）和 blasticidin（10 μg/mL）（即 R10-ZB）。
2. 通过将一袋底物粉末（e例如。，将QUANTI-Blue加入100 mL无内毒素的超纯水中，置于洁净的125 mL玻璃烧瓶中。
   1. 轻轻混匀溶液，并在37 °C下孵育1小时，以确保底物完全溶解。
   2. 使用0.2 μm滤膜过滤溶液以确保其无菌性（可选），并于4 °C保存，可在2周内使用。
3. 通过将一袋底物粉末溶解于适当溶剂中来配制荧光素酶底物溶液（例如，将QUANTI-Luc加入25 mL无内毒素的超纯水中，置于无菌50 mL离心管内。
   1. 完全溶解粉末后，应立即使用该溶液。或者，可将溶液于4 °C保存（最多一周）或于-20 °C保存（最多一个月），使用前取出。
      注意：两种底物溶液均对光敏感，应尽可能避免光照。溶液的多次冻融循环可能导致底物不稳定，缩短其保质期。
4. 将佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）溶于分子生物学级别的二甲基亚砜（DMSO）中，配制浓度为500 μg/mL的储存液。取储存液分装（每管500 μL，含10 μL储存液），于-20 °C保存。
5. 用无菌无内毒素的水配制LPS（E-coli K12）储存液，浓度为5 mg/mL，并分装后于-20 °C长期保存。使用时将储存液用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，配制成100 μg/mL的工作浓度LPS溶液，并于-20 °C保存备用。
   注意：用于培养的试剂配制应在生物安全柜中进行，所有容器在使用前均需灭菌。应避免PMA和LPS溶液反复冻融。

2. THP-1 报告细胞来源的巨噬细胞的培养

1. 使用两种 THP-1 报告细胞系：THP-1-XBlue 和 THP-1-Dual 细胞。前者的 SEAP 报告基因受 NF-κB/AP-1 调控，后者的双报告基因系统包含相同的 SEAP 报告基因以及受 IRF 调控的荧光素酶基因。除筛选培养基不同外，两者的培养流程完全相同。
   1. 将工作细胞储备液（约 5 × 10⁶ 个细胞）在 10 mL R10 培养基中解冻，于 300 × g 离心 5 分钟。将细胞重悬于 10 mL R10 培养基中，并转移至 T75 培养瓶中。每 2–3 天更换一次培养基，直至细胞密度达到 1 × 10⁶ 个细胞/mL。
   2. 当细胞生长达到饱和时，传代细胞以将密度降至 2–5 × 10⁵ 个细胞/mL 范围内，使细胞能够继续生长。
   3. 至少传代一次后，开始在筛选培养基中培养细胞：THP-1-XBlue 使用 R10-Z 培养基，THP-1-Dual 使用 R10-ZB 培养基。在筛选培养基中至少传代一次后，细胞即可用于实验。
      警告：细胞过度生长可导致显著的细胞死亡；细胞活力应保持在 >98%。记录传代次数，因为细胞在多次传代后（> 20 次）行为可能发生变化。
      注：为节约成本，细胞培养瓶可重复使用多次；但此操作可能增加总体污染风险以及不同培养瓶之间的交叉污染风险（若同时处理不同细胞系）。在换液和传代过程中，离心条件设定为 300 × g 离心 5 分钟。
2. 为进行报告基因检测，将细胞接种至 96 孔平底细胞培养板中，并将其分化为巨噬细胞。具体步骤如下所述。
   1. 将细胞从培养瓶转移至离心管中，于 300 × g 离心 5 分钟，然后重悬于 R10 培养基中，调整细胞浓度至 1 × 10⁶ 个细胞/mL。向细胞悬液中加入 PMA 溶液，终浓度为 50 ng/mL。
   2. 使用多通道移液器将 100 μL 细胞悬液加入 96 孔板的每个孔中。将培养板置于 37 °C（细胞培养箱中）孵育 24 小时。
   3. 孵育结束后，使用真空抽吸装置（或移液器）小心吸除培养基，用 PBS 轻柔洗涤细胞两次（每次 100 μL/孔）；每孔加入 100 μL 新鲜 R10 培养基。在进行报告基因检测前，将细胞在培养箱中静置 2 天。
      警告：静置步骤至关重要，可使细胞在 PMA 刺激后恢复至正常的静息状态，从而显著降低未刺激条件下报告基因的本底信号。
      注：经 PMA 刺激 24 小时后，细胞分化为类巨噬细胞表型，表现为贴壁生长以及具有伪足的形态特征。

