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方法文章

人源IKK1/α的制备、结晶及结构测定指南

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⸱

DOI：

10.3791/56091

⸱

2018年11月2日

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

本文内容

摘要

IκB 激酶 1/α（IKK1/α CHUK）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要通过激活 NF-κB 转录因子参与多种细胞活动。本文描述了该蛋白的制备及其晶体结构测定所需的主要步骤。

摘要

一类细胞外刺激需要激活IKK1/α，以通过其前体p100的加工诱导生成NF-κB亚基p52。p52可作为同源二聚体或与另一NF-κB亚基RelB形成异源二聚体发挥作用。这些二聚体进而调控数百个与炎症、细胞存活及细胞周期相关基因的表达。IKK1/α主要与IKK2/β和NEMO形成三元复合物而存在。然而，也观察到少量IKK1/α以低分子量复合物的形式存在。目前尚不清楚p100的加工活性是由较大复合物还是较小复合物中的IKK1/α激活所触发的。IKK1/α的组成性活性已在多种癌症和炎症性疾病中被检测到。为了阐明IKK1/α的激活机制，并推动其作为药物靶点的应用，我们在不同表达系统（如大肠杆菌（E. coli）、昆虫细胞和哺乳动物细胞）中表达了重组IKK1/α蛋白。我们成功在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达了可溶性IKK1/α，获得了毫克级高纯度蛋白，利用抑制剂存在条件下进行结晶，并解析了其X射线晶体结构。本文中，我们详细描述了重组蛋白的制备、结晶及其X射线晶体结构解析的具体步骤。

引言

NF-κB 家族二聚体转录因子的转录活性在多种细胞功能中发挥重要作用，包括炎症与免疫反应以及细胞存活与死亡。这些活性在细胞内受到严格调控，调控失常会导致多种病理状态，如自身免疫性疾病和癌症1,2,3。在无刺激信号时，NF-κB 的活性被 IκB（κB 抑制蛋白）家族蛋白所抑制4。IκB 蛋白上特定丝氨酸（Ser）残基的磷酸化会标记其发生泛素化修饰，进而导致蛋白酶体降解或选择性加工5。两种高度同源的丝氨酸/苏氨酸激酶 IKK2/β 和 IKK1/α 通过介导上述磷酸化事件，成为 NF-κB 活性的核心调控因子6,7。

配体与受体之间的相互作用通过一系列中介分子传递信号，最终导致NF-κB因子的激活。NF-κB信号通路 broadly 可分为两条不同的途径——经典途径和非经典（替代）途径。8IKK2/β 的活性主要调控经典通路中的 NF-κB 信号转导，该通路对炎症和先天免疫反应至关重要。9该通路的一个显著特征是IKK2/β的快速且短暂的激活10 在一个迄今为止生化性质尚未明确的IKK复合物内——该复合物推测由IKK1和IKK2以及一个调节组分NEMO（NF-κB必需调节因子）组成11,12,13在IKK复合物的两个催化性IKK亚基中，IKK2主要负责14 对于典型IκB蛋白（α、-β）特定残基的磷酸化 & -γ) 与 NF-κB 结合，以及一种非典型的 IκB 蛋白 NF-κB1/p105，后者是 NF-κB p50 亚基的前体蛋白5磷酸化诱导的IκB泛素化及蛋白酶体降解（或p105的加工）导致特定NF-κB二聚体的释放与活化15由于IKK2功能失调导致NF-κB异常活化，已在多种癌症及自身免疫性疾病中被观察到。2,3,16.

