方法文章

人的 ikkknα的生产、结晶和结构测定指南

DOI：

10.3791/56091

⸱

2018年11月2日

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

b 激酶 1/α (ikkniα-chuk) 是一种 ser/thr 蛋白激酶, 主要通过激活 nf-b 转录因子参与无数的细胞活动。在这里, 我们描述了生产和晶体结构测定这种蛋白质所需的主要步骤。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一类细胞外刺激需要激活 ikkenα, 以诱导 nf-b 亚基 (p52) 通过处理其前体 p52 来产生。p52 的功能是作为一个同相或异质体与另一个 nf-b 亚基, reb。这些二聚体反过来调节与炎症、细胞存活和细胞周期有关的数百种基因的表达。ikktuα主要与 ikk2/β和 nemo 作为三元复合体保持联系。然而, 它的一小部分也被观察为低分子量复合物。不知道 p100 处理活动是否由在较大或较小的复杂池中激活 ikkenα触发。在几种癌症和炎症性疾病中检测到了 ikk% α的组织活性。为了了解 ikknα的激活机制, 并使其作为药物靶标的使用, 我们在不同的宿主系统中表达了重组的 ikknα, 如大肠杆菌、昆虫和哺乳动物细胞。我们成功地在感染杆状病毒的昆虫细胞中表达了可溶性 ikk定α, 获得了毫克数量的高纯度蛋白质, 在抑制剂存在的情况下将其结晶, 并确定其 x 射线晶体结构。在这里, 我们描述了生产重组蛋白的详细步骤, 它的结晶, 以及它的 x 射线晶体结构的测定。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

从炎症和免疫到生存和死亡, 不同的细胞功能都需要 nf-b 家族的转录活性。这些活动在细胞中得到严格控制, 失去调节导致各种病理条件, 包括自身免疫性疾病和癌症1、2、3.在没有刺激的情况下, n f-b 的活性被 b (-b) 蛋白4的抑制剂所抑制。在 b 蛋白上特定的尔斯残基的磷酸化标志着它们的泛化和随后的蛋白酶体降解或选择性处理5。两个高度同源的 ser/thr 激酶, ikk2/ββ和 ikkneα, 通过执行这些磷酸化事件6,7作为 nf-b 活动的中央调节器。

配体和受体之间的相互作用通过一系列介质传输信号, 从而激活 nf-b 因子。nf-b 信号过程大致可分为两种不同的途径--规范和非规范 (替代)8。ikk2/β的活性主要调节对炎症和先天免疫反应至关重要的规范途径的nf-b 信号9。这种途径的一个显著特点是 ik2/β10在一个迄今没有生化特征的 ikk 复合体中快速而短暂地激活--假定由 ikk1 和 ikk2 以及一个调节组件--nemo (nf-b 调制器) 组成)11,12,13。在 ikk 复合体的两个催化 ikk 亚基之间, ikk2 主要负责14特定残基的原型 b (α,-β, 和-γ) 的特定残基的磷酸化, 并与 nf-b 结合, 并且非典型的 b 蛋白 nf-b送往 105, 这是一种nf-b p50 亚基5的前体.磷酸化诱导的泛化和蛋白酶体降解的 i b (或 p105 的处理) 导致释放和激活一组特定的 nf-b 二聚体 15.由于 ikk2 功能失调而引起的异常 nf-b 活性已在许多癌症以及 2, 3,16例自身免疫性疾病中观察到。

与 ikk2/βl 相比, ikk这家α的活性调节非规范途径的 nf-gitemb 信号, 这对发育和免疫是必不可少的。ikk1 磷酸化了其 c 端段上 nf-b2/p100 的特定残留物, 从而导致其加工和 p52 的生成。转录活性 p52:RelB 异质化物的形成引发了对发育信号7、17、18、19、20的缓慢而持续的反应。有趣的是, 中心 nf-b 因子 p52 的生成在很大程度上依赖于另一个因子, nf-b 诱导激酶 (nik)21,22, 但不是 ikk2 或 nemo。在静息细胞中, 由于其持续依赖蛋白酶体的降解23,24, 25,nik的水平仍然很低。在 "非规范" 配体刺激细胞时, 在某些恶性细胞中, nik 变得稳定, 可以招募和激活 ikkgeα. nik 和 ikk1 的激酶活性对于将 p100 有效地处理为 p1007 是必不可少的。ikk1 和 nik 磷化三种丝氨酸 (ser866、870和 872) 的 nf-b2/p100 在其 c-终端段上导致其处理和 p52 的生成。非规范途径的异常激活已涉及到许多恶性肿瘤, 包括多发性骨髓瘤26,27,28。