3. 利用报告细胞筛选潜在的 TLR4 纳米抑制剂

注意：由于 TLR4 信号通路同时利用 MyD88 依赖性和 TRIF 依赖性途径，因此被选为主要靶点，以涵盖广泛的 TLR 信号通路。THP-1-XBlue 报告细胞主要用于检测 NF-κB/AP-1 的激活，而 THP-1-Dual 细胞则用于检测 TRIF 依赖性信号转导中的 IRF 激活。

1. 通过在筛选前绘制剂量-反应曲线来确定最佳LPS剂量。
   1. 将工作浓度的LPS溶液用R10培养基稀释至终浓度为0.01 - 100 ng/mL（按10的对数倍进行梯度稀释）。根据实验板设计，在96孔圆底培养板中进行稀释操作。确保稀释后每孔溶液体积不少于110 μL。
   2. 使用真空吸液器小心地从接种细胞的培养板（来自2.2.3）中移除培养基。
   3. 将稀释板（3.1.1）中制备的含LPS的R10培养基按照样品布局转移至培养板中。将培养板置于37 °C细胞培养箱中孵育24 h。
   4. 在24小时时，小心将上清液（80 μL/孔）转移至新的96孔圆底板中。立即对这些溶液进行比色法和/或荧光素酶发光检测，或在检测前于4 °C保存数小时，或于-20 °C保存数天。
      注意：平板布局设计应简洁明了，便于实验操作与数据分析。每种实验条件应设置2-4个重复孔。务必包含阴性对照组（LPS空白组）。建议使用THP-1-XBlue细胞检测NF-κB/AP-1激活，因为Dual细胞在分化为巨噬细胞后NF-κB/AP-1激活背景相对较高。然而，Dual细胞也可用于同时报告NF-κB/AP-1和IRF的激活。
2. 开发用于NF-κB/AP-1活化的比色法检测以及用于IRF活化的荧光素酶发光检测。
   1. 为评估 NF-κB/AP-1 的激活情况，将每个样品的上清液 20 μL 转移至新的 96 孔平底培养板中，每孔加入 180 μL 预热的 SEAP 底物溶液。在 37 °C 孵育 1–2 小时，使颜色充分显色（由粉红色变为深蓝色）。使用酶标仪在 655 nm 处读取吸光度值。
      注意：孵育时间可根据显色情况调整（30分钟至过夜孵育）。建议等待至颜色最深孔的光密度（O.D.）值超过1，同时避免显色饱和（O.D.） >3).
   2. 为分析IRF激活情况，将每个样本的上清液10 μL转移至96孔透明平底白色板中。加入荧光素酶溶液50 μL，并立即逐孔收集发光信号。
      注意：强烈建议使用带有自动加样功能的发光检测仪，以确保孔间及板间发光读数的一致性。若手动加入底物溶液，请确保操作一致  孵育时间及每孔的读数设置。
3. 在含有10 ng/mL LPS刺激的条件下，对多种肽-GNP杂合物进行筛选实验（依据3.1节）。按照3.2节中的相同步骤进行报告基因检测的建立。
   1. 将肽-GNP 杂交物用离心法浓缩至 R10 培养基中浓度为 200 nM。取 20 倍体积的杂交溶液（10 nM），在 18,000 × g 条件下离心 30 分钟，小心弃去上清液。收集管底的杂交物至新管中，用 PBS 洗涤两次，再将其重悬于 1 体积的 R10 培养基中。
   2. 将等体积的浓缩杂合体与含LPS（20 ng/mL）的R10培养基混合，使杂合体和LPS的终浓度分别为100 nM和10 ng/mL。
   3. 从培养板（2.2.3）中移除培养基，每孔加入 100 μL 混合溶液（每种条件设 3 个重复）；设置阴性对照组（仅培养基）和 LPS 对照组（10 ng/mL LPS，不含杂交体）。
   4. 37 °C孵育24小时后，将每孔培养基转移至离心管中，在18,000 × g、4 °C条件下离心30分钟。收集上清液（每管50–80 μL）至96孔圆底板中，并按照3.2节所述方法进行报告基因检测。
      注意：离心后弃去上清液时，切勿晃动管底的杂交物。
      注意：步骤 3.3.4 中的离心操作对于从培养基中去除未被细胞内化的纳米粒子杂合体至关重要，可避免这些杂合体对比色法/发光检测信号的干扰。这是因为金纳米粒子会根据其尺寸和聚集状态吸收较宽范围的光波长。