与IKK2/β不同，IKK1/α的活性调控非经典NF-κB信号通路，该通路对发育和免疫至关重要。IKK1在其C端IκBδ区段上磷酸化NF-κB2/p100的特定残基，从而促使其加工并生成p52。转录活性p52:RelB异源二聚体的形成启动了对发育信号的缓慢而持续的响应7,17,18,19,20。有趣的是，该通路中核心NF-κB因子p52的生成高度依赖于另一个因子——NF-κB诱导激酶（NIK）21,22，而不依赖于IKK2或NEMO。在静息细胞中，NIK的水平保持较低，因其持续经历蛋白酶体依赖性降解23,24,25。当细胞受到“非经典”配体刺激或在某些恶性细胞中，NIK趋于稳定，进而招募并激活IKK1/α。NIK和IKK1的激酶活性对于p100高效加工为p52均至关重要7。IKK1和NIK在其C端IκBδ区段上磷酸化NF-κB2/p100的三个丝氨酸残基（Ser866、870和872），从而促使其加工并生成p52。非经典通路的异常激活已被发现与多种恶性肿瘤相关，包括多发性骨髓瘤26,27,28。

目前已知多种针对IKK2/β的高效且特异性抑制剂，但迄今为止尚无一种成为有效的药物。相比之下，IKK1/α的特异性抑制剂则极为稀少。这可能部分源于我们对IKK1/α的结构和生化信息了解不足，从而限制了对IKK1在细胞中激活NF-κB的分子机制的理解，以及合理药物设计的开展。IKK2/β的X射线晶体结构为我们揭示了其激活机制29；然而，这些结构未能阐明不同的上游刺激如何触发IKK1/α或IKK2/β的活化，以调控不同类型的NF-κB活性30,31。为了理解IKK1/α独特信号功能的分子机制，并建立合理药物设计的平台，我们致力于解析IKK1/α的结构。

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方案

1. 准备适用于IKK1/α大规模表达的重组病毒

  1. P1 病毒制备32
    1. 第1天：将 Sf9 细胞（约 6 × 105）（传代次数少于10）以每孔2 mL Sf900 III 昆虫细胞培养基接种于6孔板中，于27 °C 培养。当悬浮细胞密度达到每毫升 2 至 3 × 106 个时进行传代，按约 6 × 105 的密度稀释至新鲜培养基中。
    2. 第2天：将 8 µL Sf9 转染试剂稀释于 100 µL 不含抗生素和血清的 Sf900 III 或 Grace's 昆虫培养基中，短暂涡旋混匀。
    3. 另取一管，将 1 µg 试剂盒纯化的重组杆状病毒质粒（详情见“代表性结果”）32 稀释于另外 100 µL 相同培养基中。
    4. 将稀释后的 DNA 与转染试剂混合（总体积约 210–220 µL），室温孵育 15–30 分钟。
    5. 吸除孔中培养基，加入 1 mL 不含抗生素和血清的新鲜培养基。
    6. 将稀释后的 DNA-转染试剂混合液逐滴加入细胞中。调节液滴大小，避免冲落贴壁细胞。
    7. 约 6 小时后，直接加入 1.5 mL 新鲜培养基，或吸除原有培养基后加入 2.5 mL 新鲜培养基。添加前将新鲜培养基预热至 25–27 °C。
    8. 于 27 °C 培养细胞，每隔约 12 小时定期观察各孔，检查病毒感染迹象。所有 Sf9 细胞的维持与表达操作均在 27 °C 进行。