一些高效和特定的 ikk2/β抑制剂是已知的, 虽然到目前为止没有一个已被证明是一种有效的药物。相反, ikk半特异性抑制剂是稀疏的。这在一定程度上可能是由于我们缺乏关于 ikkniα的结构和生化信息, 这限制了我们对 ikk1 在细胞中激活 nf-b 的机械基础的理解, 以及合理的药物设计。ikk2/β的 x 射线结构为我们提供了关于 ikk2/β29激活机理的见解;然而, 这些结构不能揭示如何不同的上游刺激触发激活 ikk% α或 ikk2/β来调节不同的集合 nf-b 活动30,31。为了了解 ikknα独特信号功能的机制基础, 并建立了一个合理药物设计的平台, 我们重点确定了 ikk半α的结构。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 适用于 ikkniα大规模表达的重组病毒的制备

  1. p1 病毒制备32
    1. 第1天: 6 井板的每口井中的板 sf9 细胞 (~ 6x105) (通道号小于 10) 在每口井中的6孔板和孵育。当通道细胞达到密度为2至 3 x 10 6 细胞时 , 每毫升悬浮在悬浮状态, 在密度约为 6 x 105 的情况下稀释到新鲜介质中。
    2. 第2天: 在没有抗生素和血清的情况下, 在100μl 的 Sf9 iii 或 grace 的昆虫培养基中稀释8μl 的 sf9 转染试剂。旋涡简要。
    3. 将1微克的位纯化重组杆菌 (详情见 "代表性结果")32稀释为同一介质的另 100μl, 在单独的管中。
    4. 将稀释后的 dna 和转染试剂 (总体积 ~ 210-220μl) 结合, 在室温下孵育15-30。
    5. 从井里取出介质。在不含抗生素和血清的情况下加入1毫升新鲜培养基。
    6. 将稀释后的 dna 转染试剂混合物滴入细胞。调整掉落大小, 使其不会使粘附细胞脱离。
    7. ~ 6小时后, 在顶部加入1.5 毫升新鲜培养基或去除培养基, 加入2.5 毫升新鲜培养基。加热新鲜介质至 25-27°c, 然后再添加。
    8. 在27°c 下培养细胞。每 ~ 12小时定期检查一次水井是否有病毒感染的迹象。在27°c 下进行所有 sf9 维护和表达。
    9. 第5天: 在感染60-72 小时后取出含有细胞的培养基。在 500 x g 和4°c 下离心5分钟。保存上清液;这是 p1 病毒库存。在-80°c 下冷冻小的。
  2. 选择表达最佳的 p1 病毒克隆。
    1. 板块细胞类似于步骤1.1 中所述。
    2. 第二天或电镀后约 6小时, 在不同井的细胞中加入20μl 和50μl 不同的 p1 病毒克隆库存。
    3. 通过温和的移液排出粘附细胞, 并在 500 x g 和4°c 的温度下离心 5分钟, 以60-72小时的速度收获感染细胞。保存上清液。这是 p2 病毒库存。将小的原料存放在-80°c。
    4. 在收获的细胞颗粒中加入100μl 的 2x laemmli sds 缓冲液。在 gt;95 温度下加热10分钟离心机 (通常 & gt; 10, 000 x g) 5分钟。
    5. 在 12-160 v 的 8-10 sds-page 上运行每个样品的 10-15μl, 直到染料前部到达凝胶底部。
    6. 通过标准的半干传输协议 (20 v, 30-45分钟) 在硝基纤维素 pvdf 膜上进行电转移已解决的蛋白质。
    7. 与抗 ikk1 抗体 (稀释 ~ 1:2000, 必须优化) 或抗五特他抗体 (稀释 ~ 1:3000, 必须优化) 的表达。
    8. 通过比较重组 ikk1 的表达式, 选择最佳的 p1 病毒克隆。
  3. 制备大规模 p3 病毒库。
    1. 如步骤1.1 所述, 在一个15厘米的板中, 板细胞含有25-30 毫升的 sf900 iii 介质。
    2. 电镀后约 6小时, 在细胞中添加15-300μl 的最佳表达 p1 病毒库存。
    3. 感染72小时后, 将介质小心地从板中抽入合适的管 (无菌), 并在4°c 时, 以 500-1000 x g 离心管10分钟。丢弃细胞颗粒 (如果形成) 并保存上清液。这是 p3 病毒库存。
  4. 确定大规模蛋白表达的最佳病毒滴度
    1. 板细胞在2毫升的 sf900 iii 介质, 如1.1 所述, 在一个6孔板。
    2. 在不同的井中加入20、30、40和50μl 的 p3 病毒库存 ~ 电镀后6小时。包括未受感染的控件。
    3. 从感染后48-60小时的每口井中收获细胞。
    4. 加入100μl 的 2x laemmli sds 缓冲液。在 & gt;95 温度下加热10分钟离心机 (通常为 14, 000 x 克) 5分钟。
    5. 在 8-10 sds-page 凝胶中解决每个样品的10-15μl。
    6. 将分解的蛋白质转移到硝基纤维素 pvdf 膜上, 如1.2.6 所述。
    7. 与抗 ikk1 抗体 (稀释 ~ 1:2000, 必须优化) 或抗五特他的抗体 (稀释 ~ 1:2000, 必须优化) 的布洛。
    8. 使用病毒与最佳表达的滴度的大规模表达。