4. 验证潜在候选物的抑制作用

注意：为了验证筛选出的潜在候选化合物的抑制作用，采用两种方法。一种是固定杂合物浓度（或反之），检测刺激剂（LPS）的剂量反应；另一种是通过免疫印迹直接观察对NF-κB/AP-1和IRF3信号通路的抑制情况。

1. 在第一种方法中，使用100 nM的先导杂合分子，并在1 ng/mL和10 ng/mL两个LPS浓度下，按照3.3节所述相同步骤进行报告基因检测。同时包括一种无活性的杂合分子（基于筛选结果）作为杂合分子对照，用于比较。
2. 对于免疫印迹实验，请遵循标准的实验操作流程。
   1. 将THP-1细胞在R10培养基中培养，接种至12孔板（每孔2 × 10⁶个细胞），并通过添加50 ng/mL PMA处理24小时使其分化为巨噬细胞，随后静置培养2天。
   2. 细胞分化完成后，使用10 ng/mL LPS刺激细胞，同时或不同时加入杂合分子（100 nM），在不同时间点（0、5、15、30、60、120和240分钟）收集细胞裂解液用于免疫印迹分析。设置无活性杂合分子作为对照。
   3. 检测IκBα、磷酸化p65和磷酸化IRF3的信号，以评估先导杂合分子对NF-κB和IRF3激活的抑制作用。以β-actin和总IRF3信号作为内参对照。
      注意：信号转导通常发生较快（数小时内），而报告酶SEAP和荧光素酶的表达则需要较长时间（24小时）。建议同时在24小时时间点对测试的杂合分子进行细胞活力检测，作为另一种验证方法。

5. 评估 TLR 特异性

注意：为了研究先导肽-GNP 杂合物对 TLR 的特异性，需检测其他 TLR 信号通路，包括 TLR2、TLR3 和 TLR5。TLR7、8 和 9 被排除在外，因为 THP-1 来源的巨噬细胞对这些 TLR 的刺激反应较差，原因是巨噬细胞不表达 TLR7、8 和 9³⁴。

1. 采用3.1和3.2节所述相同步骤，测试TLR2特异性配体（Pam3CSK4）、TLR3特异性配体（poly I:C）和TLR5特异性配体（flagellin）在1 ng/mL至25 μg/mL范围内不同浓度对两种报告细胞来源巨噬细胞的作用，以确定最佳浓度。
2. 用先导杂合分子（100 nM）与5.1步骤中确定浓度的各TLR配体混合物处理细胞，按照3.3节所述实验步骤评估先导杂合分子的抑制特异性。以无活性的杂合分子作为对照进行比较。