    9. 第5天：在感染后 60–72 小时收集含细胞的培养基，于 4 °C 以 500 × g 离心 5 分钟。保留上清液，即为 P1 病毒原液。将小份样品分装后于 -80 °C 冻存。
  2. 筛选表达效果最佳的 P1 病毒克隆。
    1. 按步骤 1.1 所述方法接种细胞。
    2. 次日或接种后约 6 小时，向不同孔中的细胞分别加入 20 µL 和 50 µL 不同的 P1 病毒克隆原液。
    3. 通过轻柔吹打使贴壁细胞脱落，于感染后 60–72 小时收集感染细胞，于 4 °C 以 500 × g 离心 5 分钟。保留上清液，即为 P2 病毒原液。将小份样品分装后于 -80 °C 保存。
    4. 向收集的细胞沉淀中加入 100 µL 2× Laemmli SDS 缓冲液，在 >95 °C 加热 10 分钟。离心（通常 > 10,000 × g）5 分钟。
    5. 取每种样品 10–15 µL，在 8–10% SDS-PAGE 凝胶上以 120–160 V 电泳，至染料前沿迁移至凝胶底部。
    6. 采用标准半干转膜法（20 V，30–45 分钟）将分离的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜或 PVDF 膜上。
    7. 使用抗 IKK1 抗体（稀释比例约 1:2,000，需优化）或抗 PentaHis 抗体（稀释比例约 1:3,000，需优化）进行免疫印迹检测表达情况。
    8. 通过比较重组 IKK1 的表达水平，选择表达效果最佳的 P1 病毒克隆。
  3. 大规模制备 P3 病毒原液。
    1. 按步骤 1.1 所述方法，在含 25–30 mL Sf900 III 培养基的 15 cm 培养皿中接种细胞。
    2. 接种后约 6 小时，向细胞中加入 150–300 µL 表达效果最佳的 P1 病毒原液。
    3. 感染 72 小时后，小心将培养基从培养皿中吸出至合适试管（无菌），于 4 °C 以 500–1000 × g 离心 10 分钟。弃去细胞沉淀（如有形成），保留上清液，即为 P3 病毒原液。
  4. 确定大规模蛋白表达的最佳病毒感染滴度
    1. 按 1.1 所述方法，在 6 孔板中每孔加入 2 mL Sf900 III 培养基接种细胞。
    2. 接种后约 6 小时，分别向不同孔中加入 20、30、40 和 50 µL 的 P3 病毒原液。设未感染的对照组。
    3. 感染后 48–60 小时收集各孔细胞。
    4. 每样品加入 100 µL 2× Laemmli SDS 缓冲液，在 >95 °C 加热 10 分钟。离心（通常在 14,000 × g）5 分钟。
    5. 取每种样品 10–15 µL，在 8–10% SDS-PAGE 凝胶中电泳分离。
    6. 按步骤 1.2.6 所述方法，将分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜或 PVDF 膜上。
    7. 使用抗 IKK1 抗体（稀释比例约 1:2000，需优化）或抗 PentaHis 抗体（稀释比例约 1:3000，需优化）进行免疫印迹检测。
    8. 选择表达水平最佳的病毒感染滴度用于大规模蛋白表达。