2. 6x-s 标记的人类 ikk1229,33的大规模表达

  1. 在悬架文化中进行大规模的表达。在2升的 erlenmeyer 烧瓶中拆分 sf900 iii 培养基 1 l 中的细胞, 并带有通风盖。细胞密度应为 ~ 5x105细胞。
  2. 在振动台中, 在27°c 的温度下, 以 ~ 100 转/分的速度将这些细胞生长在悬浮状态中约 2天, 直到达到 1-2x10 6/ml的密度。细胞密度不得超过 2x10 6/ml。
  3. 添加所需数量的 p3 病毒, 如1.4 中评估的那样。
  4. 在振动台的27°c 下, 以 ~ 100 转/分的速度将受感染的培养时间增加48小时。
  5. 在4°c 的 lt;1,500 x 克离心收集细胞。
  6. 保存细胞颗粒并丢弃介质。
  7. 直接进行蛋白质纯化。闪存在液氮中的细胞颗粒冷冻, 并储存在-80°c, 以备将来使用。

3. he-ikk1的净化33

  1. 第1天, 重新悬浮裂解缓冲液40毫升中的细胞颗粒 (25 mm tris ph 值 8.0, 0.2% np-40, 200 mm nacl, 10 mm 咪唑, 10% 甘油, 5 mm β-硫醇和蛋白酶抑制剂鸡尾酒)。
    注: 未确定湿电池颗粒质量。通常情况下, 此步骤使用了 ~ 2 l 的区域性。
  2. 在60-70% 的占空比下通过超声对细胞进行冷却, 在 gt;1 分钟的间隔内, 通过30的5-10 脉冲将细胞冷却, 使细胞悬浮液在冰上冷却。
    注: 此步骤需要对每个声纳模型进行优化。不要让样品在10°c 以上升温。
  3. 在4°c 下, 以≥28, 000 x g 的离心剂澄清裂解液, 在4°c 下45分钟。
  4. 用裂解缓冲液平衡4毫升镍-nta 琼脂糖树脂, 并按照制造商的协议混合澄清裂解裂解裂解液 (上清液)。
  5. 允许蛋白质在4°c 的房间里在旋转搅拌机上孵育 2小时, 以约束树脂。
  6. 用含有 30 mm 咪唑的裂解缓冲液彻底清洗树脂。使用布拉德福德检测定期检查洗涤分数中的蛋白质浓度。清洗, 直到清洗分数中的蛋白质浓度达到 0.1 mg/ml。通常 & gt; 20 张床的洗涤缓冲液量需要达到这一点。
  7. 在重力流动下, 使用20毫升洗脱缓冲液 (含有 250 mm 咪唑的裂解缓冲液), 标记着 ikkenα蛋白。收集 1-1. 5 ml 分数。
  8. 通过从与莱姆利缓冲液混合的所有馏分中装入5-10μl 的样品, 检查8或 10% sds page page 凝胶上洗脱蛋白的纯度。
  9. 池峰值分数 (浓度≥2mg/ml), 并使用布拉德福德法测量蛋白质浓度。
  10. 在4°c 下, 用 tev (1:30-50 (tev 蛋白: ikk1)) 进行夜间蛋白酶摘要 (≥12小时)。
    注: 事先优化完成 (≥95%) 消化 6x-他的标签所需的 tev 蛋白酶的量. tev 蛋白酶在室内纯化。
  11. 第2天上午, 在27°c 条件下, 用 1 mm atp 在 20 mm mmcl 2、20 mm β-甘油磷酸盐、10 mm naf 和 1 mm 正纳酸钠的存在下孵育该蛋白, 时间为1小时。
  12. 通过0.45 或0.22μm 过滤器过滤蛋白质溶液。