结果

整体实验方法如图1所示。两种THP-1报告细胞系THP-1-XBlue和THP-1-Dual分别用于通过检测NF-κB/AP-1和IRF的激活来快速筛选TLR反应。NF-κB/AP-1的激活可通过SEAP比色法检测，而IRF的激活则通过荧光素酶发光进行监测。单核细胞THP-1可轻松诱导分化为巨噬细胞，用于筛选纳米器件对固有吞噬性免疫细胞的免疫调节活性。借助该报告系统，筛选可实现高通量进行；该方法具有良好的通用性，适用于发现新的免疫治疗药物，特别是靶向固有免疫信号通路（如TLR信号通路）的药物。

筛选流程及代表性结果如下所示 图2简而言之，将报告细胞接种于96孔板中，并诱导其分化为巨噬细胞（图2A 和 2B）。...

讨论

由于 Toll 样受体（TLR）参与多种炎症性疾病的发病过程，它们已成为调节免疫反应和炎症状态的治疗靶点。然而，迄今为止，针对抑制 TLR 信号通路的治疗药物在临床开发中取得的成功十分有限。目前临床上使用的抗疟药物羟氯喹可抑制 TLR7 和 TLR9^35,36。 类似地，仅有少数化合物进入临床试验，其中包括 TLR4 拮抗剂依立托兰（eritoran），其在临床前研究中对脂多糖（LPS）介导的炎症反应表现出强效抑制作用^37,38，并在 I/II 期临床试验中显示出积极结果^39,40,41，但最终 III 期试验未能降低重症脓毒症患者的死亡率⁴²。该失败可能由多种因...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
THP-1-XBlue 报告细胞	InvivoGen	thpx-sp	细胞传代次数保持在 20 代以内
THP-1-Dual 报告细胞	InvivoGen	thpd-nfis	细胞传代次数保持在 20 代以内
RPMI-1640（不含 L-谷氨酰胺）	GE Health Care	SH30096.02	使用前预热至 37 °C；添加补充剂配制成完全培养基 R10
胎牛血清（经鉴定合格）	Thermo Fisher Scientific	12484028	热灭活处理；在 RPMI-1640 中终浓度为 10%
L-谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	在完全培养基 R10 中终浓度为 2 mM
丙酮酸钠	Thermo Fisher Scientific	11360-070	在完全培养基 R10 中终浓度为 1 mM
杜氏磷酸盐缓冲液（1×，不含钙、镁离子）	GE Health Care	SH30028.02	用于细胞洗涤和试剂配制
QUANTI-Blue	InvivoGen	rep-qb1	SEAP 底物
QUANTI-Luc	InvivoGen	rep-qlc2	荧光素酶底物
Zeocin	InvivoGen	ant-zn-1	报告细胞筛选用抗生素
Blasticidin	InvivoGen	anti-bl-1	报告细胞筛选用抗生素
分子生物学级二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	用于试剂配制
分子生物学级佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）	Sigma-Aldrich	P1585-1MG	用于细胞分化
大肠杆菌 K12 来源脂多糖（LPS）	InvivoGen	tlrl-eklps	TLR4 配体
Pam3CSK4	InvivoGen	tlrl-pms	TLR2/1 配体
高分子量 Poly (I:C)	InvivoGen	tlrl-pic	TLR3 配体
鼠伤寒沙门氏菌来源鞭毛蛋白（FLA-ST），超纯	InvivoGen	tlrl-epstfla	TLR5 配体
SpectraMax Plus 384 型酶标仪	Molecular Devices	N/A	用于比色法检测
Infinite M200 Pro 型带注射器多功能酶标仪	Tecan	N/A	用于化学发光检测
Microfuge 22R 离心机	Beckman Coulter	N/A	温度可控微型离心机（最高可达 18,000 g）
Allegra X-15R 离心机	Beckman Coulter	N/A	温度可控通用离心机（适用于细胞培养）
Costar 96 孔检测板，白色，透明平底，经组织培养处理	Corning Costar	3903	用于发光检测