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一种用于异源蛋白复合物- DNA 相互作用研究的改良酵母单杂交系统

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DOI：

10.3791/56080

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2017年7月24日

 ,  , 
1Department of Neurology, University of Southern California, 2Section of Cell and Developmental Biology, University of California San Diego

本文内容

摘要

本文所述的改良型酵母单杂交检测方法是对经典酵母单杂交（Y1H）检测技术的扩展，可用于在异源系统中研究并验证任何功能基因组学中的异源蛋白复合物-DNA相互作用。

摘要

多年来，酵母单杂交技术已被证明是鉴定和验证蛋白质（如转录因子，TFs）与其DNA靶标之间物理相互作用的重要方法。本文所述方法基于酵母单杂交（Y1H）的基本原理，但经过进一步改进，用于研究和验证蛋白质复合物与其靶DNA的结合，因此被称为改良酵母单杂交（Y1.5H）检测。该检测方法成本低廉，可在常规实验室条件下轻松实施。 尽管 利用异源系统，该方法可成为测试和验证异源蛋白复合物与其DNA靶标结合的有力工具，尤其适用于各种研究系统中的功能基因组学，特别是植物基因组学。

引言

通常，为了理解蛋白质与DNA的相互作用，酵母单杂交（Y1H）实验是实验室中成功应用的首选体系1。基本的Y1H实验包含两个组分：a）报告基因构建体，其中目标DNA片段被成功克隆至编码报告蛋白的基因上游；以及b）表达构建体，用于产生目标转录因子（TF）与酵母转录激活结构域（AD）的融合蛋白。目标DNA通常被称为“诱饵”（bait），而融合蛋白则称为“猎物”（prey）。近年来，已开发出多种Y1H实验的改良版本，以满足特定需求，并各自具有优势2。现有的Y1H实验可成功用于鉴定和验证单个蛋白质与其DNA诱饵之间的相互作用，但无法鉴定异源二聚体或多聚体形式的蛋白质-DNA相互作用。

本文所述方法是对现有酵母单杂交（Y1H）技术的改进，使研究人员能够同时研究多种蛋白质与其靶DNA序列的结合。该实验的目的是在酵母系统中表达带有激活结构域的目标蛋白（pDEST22: TF），并评估候选DNA区域（与报告基因融合）在存在和/或不存在相互作用蛋白伴侣（pDEST32ΔDBD-TF）情况下的激活状态。该实验将帮助我们确定这两种蛋白之间的相互作用是否为靶标激活所必需。该系统兼容GATEWAY克隆技术，因此可在常规实验室条件下实施。本方案基于直接转化方法，便于在酵母系统中共转化不同的转录因子（TF）。因此，这是一种有利策略，可用于验证蛋白复合物与其可能DNA靶标的结合，进而对任何生物系统进行体外（in vitro）分子和功能验证。目前的技术，如串联亲和纯化（TAP）方法，成本较高且劳动密集，但可大规模检测蛋白异源复合物3,4,5。而这种改进的酵母单杂交方法可在常规实验室小规模条件下成功实施（图1），且具有成本效益。Y1.5H实验可帮助科研人员利用异源系统测试并验证关于多聚体蛋白复合物结合共同DNA靶标功能的假设。基于实验结果，可在所选研究系统中进一步通过体内（in vivo）实验验证该假设。最近，我们已应用此方法阐明了一个转录因子及其作用模式在拟南芥开花调控中的功能6。

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方案

1. 报告质粒的构建与制备

  1. PCR扩增启动子区域 / "片段" （建议长度约为 250 - 500 bp）的目标 DNA 片段，用于后续通过特定方法克隆至入门载体中 E. coli (TOP10)
  2. 经测序验证后，将阳性克隆亚克隆至相容的 pGLacZi 表达载体中 7 如前所述 8,9,10,11.
  3. 通过将 pGLacZi 以同源重组方式整合到酵母菌株（YM4271）的启动子区域，转化该酵母菌株，以构建酵母报告菌株，具体步骤如前所述 12,13酵母菌株的转化及阳性克隆的验证步骤，以及培养基配方未在此描述，因为这些步骤与经典的Y1H实验方案相似。 9,10,11,12,13pEXP-AD502 对照质粒可用于在定量β-半乳糖苷酶活性时进行归一化处理，具体方法如前所述。 8.
  4. 将目标转录因子或蛋白及其相互作用蛋白分别克隆至pDEST22和pDEST32ΔDBD（pDEST32缺失DNA结合域）表达载体中。转化后的酵母启动子片段和转录因子克隆将在后续实验步骤中使用。