  13. 将样品的6毫升加载到连接到自动液相色谱系统的 ~ 120 ml 制备尺寸排除柱上。在应用蛋白质样品之前, 用缓冲液 a (20 mm tris-hcl (ph 7.5)、150 mm nacl、5 mm dtt、5% 甘油) 平衡色谱柱。
    注: 在 ni-nta 亲和性纯化步骤后, 可根据蛋白质的产量使用较小的色谱柱。调整计算负载体积为柱体积的 5%)。
  14. 以 1 mlp 的流速运行尺寸排除色谱, 并在280纳米和254纳米的情况下监测洗脱情况。收集2毫升大小的分数。
  15. 在 8-10 sds-page 凝胶上检查峰值分数的纯度 (通常在60-70 毫升左右)。
  16. 将纯组分 (纯度≥95%, 浓度≥0.5 mg/ml) 池, 按照制造商的指示浓缩 10 kda 或 30 kda 分子量截止离心蛋白集中器。
  17. 用布拉德福德法定期检查精矿的蛋白质浓度, 并将样品浓缩至 8-12 mg/ml。
  18. 在液氮中分配25μl 等位和闪存。将这些闪光冷冻样品存放在-80°c 的冰柜中。

4. ikk1 结晶条件的屏幕

  1. 按照下面描述的方法计算筛选晶体所需的蛋白质总量 (按体积)。
  2. 尝试不同的抑制剂 (一般激酶抑制剂: amppnp 和 stauroseporine;ikk 特异性抑制剂: mln120b、化合物 a 和 ikk 抑制剂 xii) 进行结晶筛选。按照制造商的说明制作这些化合物的库存解决方案。确保化合物在其库存溶液中的最大浓度不超过20μm。
  3. 通过将 100μm ikk1 与200μm 抑制剂混合, 为结晶屏制备抑制剂复合物, 并在18-20 下孵育 30-40, 离心在 gt;15,000 x g 下, 在室温下进行2分钟的离心。保存上清液以进行结晶筛选。
  4. 使用市售的结晶屏 (参见材料表)。
  5. 将每个结晶试剂 (储层溶液) 的移液器–100μl 放入96孔板的储集层, 使用多通道移液器或机器人。板块现在已经准备好设置水滴了。确保板材可容纳2至3滴结晶液, 以便2至3个抑制剂可以在一个单一的板中进行筛选。
  6. 使用结晶机器人, 分配和混合0.2-0.25μl 的 ikk1: 抑制剂复合物与相同体积的储集层溶液。
    注: 筛选可以使用较大的下降体积 (0.5-1.0μl 的 ikk1 抑制剂复合物与相同体积的储集液) 手动进行。然而, 使用机器人将有助于节省有价值的试剂。
  7. 用光学透明的薄膜固定下滴后立即密封板, 以避免蒸发。使用适当的施药器正确密封。为每个抑制剂集制作复制板。在18°c 时培育一个板, 在冷藏室 (温度范围 ~ 4-6°c) 中培育另一个板。确保孵化器不受振动的影响。
  8. 使用带有偏光片的立体显微镜, 在头七天内每天检查每滴中是否出现晶体, 然后以更长的间隔检查晶体的外观。系统地记录和评分这些观察结果。
    注: 使用带有偏光片的立体显微镜, 以便可以直观地评估晶体中的生长缺陷。在这里, 晶体出现的条件是, 储集层溶液中含有 3% w\ dextran 硫酸钠盐 r 5, 000, 0.1 m bicine ph 8.5, 15% w/v 聚乙二醇 20, 000。ikk1 的晶体仅在 ikk 抑制剂 xii 的存在下生长。

