本文所述的改良型酵母单杂交检测方法是对经典酵母单杂交（Y1H）检测技术的扩展，可用于在异源系统中研究并验证任何功能基因组学中的异源蛋白复合物-DNA相互作用。
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摘要
摘要
多年来，酵母单杂交技术已被证明是鉴定和验证蛋白质（如转录因子，TFs）与其DNA靶标之间物理相互作用的重要方法。本文所述方法基于酵母单杂交（Y1H）的基本原理，但经过进一步改进，用于研究和验证蛋白质复合物与其靶DNA的结合，因此被称为改良酵母单杂交（Y1.5H）检测。该检测方法成本低廉，可在常规实验室条件下轻松实施。 尽管 利用异源系统，该方法可成为测试和验证异源蛋白复合物与其DNA靶标结合的有力工具，尤其适用于各种研究系统中的功能基因组学，特别是植物基因组学。
引言
通常，为了理解蛋白质与DNA的相互作用，酵母单杂交（Y1H）实验是实验室中成功应用的首选体系1。基本的Y1H实验包含两个组分：a）报告基因构建体，其中目标DNA片段被成功克隆至编码报告蛋白的基因上游；以及b）表达构建体，用于产生目标转录因子（TF）与酵母转录激活结构域（AD）的融合蛋白。目标DNA通常被称为“诱饵”（bait），而融合蛋白则称为“猎物”（prey）。近年来，已开发出多种Y1H实验的改良版本，以满足特定需求，并各自具有优势2。现有的Y1H实验可成功用于鉴定和验证单个蛋白质与其DNA诱饵之间的相互作用，但无法鉴定异源二聚体或多聚体形式的蛋白质-DNA相互作用。
本文所述方法是对现有酵母单杂交（Y1H）技术的改进，使研究人员能够同时研究多种蛋白质与其靶DNA序列的结合。该实验的目的是在酵母系统中表达带有激活结构域的目标蛋白（pDEST22: TF），并评估候选DNA区域（与报告基因融合）在存在和/或不存在相互作用蛋白伴侣（pDEST32ΔDBD-TF）情况下的激活状态。该实验将帮助我们确定这两种蛋白之间的相互作用是否为靶标激活所必需。该系统兼容GATEWAY克隆技术，因此可在常规实验室条件下实施。本方案基于直接转化方法，便于在酵母系统中共转化不同的转录因子（TF）。因此，这是一种有利策略，可用于验证蛋白复合物与其可能DNA靶标的结合，进而对任何生物系统进行体外（i....
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方案
1. 报告质粒的构建与制备
- PCR扩增启动子区域 / "片段" （建议长度约为 250 - 500 bp）的目标 DNA 片段，用于后续通过特定方法克隆至入门载体中 E. coli (TOP10)
- 经测序验证后，将阳性克隆亚克隆至相容的 pGLacZi 表达载体中 7 如前所述 8,9,10,11.
- 通过将 pGLacZi 以同源重组方式整合到酵母菌株（YM4271）的启动子区域，转化该酵母菌株，以构建酵母报告菌株，具体步骤如前所述 12,13酵母菌株的转化及阳性克隆的验证步骤，以及培养基配方未在此描述，因为这些步骤与经典的Y1H实验方案相似。 9,10,11,12....
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结果
酵母细胞中DNA区域与目的蛋白共转化的一般平板设置流程（图2）。平板设置可根据实验需求以及所检测的DNA区域/片段数量进行调整。在本方案第5天后，应可见生长良好且呈阳性的平板，如图3所示。在我们的研究中，转录起始位点上游2600 bp的启动子区域被划分为六个区域或片段（FR 1-6）6。在代表性图示（图3）中，DNA区域1和4显示出与蛋白A和B复合物的阳性相互作用。通过检测β-半乳糖苷酶活性（补充表1）发现，仅片段-1的报告基因活性诱导达四倍，而片段-4未达到我们内部设定的≥两倍诱导阈值。
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讨论
现有的Y1H标准操作流程适用于鉴定单个蛋白质猎物与其DNA诱饵的结合。通过多种技术改进，现有系统已被用于定义转录调控网络。然而，已知转录因子（TFs）通常以包含两个或更多转录因子或其他蛋白质的复合物形式发挥作用，其中仅部分转录因子能够与DNA结合。那些仅具有蛋白质结合结构域而缺乏DNA结合能力的蛋白质或转录因子更倾向于与能够结合DNA的转录因子形成复合物发挥作用。使用传统Y1H进行高通量筛选时，往往会遗漏这些具有重要生物学意义的相互作用。因此，迫切需要改进Y1H检测方法，以检测异源多聚体蛋白-DNA相互作用。
本文所述方法是一种可用于检测涉及多个蛋白质或转录因子（TF）的蛋白质-DNA相互作用的技术。该方法的独特之处在于通过共转化方式转化酵母，从而实现将不同转录因子整合到酵母系统中，并进一步用于检测这些复合物与目标DNA区域的结合能力。该方法的一个显著优势是能够同时检测两种蛋白质与其DNA诱饵的相互作用。该方法无法提供特异性靶位点（如启动子）的详细信息，但可提供有关DNA区域的结合信息。同时，建议仅在已确认所研究的蛋白质-蛋白质相互作用存在之后再使用此方法。根据实验结果，应进一步开.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢 S.S. Wang、M. Amar 和 A. Galla 对手稿的审阅。本研究的资助来自美国国立卫生研究院下属的国立普通医学科学研究所，资助编号为 RO1GM067837 和 RO1GM056006（授予 S.A.K）。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pDEST22 载体 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest 双杂交系统试剂盒 |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest 双杂交系统试剂盒；该载体经过修饰，为缺失DNA结合结构域的pDEST32 |
| pENTR/D-TOPO 克隆试剂盒 | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 菌株 | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER 单杂交系统 |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest 双杂交系统试剂盒 |
| GATEWAY LR Clonase II 酶混合物 | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA 培养基 | Clontech | 630410 | |
| SD-琼脂 | Clontech | 630412 | |
| SD 最小培养基 | Clontech | 630411 | |
| 尿嘧啶缺陷补充剂 | Clontech | 630416 | |
| 色氨酸缺陷补充剂 | Clontech | 630413 | |
| Tris 碱 | 赛默飞世尔科技 | BP152-1 | |
| EDTA | 赛默飞世尔科技 | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| 鲑鱼精DNA（10 mg/mL） | Invitrogen | 15632011 | |
| 96孔圆底板 | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96深孔板 | USA Scientific | 1896-2000 | |
| 可密封铝箔 | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-巯基乙醇 | 赛默飞世尔科技 | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCl | 赛默飞世尔科技 | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCl | 赛默飞世尔科技 | SA54-4 | |
| 干式恒温仪 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 涡旋振荡器 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 离心机 | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| 酶标仪 | 分子装置公司 | SPECTRAMAX PLUS 微孔板分光光度计 | |
| 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 型号 No. 5250-37 摄氏度，6250-30 摄氏度 | |
| 摇床培养箱 | New Brunswick | ||
| 水浴锅 | 赛默飞世尔科技 | IsoTemp 205 | |
| 打孔器 | |||
| 50 mL 离心管 | BD Falcon | ||
| 烧杯 | Nalgene | ||
| 锥形瓶 | Nalgene | ||
| 培养皿（150 mm） | Greiner bio-one |
参考文献
- Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
- Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012). <....
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