人源IKK1/α的制备、结晶及结构测定指南

摘要

IκB 激酶 1/α（IKK1/α CHUK）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要通过激活 NF-κB 转录因子参与多种细胞活动。本文描述了该蛋白的制备及其晶体结构测定所需的主要步骤。

摘要

一类细胞外刺激需要激活IKK1/α，以通过其前体p100的加工诱导生成NF-κB亚基p52。p52可作为同源二聚体或与另一NF-κB亚基RelB形成异源二聚体发挥作用。这些二聚体进而调控数百个与炎症、细胞存活及细胞周期相关基因的表达。IKK1/α主要与IKK2/β和NEMO形成三元复合物而存在。然而，也观察到少量IKK1/α以低分子量复合物的形式存在。目前尚不清楚p100的加工活性是由较大复合物还是较小复合物中的IKK1/α激活所触发的。IKK1/α的组成性活性已在多种癌症和炎症性疾病中被检测到。为了阐明IKK1/α的激活机制，并推动其作为药物靶点的应用，我们在不同表达系统（如大肠杆菌（E. coli）、昆虫细胞和哺乳动物细胞）中表达了重组IKK1/α蛋白。我们成功在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达了可溶性IKK1/α，获得了毫克级高纯度蛋白，利用抑制剂存在条件下进行结晶，并解析了其X射线晶体结构。本文中，我们详细描述了重组蛋白的制备、结晶及其X射线晶体结构解析的具体步骤。

引言

NF-κB 家族二聚体转录因子的转录活性在多种细胞功能中发挥重要作用，包括炎症与免疫反应以及细胞存活与死亡。这些活性在细胞内受到严格调控，调控失常会导致多种病理状态，如自身免疫性疾病和癌症^1,2,3。在无刺激信号时，NF-κB 的活性被 IκB（κB 抑制蛋白）家族蛋白所抑制⁴。IκB 蛋白上特定丝氨酸（Ser）残基的磷酸化会标记其发生泛素化修饰，进而导致蛋白酶体降解或选择性加工⁵。两种高度同源的丝氨酸/苏氨酸激酶 IKK2/β 和 IKK1/α 通过介导上述磷酸化事件，成为 NF-κB 活性的核心调控因子^6,7。

配体与受体之间的相互作用通过一系列中介分子传递信号，最终导致NF-κB因子的激活。NF-κB信号通路 broadly 可分为两条不同的途径——经典途径和非经典（替代）途径。⁸IKK2/β 的活性主要调控经典通路中的 NF-κB 信号转导，该通路对炎症和先天免疫反应至关重要。⁹....

方案

1. 准备适用于IKK1/α大规模表达的重组病毒

1. P1 病毒制备³²
   1. 第1天：将 Sf9 细胞（约 6 × 10⁵）（传代次数少于10）以每孔2 mL Sf900 III 昆虫细胞培养基接种于6孔板中，于27 °C 培养。当悬浮细胞密度达到每毫升 2 至 3 × 10⁶ 个时进行传代，按约 6 × 10⁵ 的密度稀释至新鲜培养基中。
   2. 第2天：将 8 µL Sf9 转染试剂稀释于 100 µL 不含抗生素和血清的 Sf900 III 或 Grace's 昆虫培养基中，短暂涡旋混匀。
   3. 另取一管，将 1 µg 试剂盒纯化的重组杆状病毒质粒（详情见“代表性结果”）³² 稀释于另外 100 µL 相同培养基中。
   4. 将稀释后的 DNA 与转染试剂混合（总体积约 210–220 µL），室温孵育 15–30 分钟。
   5. 吸除孔中培养基，加入 1 mL 不含抗生素和血清的新鲜培养基。
   6. 将稀释后的 DNA-转染试剂混合液逐滴加入细胞中。调节液滴大小，避免冲落贴壁细胞。
   7. 约 6 小时后，直接加入 1.5 mL 新鲜培养基，或吸除原有培养基后加入 2.5 mL 新鲜培养基。添加前将新鲜培养....