5. 晶体生长优化29、33

  1. 准备库存解决方案。
    1. 在采用0.22 微米过滤器的去电离 h2o. 过滤器溶液中制备30% 的不同分子量 (平均 5, 000、000、15, 000、40, 000 da) 的 dextran 硫酸盐溶液。
    2. 在 ph 值为6.5 至9的范围内, 准备不同缓冲液的 1 m 或 0.5 m 库存。使用0.22μm 过滤器的过滤解决方案。
    3. 制备25% 或 50% (w/v) 不同分子量的 peg 溶液 (平均 mw:1000、1, 500、3, 350、4, 000、8, 000、10, 000、12, 000、20, 000 da)。使用0.22μm 过滤器的过滤解决方案。
    4. 通过系统地改变 peg 和硫酸葡聚糖的 ph 值、缓冲类型、浓度和类型来执行栅格筛选。
  2. 在18°c 和冷藏室 (温度范围 ~ 4-6°c) 优化筛选。
  3. 将同等数量的 ikk1: 抑制剂复合物与井溶液混合, 并在密封的环境中在井溶液中孵育。此步骤可以手动执行, 也可以使用点胶机器人执行。
    注: 在这里, 在以下条件下获得了最大和明确定义的晶体 (在表明均匀生长的偏光片下通过均匀颜色进行评估): 100 mm bistris ph 7.0, 对硫酸糊精 (平均 mM 15 kda) 的 2.8%-3.5%, 8.5%-10% peg 20在寒冷的房间里。

6. 在大数中生长晶体

  1. 准备以下库存解决方案, 并通过0.22μm 过滤器对其进行过滤。
    1. 准备 0.5 m bistris ph 7.0 和 bistris 丙烷 ph 值7.0 和7.5。
    2. 准备 30% (w/v) 硫酸二旋糖 (平均兆瓦 ~ 15kda)。存放在4°c。
    3. 准备 50% peg (平均兆瓦 ~ 12 kda)。
  2. 使用24个很好的悬挂下降板。
  3. 在每口井的凸起环上涂上密封胶润滑脂。
  4. 准备井溶液如下 (最终浓度): 100 mm bistris ph 7.0–7.5, 2.8–3.5% 硫酸糊精 ~ 15 kda, 8.5–10% peg ~ 12 kda。在 1.5 ml 管中制备1毫升井溶液。
    注: 根据大量蛋白质和/或硫酸糊精的不同, 在结晶条件下观察到微小的变化, 因此建议进行狭窄范围的试验。相同 ph 范围的 bistris 和 bistris 丙烷缓冲液都能产生单晶。
  5. 将井液和润滑板保存在冷藏室至少1小时。
  6. 准备 ikk1: 抑制剂复合物, 如4.3 中所述。将井液从 1.5 ml 管转移到24井板的各个井。
  7. 使用无绒毛湿巾清洁硅化 (商用或室内 (硅质/硅化) 玻璃盖板, 并使用市售气雾剂使用高压精确的空气喷射器。
  8. 将1-1.5 微米的井液放在干净的盖板上。移液器相同体积的 ikk1 抑制剂复合体, 通过向上和向下液相 3-4次轻轻混合。转动玻璃盖滑块, 用钳子将其放置在各自的井上, 并通过按下润滑脂将井封起来。
  9. 在设置了24孔板的所有水滴后, 在黑暗中的冷藏室里孵育盘子。偶尔在显微镜下检查滴液是否有晶体的外观和生长。
    注: 尚未测试在光线下孵育晶体板是否会改变结果。然而, 至关重要的是, 板是在一个最小的无振动的环境中孵化的。