2. 大规模表达6x-His标签的人源IKK129,33

  1. 在悬浮培养物中进行大规模表达。将细胞分装至1 L Sf900 III培养基中，置于带通气盖的2 L锥形瓶中。细胞密度应约为5×105 个细胞/mL。
  2. 在27 °C、约100 rpm条件下于摇床中悬浮培养细胞约2天，直至细胞密度达到1–2×106/mL。细胞密度不得超过2×106/mL。
  3. 根据1.4节评估结果，加入所需量的P3病毒。
  4. 将感染后的培养物在27 °C、约100 rpm条件下于摇床中继续培养48–60小时。
  5. 在4 °C条件下，以<1,500 × g离心收集细胞。
  6. 保留细胞沉淀，弃去培养基。
  7. 立即进行蛋白纯化。如需后续使用，可将细胞沉淀在液氮中速冻后于-80 °C保存。

3. His-IKK1的纯化33

  1. 第1天，将细胞沉淀重悬于40 mL裂解缓冲液（25 mM Tris pH 8.0，0.2% NP-40，200 mM NaCl，10 mM 咪唑，10% 甘油，5 mM β-巯基乙醇和蛋白酶抑制剂混合物）中。
    注意：未测定湿细胞沉淀的质量。通常，此步骤使用约 2 L 培养物。
  2. 通过超声处理裂解细胞，设置工作周期为60-70%，每次持续30秒，重复5-10次，每次间隔一定时间 >1 分钟，期间将细胞悬液置于冰上保持低温。
    注意：此步骤需根据每种型号的超声波破碎仪进行优化。样品温度不得超过 10 °C。
  3. 在 4 °C 条件下以 ≥ 28,000 x g 离心 45 分钟，澄清裂解液。
  4. 用裂解缓冲液平衡4 mL Ni-NTA琼脂糖树脂，然后按照制造商说明书将澄清裂解液（上清液）与树脂混合。
  5. 在4 °C条件下，将蛋白在旋转混合仪上孵育2小时，使其与树脂结合。
  6. 用含有 30 mM 咪唑的裂解缓冲液彻底洗涤树脂。定期使用 Bradford 法测定洗涤组分中的蛋白浓度。持续洗涤直至洗涤组分中的蛋白浓度降至 0.1 mg/mL。通常情况下 > 需要20个柱床体积的洗涤缓冲液才能达到此点。
  7. 使用洗脱缓冲液（含250 mM咪唑的裂解缓冲液）20 mL，依靠重力流洗脱His标签的IKK1/α蛋白。收集每管1–1.5 mL的洗脱组分。
  8. 通过将所有组分的5-10 μL样品与Laemmli缓冲液混合后，上样至8%或10% SDS-PAGE凝胶，检测洗脱蛋白的纯度。
  9. 合并峰图组分（浓度 ≥ 2 mg/mL），并使用Bradford法测定蛋白浓度。
  10. 在 4 °C 下用 TEV 蛋白酶（TEV 蛋白酶：IKK1 比例为 1:30–50）消化过夜（≥12 小时）。
    注意：优化裂解6X-His标签所需的TEV蛋白酶用量，以实现完全（≥ 95%）消化 先验的TEV 蛋白酶为实验室自制纯化。
  11. 第2天早晨，在20 mM MgCl存在下，用1 mM ATP孵育蛋白质2，20 mM β-甘油磷酸钠，10 mM 氟化钠，以及 1 mM 正钒酸钠，于 27 °C 下孵育 1 小时。
  12. 将蛋白溶液通过 0.45 或 0.22 μm 滤膜过滤。
  13. 将6 mL样品加载至连接自动液相色谱系统的约120 mL制备级凝胶过滤层析柱上。上样前，用缓冲液A（20 mM Tris-HCl (pH 7.5)，150 mM NaCl，5 mM DTT，5%甘油）平衡层析柱。
    注意：根据Ni-NTA亲和纯化步骤后蛋白质的得率，可使用较小的层析柱。上样体积应调整/计算为柱体积的5%。
  14. 以1 mL/min的流速进行凝胶过滤层析，于280 nm和254 nm处监测洗脱情况，收集每管2 mL的组分。
  15. 在8-10%的SDS-PAGE凝胶上检测洗脱峰组分（通常约为60-70 mL）的纯度。
  16. 合并纯度≥95%且浓度≥0.5 mg/mL的纯化组分，按照制造商说明，使用截分子量为10 kDa或30 kDa的离心式蛋白浓缩器进行浓缩。
  17. 定期采用 Bradford 法检测浓缩液的蛋白浓度，并将样品浓缩至 8–12 mg/mL。
  18. 分装25 μL等份，液氮速冻。将速冻样品保存于-80 °C冰箱中。