结果

IKK1/α 不同构建体的克隆与表达
将全长人源 IKK1/α 克隆至杆状病毒表达载体 pFastBacHTa 的 EcoRI 和 NotI 限制性酶切位点之间，以获得带有 N 端六聚组氨酸标签的 IKK1。该标签可通过 TEV 蛋白酶消化去除。由于全长 IKK1/α 在两端均含有柔性区域，而柔性区域通常会使蛋白质难以结晶，因此我们将多种截短形式的 IKK1/α 片段克隆至上述 pFastBacHTa 载体的相同位点。构建了多种 IKK1/α 截短突变体，其背景分别为野生型（wt）和 S176E,180E（EE）。IKK1/α EE 代表模拟持续活化状态的磷酸化激酶形式。重组杆状病毒的制备及蛋白表达按照先前发表的方案稍作修改进行⁴³（图 1）。

IKK1/α 结晶的困难<.......

讨论

两种相关IKK蛋白的表达、结晶及结构解析
我们着手解析IKK1/α的X射线晶体结构，原以为凭借我们在IKK2/β蛋白表达、结晶及结构测定方面的经验，这将是一项相对直接的工作。然而，我们非常惊讶地发现，这两种相关的蛋白在结晶难易程度上表现出显著差异。尽管多个高水平实验室付出了努力，IKK1结构的解析仍耗时近二十年。这在很大程度上源于几个关键的技术瓶颈。

第一个难点是获得高纯度且可溶的蛋白形式。昆虫细胞表达系统使我们能够获得毫克量级的高纯度蛋白，且其溶解性相对良好。就表达水平而言，所有IKK1/α构建体在昆虫细胞表达系统中的表达水平均显著低于IKK2/β构建体。需要注意的是，这两种蛋白在表达时均不具可溶性和功能活性，当在 E. coli在昆虫细胞表达系统中，IKK2/β片段的表达量较高，根据不同构建体，产量在每升培养物10至30 mg之间。相比之下，IKK1/α构建体的表达量仅为每升培养物0.5至2.0 mg。目前我们尚不清楚造成这种差异的原因。我们也应尝试在天然宿主细胞中表达IKK1即，尤其是在哺乳动物.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Cellfectin/Cellfectin II	Thermo Fisher Scientific	10362100	Cellfectin 已停止生产，由 Cellfectin II 取代
Sf900 III 昆虫细胞培养基	Thermo Fisher Scientific	12658-027
SF9 细胞	Thermo Fisher Scientific	12659017
anti-IKK1 抗体	Novus Biologicals	NB100-56704	此前由 Imgenex 销售
anti-PentaHis 抗体	Qiagen	34460
PVDF 膜	Millipore	IPVH00010	也可使用硝酸纤维素膜
Ni-NTA 琼脂糖	Qiagen	30210
Bradford 法蛋白检测试剂	BioRad	500001
Superdex 200 层析柱	GE Healthcare	28989335
Amicon 浓缩管	Millipore	UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
化合物 A	Bayer
Calbiochem IKK 抑制剂 XII	Calbiochem	401491
星形孢菌素（Staurosporine）	SIGMA	S4400
MLN120B	Millenium	赠品
AMPPNP	SIGMA	A2647
硫酸葡聚糖	SIGMA	51227, 42867, 31404,
硫酸葡聚糖	Alfa Aesar	J62101
PEG	SIGMA	93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172	其中部分为 SIGMA 目录中的新货号。我们原先使用的是 Fluka 生产的产品，其货号不同。
结晶筛选试剂盒
Crystal Screen I 和 II（Crystal Screen HT）	Hampton Research	HR2-130
Index HT	Hampton Research	HR2-134
PEG/Ion 和 PEG/Ion2（PEG/Ion HT）	Hampton Research	HR2-139
PEGRX 1 和 PEGRx 2（PEGRx HT）	Hampton Research	HR2-086
SaltRx 1 和 SaltRx 2（SaltRx HT）	Hampton Research	HR2-136
晶体载网	Hampton Research	HR8-188, 190, 192, 194
同步辐射光源	美国能源部’s 阿贡国家实验室先进光子源（APS）	19 ID 光束线	美国能源部’s 阿贡国家实验室的先进光子源（APS）提供超亮、高能量的储存环产生的 X 射线束，用于几乎所有科学领域的研究。