2. 改良Y1.5H方案

  1. 第1天（下午），从5 mL培养液开始 SD-Ura 从培养皿或甘油菌种中挑取菌落，置于30 °C摇床中过夜培养。
    注意：该培养物可从新鲜划线的平板直接开始，或直接从含有DNA片段的酵母克隆的25%或30%甘油保存菌种开始。
  2. 第2天下午，取500 μL过夜培养物接种于10 mL YPDA培养基中，30 °C摇床中过夜培养。
  3. 第3天（清晨及整个下午）：制备感受态细胞（清晨）。
    1. 接种2 mL过夜培养物到100 mL YPDA培养基中，于30 °C摇床培养。将该新鲜培养物培养至OD600 达到 0.4–0.8（3–5 小时）。
      注意：检测 OD600 过夜培养物的起始点OD600 此步骤的OD值应为0.1–0.2。使用过度或不足生长的菌液可能延长实验时间。
    2. 在1000 × g、21 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。
    3. 用涡旋振荡或反复吹吸的方式，将沉淀重悬于10 mL无菌水中。
    4. 在1000 × g、21 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。
    5. 用涡旋振荡器或反复吹吸，将沉淀重悬于2 mL Tris-乙二胺四乙酸（TE）/乙酸锂（LiAc）溶液中。
      注意：请参见 TE/LiAc 的配方 表1.
    6. 离心5分钟，1000 × g，21°C。弃去上清液。
    7. 将沉淀重悬于4 mL TE/LiAc中，加入400 μL鲑鱼精DNA（10 mg/mL），上下吹打混匀，随后进行下一步操作。
  4. 共转化：对细胞进行热激处理（在下午晚些时候）
    1. 在96孔圆底混匀板中，每孔分装20 μL细胞。
    2. 向各孔中分别加入 150 ng（约 1.5 µL）的 pDEST22: TF 质粒、pDEST32ΔDBD: TF 质粒以及 pEXP-AD502 和 pDEST32ΔDBD: TF（归一化对照）。
      注意：为获得最佳结果，建议每种质粒 pDEST22: TF 和 pDEST32ΔDBD: TF 各使用约 150 ng，以实现成功的共转化。具体用量可能因载体构建和质粒表达情况而异，因此每次实验均需进行优化。用户也可根据需要自行选择是否增设另一对照，即 pDEST22-TF 与 pDEST32deltaDBD 的组合。
    3. 每孔加入 100 µL TE/LiAc/聚乙二醇（PEG）混匀三次).
      注意：请参见 TE/LiAc/PEG 的配制方法 表1.
    4. 用透气封膜封住培养板，在 30 °C 下孵育 20 - 30 分钟（可更长时间）（无需振荡）。
    5. 热激20分钟（精确地在 42 °C 下。
  5. 接种细胞。
    1. 在1000 × g、21 °C条件下离心5分钟。使用多通道移液器移除上清液。加入110 μL TE缓冲液并混匀。
    2. 在1000 × g、21 °C条件下离心5分钟。使用多通道移液器移除100 μL上清液。用打孔器重悬沉淀。
    3. 转移细胞于 SD-Trp-Leu 琼脂平板。将平板在30 °C下孵育至下一步操作。
  6. 第5天（下午）：使用打孔器/微孔板复制器将细胞转移至新培养板。
    1. 使用多通道移液器将50 μL TE加入无菌96孔混合板（U型底）中。用TE预润洗打孔器。
      注意：打孔器或微孔板复制器应在本步骤之前以及后续实验流程中进行灭菌。常用的灭菌方法是将打孔器浸入乙醇（100%；非分子生物学级）中，然后在火焰上灼烧。待打孔针冷却1分钟后再进行操作。
      注意： 若在实验台上进行灭菌操作，需确保实验台已用乙醇预先清洁，并且周围无任何易燃物品。穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