4. 筛选IKK1的结晶条件

  1. 根据下述方法计算用于晶体筛选所需的蛋白质总体积。
  2. 尝试不同的抑制剂（通用激酶抑制剂：AMPPNP 和 Staurosporine；IKK 特异性抑制剂：MLN120B、Compound A 和 IKK-inhibitor XII）进行结晶筛选。按照制造商说明配制这些化合物的储备液，确保其储备液中的化合物最高浓度不超过 20 μM。
  3. 通过将 100 μM 的 IKK1 与 200 μM 抑制剂混合，制备 IKK:抑制剂复合物用于结晶筛选，并在 18–20 °C 下孵育 30–40 分钟。在室温下以 >15,000 ×g 离心 2 分钟，收集上清液用于结晶筛选。
  4. 使用市售的结晶筛选试剂盒（参见材料表）。
  5. 使用多通道移液器或机器人，将每种结晶试剂（储液）80–100 μL 加入 96 孔板的储液池中。此时板已准备好用于设置液滴。确保每块板可容纳 2 至 3 个结晶液滴，以便在同一块板上同时筛选 2 至 3 种抑制剂。
  6. 使用结晶机器人，将 0.2–0.25 μL 的 IKK1:抑制剂复合物与等体积的储液分别分配并混合。
    注：也可手动进行筛选，使用较大的液滴体积（0.5–1.0 μL 的 IKK1:抑制剂复合物与等体积的储液）。但使用机器人有助于节省宝贵的试剂。
  7. 设置液滴后立即使用光学透明封膜密封板，防止蒸发。使用合适的压膜器正确密封。为每组抑制剂制备复制板，一块置于 18 °C 培养，另一块置于冷室（温度范围约 4–6 °C）。确保培养环境无振动干扰。
  8. 在前七天每天使用带偏光镜的体视显微镜检查每个液滴中晶体的出现情况，之后可延长观察间隔。系统记录并评分这些观察结果。
    注：使用带偏光镜的体视显微镜可直观评估晶体的生长缺陷。在此实验中，晶体出现在储液含有 3% w/v 硫酸葡聚糖钠盐（分子量 Mr 5,000）、0.1 M BICINE（pH 8.5）和 15% w/v 聚乙二醇 20,000 的条件下。IKK1 的晶体仅在存在 IKK-inhibitor XII 时形成。

5. 晶体生长优化29,33

  1. 储备溶液的配制。
    1. 在去离子 H2O 中配制不同分子量（平均分子量分别为 5,000、8,000、15,000、40,000 Da）的硫酸葡聚糖 30% w/v 溶液。使用 0.22 μm 滤器过滤溶液。
    2. 配制 pH 范围为 6.5 至 9 的不同缓冲液的 1 M 或 0.5 M 储备液。使用 0.22 μm 滤器过滤溶液。
    3. 配制不同分子量（平均分子量：1000、1,500、3,350、4,000、6,000、8,000、10,000、12,000、20,000 Da）的 25% 或 50% (w/v) 聚乙二醇（PEG）溶液。使用 0.22 μm 滤器过滤溶液。
    4. 通过系统性地改变 pH、缓冲液类型、浓度以及 PEG 和硫酸葡聚糖的类型进行网格筛选。
  2. 在 18 °C 和低温室（温度范围约 4–6 °C）下分别优化筛选条件。
  3. 将等量的 IKK1:抑制剂复合物与孔内溶液混合，并在密封环境中置于孔内溶液上方孵育。此步骤可手动操作或使用分配机器人完成。
    注：在此条件下获得了最大且形态良好的晶体（通过偏振光下颜色均匀判断其生长均一）：100 mM BisTris，pH 7.0，2.8–3.5% 硫酸葡聚糖（平均分子量 15 kDa），8.5–10% PEG 20 kDa，在低温室中。

6. 大量培养晶体

  1. 配制以下贮存液，并通过 0.22 μm 滤膜过滤。
    1. 配制 0.5 M BisTris（pH 7.0）以及 BisTris 丙烷（pH 7.0 和 7.5）。
    2. 配制 30%（w/v）硫酸葡聚糖（平均分子量 ~15 kDa）。4 °C 保存。
    3. 配制 50% PEG（平均分子量 ~12 kDa）。
  2. 使用 24 孔悬滴培养板。
  3. 在每孔的凸起环上涂抹密封脂。
  4. 按下述成分配制孔内溶液（终浓度）：100 mM BisTris（pH 7.0–7.5）、2.8–3.5% 硫酸葡聚糖 ~15 kDa、8.5–10% PEG ~12 kDa。在 1.5 mL 离心管中配制 1 mL 孔内溶液。
    注意：由于蛋白批次和/或硫酸葡聚糖批次的不同，结晶条件可能出现微小差异，因此建议对较窄范围进行预试验。相同 pH 范围的 BisTris 和 BisTris 丙烷缓冲液均可获得单晶。
  5. 将孔内溶液和涂好密封脂的培养板置于冷室中至少 1 小时。
  6. 按 4.3 节所述方法制备 IKK1:抑制剂复合物。将 1.5 mL 离心管中的孔内溶液转移至 24 孔板的各个孔中。
  7. 使用无尘擦拭纸清洁硅化（商品化或自制（硅化/硅烷化））玻璃盖玻片，并使用市售气雾除尘器施加高压定点气流进行吹干。
  8. 取 1–1.5 μL 孔内溶液置于洁净盖玻片上。加入等体积的 IKK1:抑制剂复合物，通过上下吹打 3–4 次轻轻混匀。用镊子将盖玻片翻转后放置于对应的孔上，并通过按压密封脂完成密封。
  9. 设置完 24 孔板的所有液滴后，将培养板置于冷室中避光孵育。定期在显微镜下观察液滴中晶体的出现与生长情况。
    注意：尚未测试光照条件下孵育结晶板是否会影响结果。但关键的是，培养板必须置于最小或无振动的环境中进行孵育。

