方法文章

人的 ikkknα的生产、结晶和结构测定指南

DOI：

10.3791/56091

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2018年11月2日

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1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

本文内容

摘要

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b 激酶 1/α (ikkniα-chuk) 是一种 ser/thr 蛋白激酶, 主要通过激活 nf-b 转录因子参与无数的细胞活动。在这里, 我们描述了生产和晶体结构测定这种蛋白质所需的主要步骤。

摘要

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一类细胞外刺激需要激活 ikkenα, 以诱导 nf-b 亚基 (p52) 通过处理其前体 p52 来产生。p52 的功能是作为一个同相或异质体与另一个 nf-b 亚基, reb。这些二聚体反过来调节与炎症、细胞存活和细胞周期有关的数百种基因的表达。ikktuα主要与 ikk2/β和 nemo 作为三元复合体保持联系。然而, 它的一小部分也被观察为低分子量复合物。不知道 p100 处理活动是否由在较大或较小的复杂池中激活 ikkenα触发。在几种癌症和炎症性疾病中检测到了 ikk% α的组织活性。为了了解 ikknα的激活机制, 并使其作为药物靶标的使用, 我们在不同的宿主系统中表达了重组的 ikknα, 如大肠杆菌、昆虫和哺乳动物细胞。我们成功地在感染杆状病毒的昆虫细胞中表达了可溶性 ikk定α, 获得了毫克数量的高纯度蛋白质, 在抑制剂存在的情况下将其结晶, 并确定其 x 射线晶体结构。在这里, 我们描述了生产重组蛋白的详细步骤, 它的结晶, 以及它的 x 射线晶体结构的测定。

引言

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从炎症和免疫到生存和死亡, 不同的细胞功能都需要 nf-b 家族的转录活性。这些活动在细胞中得到严格控制, 失去调节导致各种病理条件, 包括自身免疫性疾病和癌症1、2、3.在没有刺激的情况下, n f-b 的活性被 b (-b) 蛋白4的抑制剂所抑制。在 b 蛋白上特定的尔斯残基的磷酸化标志着它们的泛化和随后的蛋白酶体降解或选择性处理5。两个高度同源的 ser/thr 激酶, ikk2/ββ和 ikkneα, 通过执行这些磷酸化事件6,7作为 nf-b 活动的中央调节器。

配体和受体之间的相互作用通过一系列介质传输信号, 从而激活 nf-b 因子。nf-b 信号过程大致可分为两种不同的途径--规范和非规范 (替代)8。ikk2/β的活性主要调节对炎症和先天免疫反应至关重要的规范途径的nf-b 信号9。这种途径的一个显著特点是 ik2/β10在一个迄今没有生化特征

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方案

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1. 适用于 ikkniα大规模表达的重组病毒的制备

  1. p1 病毒制备32
    1. 第1天: 6 井板的每口井中的板 sf9 细胞 (~ 6x105) (通道号小于 10) 在每口井中的6孔板和孵育。当通道细胞达到密度为2至 3 x 10 6 细胞时 , 每毫升悬浮在悬浮状态, 在密度约为 6 x 105 的情况下稀释到新鲜介质中。
    2. 第2天: 在没有抗生素和血清的情况下, 在100μl 的 Sf9 iii 或 grace 的昆虫培养基中稀释8μl 的 sf9 转染试剂。旋涡简要。
    3. 将1微克的位纯化重组杆菌 (详情见 "代表性结果")32稀释为同一介质的另 100μl, 在单独的管中。
    4. 将稀释后的 dna 和转染试剂 (总体积 ~ 210-220μl) 结合, 在室温下孵育15-30。
    5. 从井里取出介质。在不含抗生素和血清的情况下加入1毫升新鲜培养基。
    6. 将稀释后的 dna 转染试剂混合物滴入细胞。调整掉落大小, 使其不会使粘附细胞脱离。
    7. ~ 6小时后, 在顶部加入1.5 毫升新鲜培养基或去除培养基, 加入2.5 毫升新鲜培养基。加热新鲜介质至 25-27°c, 然后再添加。
      8. ....

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结果

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ikknenα不同结构的克隆与表达
全长人类 ikk% α被克隆到杆状病毒表达载体 pfastbhta 在其 ecri 和 noi 限制站点内, 以获得一个 n-端六-组氨酸标记 ikk1。该标签可通过 tev 蛋白酶消化去除。由于全长 ikk% α两端都含有灵活的区域, 而灵活的区域通常使蛋白质难以结晶, 因此我们在 pfastbachta 向量的上述站点中克隆了 ikk% α的各种截断片段。利用野生类型 (wt) 和 s176e180e (ee) 主干生成了 ikknα的各种截断突变体。ikk元αee 是指磷酸化激酶的本构活性形式的模拟。重组的杆菌病毒的产生和蛋白质表达是使用先前发布的协议进行的, 但略作修改43 (图 1)。

在 ikknα结晶的困难
由于人 i.......