    2. 挑取菌落并重悬于含有TE缓冲液的培养皿中。
      注意：如果平板上菌落生长良好，可直接用打孔器将菌落转移至含 TE 的平板；若存在多个菌落，则应使用无菌牙签挑取单个菌落转移至含 TE 的平板，随后进行下一步的打孔操作。
    3. 将它们转移到新的 SD-Trp-Leu 琼脂平板以获得最佳表面覆盖。将平板在30 °C下孵育至下一步操作。
  7. 第7天（下午）：开始培养以测定β-半乳糖苷酶活性。
    1. 用50 μL无菌U型底96孔混样板填充 SD-Trp-Leu 使用多通道移液器转移培养基。
    2. 在无菌的96深孔板中加入180 μL SD-Trp-Leu 使用多通道移液器转移培养基。
    3. 将打孔器在培养基中预先润湿，然后将菌落从平板转移到50 μL培养基中。
    4. 将20 μL酵母转移至180 μL的 SD-Trp-Leu 培养基并用透气封膜密封。在30 °C摇床中孵育36 h。
  8. 第9天（上午）：开始培养以进行酶活性测定。
    1. 将100 μL培养物转移至装有500 μL YPDA培养基的无菌96深孔板中。
    2. 用透气封膜覆盖已灭菌的深孔板，于37℃孵育3小时 - 30 °C、200 rpm 振荡培养5小时（至OD600 0.3-0.6).
    3. 重悬菌液，使用多通道移液器取 125 μL 转移至分光光度计检测板中（测定 OD600).
      注意：小心操作：避免产生气泡，切勿排出最后一滴，若 OD600 若读数低于0.3–0.6，根据检测结果将剩余细胞继续培养1–2小时。本步骤使用的125 μL培养物可按用户意愿弃去或转回至原始深孔板中。
    4. 将深孔板中的剩余细胞在3000 × g、21 °C条件下离心10分钟。倒置以去除上清液。
    5. 加入200 μL Z缓冲液并涡旋振荡。
      注意：请参见Z-buffer的配方 表1.
    6. 在 3000 × g 和 21 °C 条件下离心 5 分钟。倒置以去除上清液。
    7. 加入20 μL Z缓冲液，涡旋振荡。
    8. 用可耐受冻融循环的密封膜覆盖板。在通风橱中使用液氮进行冻融处理，随后在42 ºC水浴中解冻，共重复4个循环（每个循环2分钟）。
    9. 加入200 μL Z缓冲液/β-巯基乙醇（β-ME）/邻硝基苯基-β-半乳糖苷（ONPG）（分别为12 mL、21 μL、8.4 mg，可配制20 mL溶液）； 每次均需新鲜配制).
      注意：ONPG 需要一定时间才能充分溶解，因此请在此步骤前一小时配制该溶液。ONPG 作为底物用于测定 β-半乳糖苷酶活性。
    10. 在30 °C下孵育17至24小时（期间检查，若颜色提前显现，则继续进行下一步）。
  9. 第10天（上午）：终止反应并进行测量。
    1. 加入 110 μL 1M Na2CO3 终止反应并记录时间。
    2. 涡旋并以3000 × g离心10分钟，温度为21 °C。
    3. 使用多通道移液器取 125 μL 上清液，测定 OD420.
      注意：小心操作，不要排出最后一滴液体，以避免产生气泡。
    4. 计算β-半乳糖苷酶活性：1000 × OD420 /（时间（分钟）× 体积（mL）× OD）600 在电子表格中。

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结果

酵母细胞中DNA区域与目的蛋白共转化的一般平板设置流程（图2）。平板设置可根据实验需求以及所检测的DNA区域/片段数量进行调整。在本方案第5天后，应可见生长良好且呈阳性的平板，如图3所示。在本研究中，转录起始位点上游2600 bp的启动子区域被划分为六个区域或片段（FR 1-6）6。在代表性图示（图3）中，DNA区域1和4显示出与蛋白A和B复合物的阳性相互作用。通过检测β-半乳糖苷酶活性（补充表1）发现，仅片段-1的报告基因活性诱导倍数达到四倍，而片段-4未达到我们内部设定的≥两倍诱导阈值。