7. 晶体的冷冻保护

  1. 冷冻溶液的制备
    1. 配制 Cryo A 溶液（约 2% 硫酸葡聚糖，约 10% PEG 12000，60 mM BisTris 丙烷（pH 与目标井溶液相同），5 mM Tris（pH 7.5），40–50 mM NaCl，2.5% 甘油）。
    2. 配制 Cryo B 溶液（约 0.3% 硫酸葡聚糖，约 10% PEG 12000，60 mM BisTris 丙烷（pH 与目标井溶液相同），5 mM Tris（pH 7.5），40–50 mM NaCl，20% 或 25% 甘油，或 20% 或 25% 乙二醇）。
      注意：除甘油和乙二醇外，测试其他不同的抗冻剂例如，聚乙二醇 200，聚乙二醇 400，聚乙二醇单甲醚 550，聚乙二醇 1000。
  2. 轻轻取下带有晶体的玻璃盖玻片，将其放置在固体表面上，使含有晶体的液滴朝上。在液滴上方轻轻加入10 μL Cryo A溶液，用移液器轻轻吹打混合，注意不要触碰晶体。
    注意：此步骤可清除晶体表面的碎屑，并帮助晶体与初始冷冻缓冲液达到平衡。避免对晶体施加机械或热应力。后续所有操作均需在显微镜下进行，以防止晶体受损。
  3. 缓慢移除晶体周围的液体，保留约5-8 μL溶液。避免晶体脱水。在后续所有步骤中，需格外小心，防止晶体受到机械应力和脱水。
  4. 轻轻将2.5–4 μL Cryo B溶液加至液滴上，用移液器非常轻柔地混匀。用一个小培养皿覆盖，以避免气流直接吹拂晶体。静置5分钟。务必始终注意避免晶体遭受渗透压的快速变化或脱水。
  5. 重复步骤7.4四次，使晶体缓慢适应冷冻溶液。
  6. 此步骤保留10–20 μL冷冻溶液即，使晶体浸入含有约20–25%冷冻保护剂的溶液中。在最终的冷冻溶液中浸泡不同时间（5分钟至1小时）。
  7. 在不同时间点冷冻多个晶体。
  8. 小心地从液滴中挑选单晶，置于安装在合适基座上的冷冻环中，并在液氮中迅速冷冻2此步骤需平稳快速地进行，以避免晶体上形成冰晶。
    注意：使用环状挑取工具时，应选择直径略大于晶体最长轴的环，以便将其安装在阿贡国家实验室先进光子源使用的机器人测角仪上。
  9. 将含有晶体的冷冻环存放在浸没于液氮中的样品托内2. 将这些样品盘保存在液氮中2 将样品保存于杜瓦瓶中，直至准备运往同步辐射光源进行X射线衍射实验。随后进行X射线衍射数据的收集与处理（第8和第9节）。
    注意：IKK1 晶体在实验室 X 射线源上获得的衍射数据分辨率不足以进行结构解析尝试，但可用于评估在同步辐射光源中需筛选的晶体质量。所有衍射数据均在美国阿贡国家实验室先进光子源的不同光束线（主要为 19ID）上收集。

