用于异构蛋白复合物 - DNA相互作用研究的修饰的酵母一杂交系统

一般地，为了了解蛋白质-DNA相互作用，所述Y1H测定是在实验室设置¹成功地使用的优选系统。基本的Y1H测定涉及两个组分:a）在编码报道蛋白的基因上游成功克隆了目标DNA的报道构建体;和b）将在感兴趣的TF和酵母转录激活结构域（AD）之间产生融合蛋白的表达构建体。感兴趣的DNA通常被称为"诱饵"，而融合蛋白被称为"猎物"。在过去几年中，已经开发了多种版本的Y1H测定法，以适应具体需求，具有自己的优点² 。可以成功实施现有的Y1H测定，以一次鉴定和验证一种蛋白质与其DNA诱饵的相互作用，但缺乏识别异二聚体或多聚体蛋白质 - DNA相互作用的能力。

1.构建和记录质粒制备

1. PCR扩增待分析的靶DNA的启动子区/"片段"（优选约250-500bp），以使用大肠杆菌 （TOP10）进一步克隆入入载体。
2. 一旦测序确认，亚克隆阳性克隆在⁷如前所述^{8，9，10，11}兼容pGLacZi表达载体。
3. 通过pGLacZi的同源重组变换启动子融合（YM4271）的酵母菌株来产生酵母报告菌株如前面^12,13说明。这里没有描述具有DNA区域的酵母菌株与培养基配方的转化和确认步骤，因为步骤类似于经典的Y1H方案屁股= "外部参照"> ^{9，10，11，12，13。}所述PEXP-AD502对照质粒可以同时quantifiying如前所述^8β半乳糖苷酶活被用于归一化目的。
4. 克隆感兴趣的TF或蛋白质，随后将相互作用的蛋白质伴侣克隆到pDEST22和pDEST32ΔDBD（pDEST32减去DNA结合域）表达载体中。转化的酵母启动子片段和TF克隆随后在方案中进一步使用。