7. 晶体的晶体保护

  1. 冷冻解决方案的制备。
    1. 制备 cryo a (~ 2% 硫酸地特拉坦, ~ 10% peg 12000, 60 mm bistris 丙烷 (与预期的井溶液 ph 值相同), 5 mm tris ph 7.5, 40-50 mm ncl, 2.5% 甘油)。
    2. 准备 cryo b (~ 0.3% 硫酸二旋糖, ~ 10% peg 12000, 60 mm bistris 丙烷 (与预期的井溶液 ph 值相同), 5 mm tris ph 值 7.5, 40-50 mm 氯化钠, 20 或25% 甘油或20或25% 乙二醇)。
      注: 除甘油和乙二醇外, 还测试不同的低温保护剂 (例如, peg 200、peg 400、peg mme 550、peg 1000)。
  2. 轻轻取出含有水晶的玻璃盖滑, 将其放置在固体表面, 晶体落差朝上。轻轻加入10μl 的 cryo a 溶液, 通过移液轻轻混合, 使晶体不被触摸。
    注: 这将清除碎片的晶体表面, 并帮助将晶体与初始的晶体缓冲液平衡。避免对晶体的机械和热应力。在显微镜下执行所有后续步骤, 以避免对晶体造成任何损害。
  3. 慢慢地从晶体中取出一些液体, 并保持约5-8μl 的溶液。避免晶体脱水。在随后的所有步骤中, 要格外小心, 避免晶体的机械应力和脱水。
  4. 轻轻地将2.5–4μl 的 cryo b 溶液加入到液滴上, 通过移液非常温和地混合。盖上一个小的培养皿, 以避免直接气流过水晶。等待 5分钟, 时刻注意晶体不受渗透压或脱水的快速变化。
  5. 重复步骤 7.4 4次, 慢慢地将晶体适应到冷冻溶液中。
  6. 在此阶段保留10-20μl 的冷冻溶液 (即, 允许晶体沐浴在含有约20-25% 的低温保护剂溶液中)。在最终的冷冻溶液中浸泡不同的时间 (5分钟到 1小时)。
  7. 在不同的时间点冻结多个晶体。
  8. 小心地从滴中选取一个单晶, 安装在适当的基座上, 并在液体n2中柱闭。顺利、快速地执行此步骤, 以避免晶体上形成冰。
    注: 使用比晶体最长轴稍大的环路直径选择晶体, 以便可将其安装在 argonne 国家实验室高级光子源中使用的机器人测角仪中。
  9. 将含有冷冻环的晶体存放在浸入液体n2 的皮卡中。将这些皮球存放在液体n2 dewar 烧瓶中, 直到它们准备好在同步加速器进行 x 射线衍射。进行 x 射线衍射数据的收集和处理 (第8节和第9节)。
    注: ikk1 晶体来自家庭 x 射线源的衍射数据的分辨率不够高, 无法进行结构测定试验, 尽管它表明了拟在同步加速器上筛选晶体的质量。所有衍射数据都是在美国阿贡国家实验室的先进光子源的不同波束线 (主要是 19id) 收集的。

8. x 射线数据采集

  1. 使用远程数据收集软件34, 在 aps 同步加速器源的 id19 波束线上收集 x 射线衍射数据。
    注: 对100颗晶体的上行晶体的衍射特性进行了测试。晶体通常衍射至 7-11, 只有很少的晶体衍射到5以上, 只有一个大的晶体衍射超过4.5。由于晶体在数据收集过程中迅速衰减, 因此收集了同一晶体不同部分的数据集。这是可能的, 因为晶体很大 (大于 400μm), 并且所使用的光束直径为100μm。