8. X射线数据收集

  1. 使用远程数据采集软件，在 APS 同步辐射源的 ID19 光束线上收集 X 射线衍射数据34。
    注意：测试了 100 多个晶体的衍射特性。晶体通常可衍射至 7–11 Å 的分辨率，仅偶尔观察到衍射超过 5 Å 的晶体，且仅有一个大晶体衍射超过 4.5 Å。由于晶体在数据采集过程中迅速衰减，因此在同一晶体的不同区域收集了多组数据。由于晶体尺寸较大（大于 400 µm），且所用光束直径为 100 µm，因此该操作可行。

9. X射线数据处理

  1. 合并在同一晶体不同部分收集的所有数据集34。
    注意：从最佳晶体中合并了七个数据集，合并后的数据完整度为93%。整体I/σ约为6.8，最高分辨率区间（5.4-4.5 Å）的Rmerge为89%。
  2. 使用HKL200034处理数据集，以确定空间群、晶胞参数、溶剂含量以及非对称单元的合理组成。

10. 结构解析

  1. 搜索模型的制备
    1. 基于已有的hIKK2结构模型（pdb编号4E3C和4KIK35），生成一系列具有不同N端激酶结构域（KD）取向的二聚体（使二聚体中两个KD的P578残基之间的距离分别为30 Å和62 Å）。经过多次尝试，这些模型均未获得分子置换的可行解。
    2. 利用单颗粒冷冻电镜数据生成IKK1的电子密度图33。
    3. 基于IKK2的最高分辨率结构（pdb编号4KIK），构建人源IKK1的结构模型。
    4. 使用COOT36将人源IKK1模型的各个结构域拟合到人源IKK1的冷冻电镜密度图中。该操作使KD的取向旋转约24度，并将N端开口调整至约58 Å。
    5. 将上述冷冻电镜拟合模型（单体）中的KD取向应用于10.1.1中生成的所有二聚体模型。
  2. 分子置换
    1. 将10.1.1和10.1.5中生成的二聚体作为搜索模型，用于PHASER37、MOLREP38和CNS39,40程序中的分子置换。
      注：此处使用10.1.5中的一个二聚体模型（52 Å开口）作为搜索模型，通过MOLREP在非对称单元中定位出六个二聚体（形成两个六聚体）。搜索模型中的52 Å开口与最终精修结构中所有六个二聚体的开口（49–50 Å）相近。

11. 结构精修

  1. 结构优化流程
    1. 通过CNS（cns_solve_1.3）中的刚体精修固定该初始模型的取向和位置39,40.
    2. 使用CNS系统，通过最小化和模拟退火方法，以最大似然目标函数和均一的体相溶剂校正进一步优化结构。39,40.
    3. 根据2F构建模型O- FC 使用 Xtalview 进行 Fo-Fc 图谱分析41.
      注意：应用 DEN 辅助精修42 NCS 约束在精修过程中被用于提高模型的准确性。事实上，采用 DEN 精修方法显著改善了结构的几何参数和 R 因子，最终模型的 R 因子为 22.2%，自由 R 因子为 27.8%。自由 R 因子的显著改善应归因于基于 IKK2 模型（4KIK）生成的高精度 IKK1 结构域模型。

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结果

IKK1/α 不同构建体的克隆与表达
将全长人源 IKK1/α 克隆至杆状病毒表达载体 pFastBacHTa 的 EcoRI 和 NotI 限制性酶切位点之间，以获得带有 N 端六聚组氨酸标签的 IKK1。该标签可通过 TEV 蛋白酶消化去除。由于全长 IKK1/α 在两端均含有柔性区域，而柔性区域通常会使蛋白质难以结晶，因此我们将多种截短形式的 IKK1/α 片段克隆至上述 pFastBacHTa 载体的相同位点。构建了多种 IKK1/α 截短突变体，其背景分别为野生型（wt）和 S176E,180E（EE）。IKK1/α EE 代表模拟持续活化状态的磷酸化激酶形式。重组杆状病毒的制备及蛋白表达按照先前发表的方案稍作修改进行43（图 1）。

IKK1/α 结晶的困难<...