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讨论

现有的Y1H标准操作流程适用于鉴定单个蛋白质猎物与其DNA诱饵的结合。通过多种技术改进，现有系统已被用于定义转录调控网络。然而，已知转录因子（TFs）通常以包含两个或更多转录因子或其他蛋白质的复合物形式发挥作用，其中仅部分转录因子能够与DNA结合。那些仅具有蛋白质结合结构域而缺乏DNA结合能力的蛋白质或转录因子更倾向于与能够结合DNA的转录因子形成复合物发挥作用。使用传统Y1H进行高通量筛选时，往往会遗漏这些具有重要生物学意义的相互作用。因此，迫切需要改进Y1H检测方法，以检测异源多聚体蛋白-DNA相互作用。

本文所述方法是一种可用于检测涉及多个蛋白质或转录因子（TF）的蛋白质-DNA相互作用的技术。该方法的独特之处在于通过共转化方式转化酵母，从而实现将不同转录因子整合到酵母系统中，并进一步用于检测这些复合物与目标DNA区域的结合能力。该方法的一个显著优势是能够同时检测两种蛋白质与其DNA诱饵的相互作用。该方法无法提供特异性靶位点（如启动子）的详细信息，但可提供有关DNA区域的结合信息。同时，建议仅在已确认所研究的蛋白质-蛋白质相互作用存在之后再使用此方法。根据实验结果，应进一步开...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢 S.S. Wang、M. Amar 和 A. Galla 对手稿的审阅。本研究的资助来自美国国立卫生研究院下属的国立普通医学科学研究所，资助编号为 RO1GM067837 和 RO1GM056006（授予 S.A.K）。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
pDEST22 载体InvitrogenPQ1000101Pro-Quest 双杂交系统试剂盒
pDEST32delatDBDInvitrogenPQ1000102Pro-Quest 双杂交系统试剂盒；该载体经过修饰，为缺失DNA结合结构域的pDEST32
pENTR/D-TOPO 克隆试剂盒InvitrogenK240020
YM4271 菌株ClontechK1603-1MATCHMAKER 单杂交系统
pEXP-AD502InvitrogenPQ1000101Pro-Quest 双杂交系统试剂盒
GATEWAY LR Clonase II 酶混合物Invitrogen11791020
YPDA 培养基Clontech630410
SD-琼脂Clontech630412
SD 最小培养基Clontech630411
尿嘧啶缺陷补充剂Clontech630416
色氨酸缺陷补充剂Clontech630413
Tris 碱赛默飞世尔科技BP152-1
EDTA赛默飞世尔科技S311-500
LiAcSigma-AldrichL4158
鲑鱼精DNA（10 mg/mL）Invitrogen15632011
96孔圆底板Greiner bio-one650101
PEG3350Sigma-Aldrich1546547
96深孔板USA Scientific1896-2000
可密封铝箔USA Scientific2923-0110
ArasealExcel ScientificB-100
2-巯基乙醇赛默飞世尔科技034461-100
ONPGSigma-Aldrich73660
Na2CO3Sigma-Aldrich223484
Na2HPO4 Sigma-AldrichS3264
NaH2PO4 Sigma-AldrichS3139
KCl赛默飞世尔科技BP366-500
MgSO4 Sigma-Aldrich83266
HCl赛默飞世尔科技SA54-4
干式恒温仪赛默飞世尔科技
涡旋振荡器赛默飞世尔科技
离心机EppendorfCentrifuge 5810R
酶标仪分子装置公司SPECTRAMAX PLUS 微孔板分光光度计
培养箱赛默飞世尔科技型号 No. 5250-37 摄氏度，6250-30 摄氏度
摇床培养箱New Brunswick
水浴锅赛默飞世尔科技IsoTemp 205
打孔器
50 mL 离心管BD Falcon
烧杯Nalgene
锥形瓶Nalgene
培养皿（150 mm）Greiner bio-one

参考文献

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