9. x 射线数据处理

  1. 合并在同一晶体34的不同部分收集的所有数据集。
    注: 从最佳晶体合并了7个数据集, 生成的数据完成了93%。在最高分辨率箱 (5.4-4.5) 中, 总的 ip 为 ~ 6.8), rmerge 为89%。
  2. 处理带有 hkl200034 的数据集, 以获得空间群、单位细胞尺寸、溶剂含量和非对称单元的合理组合。

10. 结构解决方案

  1. 搜索模型的准备
    1. 基于 hikk2 (pdb id 4e3c 和 4kik35) 的可用结构模型, 生成一系列 n 端子 kd 方向不同的二聚体 (在二聚体中两个 kd 的 pdb 之间打开30和 62)。经过大量试验, 这些模型都没有得到分子置换搜索解决方案。
    2. 从单粒子-em 数据33生成 ikk1 的映射。
    3. 从 ikk2 的最高分辨率结构 (pdb id 4kik) 生成人的 ikk1 模型。
    4. 停靠人类 ikk1 模型的各自的领域入不用 coot 36 的人 ikk1 的 ceio em 密度图。这使得 kd 方向旋转约24度, 并将 n 端子开口修改为 ~ 58。
    5. 将低温-em 拟合模型 (单体) 的 kd 方向应用于10.1.1 生成的所有二聚体。
  2. 分子替代
    1. 在程序中使用10.1.1 和10.1.5 的二聚体作为程序 phaser37、molrep 38 和 cns39,40的搜索模型。
      注: 在这里, 使用 10.1.5 (52 开口) 中的一个 dimers 作为搜索模型, 使用 molrep 在非对称单元中找到六个二聚体 (两个六分体)。搜索模型中的52开口类似于在精细结构中的49-50 开口 (均为6个二聚体)。

11. 结构细化

  1. 结构细化过程
    1. 通过在 cns (cns_solve_1.3)39、40中进行刚体细化, 确定该初始模型的方向和位置。
    2. 使用最大似然目标函数和使用 cns 系统 39, 40 进行扁平大容量溶剂校正, 进一步优化结构.
    3. 使用 xtalview41 基于2f o-fc和 fo-fc 映射构建模型.
      注: 在优化过程中应用 denh 辅助细化42和 ncs 约束,以提高模型的准确性。事实上, den 细化极大地改善了结构的几何形状和 r 因子, r 因子为 22.2%, 最终模型的自由 r 因子为27.8%。r 自由的显著改善必须是由于 ikk2 模型 (4kik) 生成的 ikk1 域的高精度模型。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ikknenα不同结构的克隆与表达
全长人类 ikk% α被克隆到杆状病毒表达载体 pfastbhta 在其 ecri 和 noi 限制站点内, 以获得一个 n-端六-组氨酸标记 ikk1。该标签可通过 tev 蛋白酶消化去除。由于全长 ikk% α两端都含有灵活的区域, 而灵活的区域通常使蛋白质难以结晶, 因此我们在 pfastbachta 向量的上述站点中克隆了 ikk% α的各种截断片段。利用野生类型 (wt) 和 s176e180e (ee) 主干生成了 ikknα的各种截断突变体。ikk元αee 是指磷酸化激酶的本构活性形式的模拟。重组的杆菌病毒的产生和蛋白质表达是使用先前发布的协议进行的, 但略作修改43 (图 1)。

在 ikknα结晶的困难
由于人 i...

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讨论

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两种相关 ikk 蛋白的生产、结晶及结构解
我们着手确定 ikk半α的 x 射线晶体结构, 并认为这将是一个相对简单的练习, 考虑到我们在 ikk2/ββ蛋白生产、结晶和结构测定方面的经验。然而, 我们感到非常惊讶的是, 这两种相关的蛋白质在结晶的易用性方面表现得非常不同。尽管几个知名实验室做出了努力, ikk1 结构的确定还是用了近20年的时间。这在很大程度上是由于几个关键瓶颈造成的。