2.修改Y1.5H协议

1. 在第1天（下午），从培养皿或甘油浆中的SD-Ura中的 5mL培养物开始，并在30℃振荡器中孵育过夜。
   注意:这种培养可以从新鲜条纹板或直接从酵母的25％或30％甘油原料开始用DNA片段克隆。
2. 在第2天（下午），用500μL过夜培养物接种10mL YPDA培养基，并在30℃振荡器中孵育过夜。
3. 第3天（清晨和整个下午）:准备感受态细胞（清晨）。
   1. 用2 mL过夜培养物接种100mL的YPDA培养基，并在30°C振荡器中孵育。生长这种新鲜的培养物，直到OD ₆₀₀达到0.4-0.8（3-5小时）。
      注意:检查过夜培养物的OD ₆₀₀ ，并确保此步骤的起始点OD ₆₀₀为0.1 - 0.2。使用过度培养或培养不足的培养物可能会延长实验。
   2. 在1000xg和21℃下离心5分钟。丢弃上清液。
   3. 使用旋涡或上下移液将颗粒重建在10mL无菌水中。
   4. 在1000xg和21℃下离心5分钟。丢弃上清液。
   5. Reconstitu使用涡旋或吸管上下游，在2mL Tris-乙二胺四乙酸（TE）/乙酸锂（LiAc）中沉淀。
      注意:请参见表1中 TE / LiAc的配方。
   6. 离心5分钟1000 xg和21°C。丢弃上清液。
   7. 在4 mL TE / LiAc + 400μL鲑鱼精DNA（10 mg / mL）中上下重复悬浮沉淀，并进行下一步。
4. 共同转化:热休克细胞（下午晚些时候）
   1. 在96孔混合板（U底）中分配每孔20μL的细胞。
   2. 向孔中加入每个pDEST22:TF质粒，pDEST32ΔDBD:TF质粒和pEXP-AD502加pDEST32ΔDBD:TF（归一化对照）150ng（〜1.5μL）
      注意:为了成功共同转化，pDEST22:TF和pDEST32ΔDBD:TF质粒各约150ng，预期最佳结果。可以随构建体和质粒表达而变化需要每个实验进行优化。另外一个控件pDEST22-TF加pDEST32deltaDBD也可以由用户自行决定。
   3. 每孔加入100μLTE / LiAc /聚乙二醇（PEG）（ 混合三次 ）。
      注意:请参见表1中 TE / LiAc / PEG的配方。
   4. 用透气密封盖住板，并在30℃下孵育20-30分钟（可以更长时间）（无需搅拌）。
   5. 在42℃下热冲击20分钟（ 精确 ）。
5. 平板细胞
   1. 在1000xg和21℃下离心5分钟。使用多通道移液器去除上清液。加入110μLTE，混匀。
   2. 在1000xg和21℃下离心5分钟。使用多通道移液管去除100μL上清液。用打孔机重新悬挂颗粒。
   3. 将细胞转移到SD-Trp-Leu琼脂平板上。孵化板在30°C直到下一步。
6. 第5天（下午）:使用打孔机/微孔板复制器将细胞转移到新板上。
   1. 使用多通道移液管，用无菌的96孔混合板（U底）填充50μLTE。在TE中预冲洗打孔机。
      注意:打孔机或微孔板复制器应在此步骤之前进行灭菌，随后在方案中进行灭菌。可以应用将浸入乙醇（100％，不分子生物学级），然后将其燃烧到火焰上的冲孔机的常见方法。等待1分钟冷却冲孔针。
      注意:如果在长凳上进行灭菌;确保工作台用乙醇预先清洁，周围没有任何可燃物质。穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
   2. 打开殖民地并在TE填充的板块中重新挂起。
      注意:如果平板生长平稳，可以直接打孔到TE填充板或替代地，应使用消毒牙签将单个菌落（在多个菌落的情况下）捡拾到TE填充的板上，随后打孔机可以用于下一步骤。
   3. 转移到新的SD-Trp-Leu琼脂平板上，以获得最佳的表面覆盖率。孵育板在30°C直到下一步。
7. 第7天（下午）:开始培养以测定β-半乳糖苷酶活性。
   1. 使用多通道移液管，用无菌96孔混合板（U底）填充50μL的SD-Trp-Leu培养基。
   2. 使用多通道移液管，用180μL的SD-Trp-Leu培养基填充无菌96-深孔块。
   3. 将培养基中的冲孔机预先浸湿，并将菌落从板转移到50μL的培养基。
   4. 将20μL酵母转移到180μL的SD-Trp-Leu培养基中，并用透气密封件密封块。孵化在30℃振荡器下36小时。
8. 第9天（早晨）:开始用于酶测的培养。
   1. 将100μL的培养物转移到无菌96深孔块中的500μLYPDA培养基中。
   2. 用透气密封盖住灭菌的深孔板，并在30℃下以200rpm搅拌孵育3-5小时（直至OD ₆₀₀ 0.3-0.6）。
   3. 使用多通道移液管在分光光度计平板上重新悬浮培养并转移125μL（测量OD ₆₀₀ ）。
      注意:注意:如果OD ₆₀₀低于0.3 - 0.6，请勿分配最后一滴以避免气泡，请根据读数将剩余的细胞孵育1 - 2小时。在此步骤中使用的125μL培养基可以丢弃或转移回原始的深井区块，用户可以自行决定。
   4. 在3000×g和21℃下离心深井块中剩余的细胞10分钟。去除上清液t反转。
   5. 加入200μLZ缓冲液并涡旋。
      注意:请参见表1中 Z缓冲区的配方。
   6. 在3000 xg和21℃下离心5分钟。倒置去除上清液。
   7. 加入20μLZ缓冲液和涡旋。
   8. 用可以抵抗冻融循环的密封箔覆盖板。在通风柜中使用液氮进行4个循环的冷冻/融化，然后在水浴中进行42℃（每次2分钟）。
   9. 加入200μLZ-缓冲液/β-巯基乙醇（β-ME）/邻硝基苯基-β-半乳糖苷（ONPG）（12mL，21μL，8.4mg分别得到20mL溶液; 总是制备新鲜的 ）。
      注意:ONPG需要一些时间才能正确溶解，以便在达到此步骤前一小时准备溶液。 ONPG作为测定β-半乳糖苷酶活性的底物。
   10. 在30°C下孵育高达17 - 24小时（如果颜色发展较早，请检查继续下一步）。
9. 第10天（早晨）:停止反应并测量。
   1. 加入110μL1M Na ₂ CO ₃以停止反应并记录时间。
   2. 涡旋并在3000 xg和21℃下离心10分钟。
   3. 使用多通道取125μL上清液并测量OD ₄₂₀ 。
      注意:注意，不要分配最后一滴以避免气泡。
   4. 在电子表格中计算β-gal活性:1000×OD ₄₂₀ /（时间（分钟）×体积（mL）×OD ₆₀₀ 。

用于共同转化酵母细胞中DNA区域与感兴趣蛋白质的一般平板安装程序（ 图2 ）。可以根据实验的需要和测试的DNA区域/片段的数量来修改平板设置。在方案的第5天之后， 如图3所示，可以看到良好生长和阳性的平板。在我们的研究中，从转录起始位点开始上游的2600bp的启动子区被分成6个区域或片段（FR 1-6） 6 。在代表性图（ 图3 ）中，DNA区1和4显示与蛋白A和B复合体的正相互作用。测定β-半乳糖苷酶活性（ 补充表1 ）只有片段-1显示报告基因活性的4倍诱导，而片段-4未通过我们的整合阈值≥2倍。

图1:修饰的酵母 - 一杂种（Y1.5H）测定的概述。布局描述了分析的分步过程。 请点击此处查看此图的较大版本。

图2:用于酵母细胞与感兴趣的蛋白质（TF）的共转化的平板装置的简化表示。在一般的实验装置中，板可以如图所示排列。结构和控件的组合可以根据需要进行修改，完全由用户自行决定。

图3:成功共转化后用于复制1的阳性板（SD-Trp-Leu）的代表性图像。应该观察到类似的结果，更多的重复。片段1-6代表DNA区;无片段是阴性对照。

表1:协议中使用的解决方案的配方。该表提供了测定中使用的主要缓冲液的储备和工作溶液的配方。

补充表1:β-半乳糖苷酶活性测定。这里提供的电子表格可以用作测定β-半乳糖苷酶活性的模板，使用方案中给出的公式。组合可以根据用户的判断修改构造。 请点击这里下载此文件。

作者声明没有利益冲突。