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讨论

两种相关IKK蛋白的表达、结晶及结构解析
我们着手解析IKK1/α的X射线晶体结构，原以为凭借我们在IKK2/β蛋白表达、结晶及结构测定方面的经验，这将是一项相对直接的工作。然而，我们非常惊讶地发现，这两种相关的蛋白在结晶难易程度上表现出显著差异。尽管多个高水平实验室付出了努力，IKK1结构的解析仍耗时近二十年。这在很大程度上源于几个关键的技术瓶颈。

第一个难点是获得高纯度且可溶的蛋白形式。昆虫细胞表达系统使我们能够获得毫克量级的高纯度蛋白，且其溶解性相对良好。就表达水平而言，所有IKK1/α构建体在昆虫细胞表达系统中的表达水平均显著低于IKK2/β构建体。需要注意的是，这两种蛋白在表达时均不具可溶性和功能活性，当在 E. coli在昆虫细胞表达系统中，IKK2/β片段的表达量较高，根据不同构建体，产量在每升培养物10至30 mg之间。相比之下，IKK1/α构建体的表达量仅为每升培养物0.5至2.0 mg。目前我们尚不清楚造成这种差异的原因。我们也应尝试在天然宿主细胞中表达IKK1即，尤其是在哺乳动物...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

致谢

我们感谢伊利诺伊州莱蒙特先进光子源（Advanced Photon Source）19ID、24ID 和 13ID 光束线的工作人员在多种晶体数据收集过程中提供的支持。我们感谢萨尔克研究所（Salk Institute）的 Dmitry Lyumkis 在电镜图谱/模型构建的早期阶段为我们提供了低分辨率的冷冻电镜图谱，该图谱被用于构建初始的 IKK1 分子置换搜索模型。本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金 AI064326、CA141722 和 GM071862 对 GG 的资助。SP 目前为惠康信托基金会（Wellcome Trust）与印度生物技术部（DBT）印度中级研究员。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Cellfectin/Cellfectin IIThermo Fisher Scientific10362100Cellfectin 已停止生产，由 Cellfectin II 取代
Sf900 III 昆虫细胞培养基Thermo Fisher Scientific12658-027
SF9 细胞Thermo Fisher Scientific12659017
anti-IKK1 抗体Novus BiologicalsNB100-56704此前由 Imgenex 销售
anti-PentaHis 抗体Qiagen34460
PVDF 膜MilliporeIPVH00010也可使用硝酸纤维素膜
Ni-NTA 琼脂糖Qiagen30210
Bradford 法蛋白检测试剂BioRad500001
Superdex 200 层析柱GE Healthcare28989335
Amicon 浓缩管MilliporeUFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
化合物 ABayer
Calbiochem IKK 抑制剂 XIICalbiochem401491
星形孢菌素（Staurosporine）SIGMAS4400
MLN120BMillenium赠品
AMPPNPSIGMAA2647
硫酸葡聚糖SIGMA51227, 42867, 31404,
硫酸葡聚糖Alfa AesarJ62101
PEGSIGMA93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172其中部分为 SIGMA 目录中的新货号。我们原先使用的是 Fluka 生产的产品，其货号不同。
结晶筛选试剂盒
Crystal Screen I 和 II（Crystal Screen HT）Hampton ResearchHR2-130
Index HTHampton ResearchHR2-134
PEG/Ion 和 PEG/Ion2（PEG/Ion HT）Hampton ResearchHR2-139
PEGRX 1 和 PEGRx 2（PEGRx HT）Hampton ResearchHR2-086
SaltRx 1 和 SaltRx 2（SaltRx HT）Hampton ResearchHR2-136
晶体载网Hampton ResearchHR8-188, 190, 192, 194
同步辐射光源美国能源部’s 阿贡国家实验室先进光子源（APS）19 ID 光束线美国能源部’s 阿贡国家实验室的先进光子源（APS）提供超亮、高能量的储存环产生的 X 射线束，用于几乎所有科学领域的研究。

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