第一个困难是获得高度纯净和可溶性的蛋白质形式。昆虫细胞表达系统使我们能够获得相当可溶性的大量纯蛋白质。在表达水平方面, 在昆虫细胞表达系统中, 所有的 ikk% α结构都在远低于 ikk2/β结构的水平上表达。需要注意的是, 在大肠杆菌中表达时, 两种蛋白质都不是可溶性和功能性的。在昆虫细胞表达系统中, ikk2/β片段在高浓度下表达, 根据结构的不同, 从培养的10到 30 mgl 不等。相反, ikk% α构造只能在培养的0.5 到 2.0 mgl 时生成。这种差异的原因我们仍然不知道。我们还应该尝试在原生宿主细胞中表达 ikk1 (<...

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披露

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提交人声明没有相互竞争的经济利益或其他利益冲突。

致谢

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我们感谢位于高级光子源、lemont、il 的 beamlines 19id、24id 和13id 的工作人员在收集各种晶体的数据时提供的支持。我们感谢 salk 研究所 dmitry lyumkis 在 em 地图模型构建的早期阶段为我们获取了低分辨率的低温-em 图, 该模型被用来构建最初的 ikk1 分子替换搜索模型。导致这些结果的研究得到了国家卫生研究院向 gg 提供的 ai064326、ca141722 和 gm071862 赠款的资助。sp 目前是 wellcome 信托 dbt 印度中级研究员。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Cellfectin/Cellfectin IIThermo Fisher Scientific10362100Cellfectin 现已停产，取而代之的是 Cellfectin II
Sf900 III 昆虫细胞培养基Thermo Fisher Scientific12658-027
SF9 细胞Thermo Fisher Scientific12659017
抗 IKK1 抗体Novus BiologicalsNB100-56704以前由 Imgenex 销售
抗 PentaHis 抗体Qiagen34460
PVDF 膜MilliporeIPVH00010硝酸纤维素 也可用于
Ni-NTA 琼脂糖Qiagen30210
Bradford 测定试剂BioRad500001
Superdex 200 色谱柱GE Healthcare28989335
Amicon 浓缩器MilliporeUFC801008、 UFC803008、 UFC201024、 UFC203024
化合物 A拜耳
钙生菌化学 IKK 抑制剂 XII钙生菌化学401491
星形孢菌素SIGMAS4400
MLN120B千禧年礼品
项目 AMPPNPSIGMAA2647
硫酸葡聚糖SIGMA51227， 42867， 31404，
硫酸葡聚糖Alfa AesarJ62101
PEGSIGMA93593， 81210， 88276， 95904， 81255， 89510， 92897， 81285， 95172其中一些是 SIGMA 目录中的新猫 #。我们最初拥有的是来自 Fluka，它有不同的 Cat #。
结晶筛
晶体筛 I 和 II （Crystal Screen HT）Hampton ResearchHR2-130
Index HTHampton ResearchHR2-134
PEG/Ion 和 PEG/Ion2 （PEG/Ion HT）Hampton ResearchHR2-139
PEGRX 1 和 PEGRx 2 （PEGRx HT）Hampton ResearchHR2-086
SaltRx 1 和SaltRx 2 （SaltRx HT）Hampton ResearchHR2-136
晶体支架Hampton ResearchHR8-188、190、192、194
同步加速器美国能源部的先进光子源 （APS）s 阿贡国家实验室Beamline 19 ID美国能源部的先进光子源 （APS）s 阿贡国家实验室为几乎所有科学学科的研究提供超亮、高储能环形产生的 X 射线束。

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
  3. Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
  4. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
  5. Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
  6. Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).
  7. Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
  8. Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
  9. DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
  10. Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
  11. Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
  12. Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
  13. Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
  14. Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
  15. Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
  16. Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
  17. Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
  18. Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
  19. Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
  20. Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
  21. Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
  22. Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
  23. Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
  24. Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
  25. Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
  26. Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
  27. Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
  28. Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109(2010).
  29. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581(2013).
  30. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
  31. Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
  32. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  33. Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
  34. Otwinowski, Z. aM., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
  35. Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
  36. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  37. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  38. Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
  39. Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
  40. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
  41. McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
  42. Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
  43. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581(2013).
  44. Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
  45. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  46. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).

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