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讨论

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两种相关 ikk 蛋白的生产、结晶及结构解
我们着手确定 ikk半α的 x 射线晶体结构, 并认为这将是一个相对简单的练习, 考虑到我们在 ikk2/ββ蛋白生产、结晶和结构测定方面的经验。然而, 我们感到非常惊讶的是, 这两种相关的蛋白质在结晶的易用性方面表现得非常不同。尽管几个知名实验室做出了努力, ikk1 结构的确定还是用了近20年的时间。这在很大程度上是由于几个关键瓶颈造成的。

第一个困难是获得高度纯净和可溶性的蛋白质形式。昆虫细胞表达系统使我们能够获得相当可溶性的大量纯蛋白质。在表达水平方面, 在昆虫细胞表达系统中, 所有的 ikk% α结构都在远低于 ikk2/β结构的水平上表达。需要注意的是, 在大肠杆菌中表达时, 两种蛋白质都不是可溶性和功能性的。在昆虫细胞表达系统中, ikk2/β片段在高浓度下表达, 根据结构的不同, 从培养的10到 30 mgl 不等。相反, ikk% α构造只能在培养的0.5 到 2.0 mgl 时生成。这种差异的原因我们仍然不知道。我们还应该尝试在原生宿主细胞中表达 ikk1 (<.......

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披露

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提交人声明没有相互竞争的经济利益或其他利益冲突。

致谢

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我们感谢位于高级光子源、lemont、il 的 beamlines 19id、24id 和13id 的工作人员在收集各种晶体的数据时提供的支持。我们感谢 salk 研究所 dmitry lyumkis 在 em 地图模型构建的早期阶段为我们获取了低分辨率的低温-em 图, 该模型被用来构建最初的 ikk1 分子替换搜索模型。导致这些结果的研究得到了国家卫生研究院向 gg 提供的 ai064326、ca141722 和 gm071862 赠款的资助。sp 目前是 wellcome 信托 dbt 印度中级研究员。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Cellfectin/Cellfectin IIThermo Fisher Scientific10362100Cellfectin 现已停产，取而代之的是 Cellfectin II
Sf900 III 昆虫细胞培养基Thermo Fisher Scientific12658-027
SF9 细胞Thermo Fisher Scientific12659017
抗 IKK1 抗体Novus BiologicalsNB100-56704以前由 Imgenex 销售
抗 PentaHis 抗体Qiagen34460
PVDF 膜MilliporeIPVH00010硝酸纤维素 也可用于
Ni-NTA 琼脂糖Qiagen30210
Bradford 测定试剂BioRad500001
Superdex 200 色谱柱GE Healthcare28989335
Amicon 浓缩器MilliporeUFC801008、 UFC803008、 UFC201024、 UFC203024
化合物 A拜耳
钙生菌化学 IKK 抑制剂 XII钙生菌化学401491
星形孢菌素SIGMAS4400
MLN120B千禧年礼品
项目 AMPPNPSIGMAA2647
硫酸葡聚糖SIGMA51227， 42867， 31404，
硫酸葡聚糖Alfa AesarJ62101
PEGSIGMA93593， 81210， 88276， 95904， 81255， 89510， 92897， 81285， 95172其中一些是 SIGMA 目录中的新猫 #。我们最初拥有的是来自 Fluka，它有不同的 Cat #。
结晶筛
晶体筛 I 和 II （Crystal Screen HT）Hampton ResearchHR2-130
Index HTHampton ResearchHR2-134
PEG/Ion 和 PEG/Ion2 （PEG/Ion HT）Hampton ResearchHR2-139
PEGRX 1 和 PEGRx 2 （PEGRx HT）Hampton ResearchHR2-086
SaltRx 1 和SaltRx 2 （SaltRx HT）Hampton ResearchHR2-136
晶体支架Hampton ResearchHR8-188、190、192、194
同步加速器美国能源部的先进光子源 （APS）s 阿贡国家实验室Beamline 19 ID美国能源部的先进光子源 （APS）s 阿贡国家实验室为几乎所有科学学科的研究提供超亮、高储能环形产生的 X 射线束。

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
  3. Ben-Neriah, Y., Karin, M.

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IKK1 AlphaProtein ExpressionInsect CellsBaculovirus SystemProtein PurificationSize Exclusion ChromatographyProtein CrystallizationX ray CrystallographyMolecular ReplacementStructure Determination

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