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方法文章

通过反复臭氧暴露在小鼠中建立慢性阻塞性肺疾病模型

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DOI：

10.3791/56095

⸱

2017年8月25日

 ,  ,  , 
1Cellular Biomedicine Group, Shanghai, 2Cellular Biomedicine Group, Cupertino, 3Department of Respiratory Medicine, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University

本文内容

摘要

本研究描述了通过反复将小鼠暴露于高浓度臭氧中，成功建立一种新的慢性阻塞性肺疾病（COPD）动物模型的方法。

摘要

慢性阻塞性肺疾病（COPD）的特征是持续性气流受限和肺实质破坏，在老年人群中发病率极高。目前COPD的常规治疗主要集中于缓解症状的药物，因此迫切需要开发新的治疗方法。合适的COPD动物模型有助于阐明其潜在发病机制，并可用于新药筛选。现有的COPD模型，如脂多糖（LPS）或猪胰弹性蛋白酶（PPE）诱导的肺气肿模型，虽可在肺和气道中产生类似COPD的病变，但其发病过程并不完全模拟人类COPD的真实病理过程。香烟烟雾（CS）诱导模型仍是目前最常用的方法之一，因为它不仅能在呼吸系统中模拟出类似COPD的病变，而且其致病因素——香烟烟雾——正是导致人类COPD的主要危险因素之一。然而，CS诱导模型耗时长、劳动强度大，严重限制了其在新药筛选中的应用。在本研究中，我们通过让小鼠暴露于高浓度臭氧成功建立了一种新的COPD模型。该模型表现出以下特征：1）用力呼气容积25、50和75占用力肺活量的比值（FEV25/FVC、FEV50/FVC和FEV75/FVC）下降，提示肺功能恶化；2）肺泡扩大，伴有肺实质破坏；3）疲劳时间与运动距离缩短；4）炎症反应增强。综上所述，这些数据表明臭氧暴露（OE）模型是一种可靠的动物模型，且具有与人类COPD相似的病理基础，因为臭氧过度暴露是COPD的病因学因素之一。此外，根据我们以往的研究，建立OE模型仅需6至8周，而香烟烟雾模型则需要3至12个月，表明OE模型可能是开展COPD研究的理想选择。

引言

据估计，慢性阻塞性肺疾病（COPD），包括肺气肿和慢性支气管炎，可能在2020年成为全球第三大死因1,2。预计在未来40年内，40岁以上人群中COPD的潜在发病率在男性中约为12.7%，在女性中约为8.3%3。目前尚无药物能够逆转COPD患者的进行性肺功能恶化4。可靠的COPD动物模型不仅需要模拟疾病的病理过程，还应具备较短的建模周期。现有的COPD模型，如脂多糖（LPS）或猪胰弹性蛋白酶（PPE）诱导模型，可引发类似肺气肿的症状5,6。对小鼠或大鼠单次给予LPS或PPE，或进行为期一周的反复刺激，可导致支气管肺泡灌洗液（BALF）中显著的中性粒细胞增多，增加BALF或血清中促炎介质（例如，TNF-α 和 IL-1β）的水平，引起肺实质破坏、肺泡腔扩大，并导致气流受限5,6,7,8,9,10。然而，LPS和PPE并非人类COPD的致病因素，因此无法真实模拟其病理过程11。香烟烟雾（CS）诱导模型可产生持续性气流受限、肺实质破坏以及运动功能下降，但传统的香烟烟雾暴露方案至少需要3个月才能建立COPD模型12,13,14,15。因此，建立一种新的、更高效的动物模型以满足上述两项要求显得尤为重要。

近年来，除了吸烟之外，空气污染和职业暴露也已成为慢性阻塞性肺疾病（COPD）更为常见的病因16,17,18。臭氧作为主要污染物之一（尽管并非空气污染的主要成分），可直接与呼吸道发生反应，损害儿童和青壮年的肺组织19,20,21,22,23,24,25。臭氧以及其他刺激物（如LPS、PPE和CS）参与了一系列肺部氧化应激和DNA损伤的生化通路，与COPD的启动和发展密切相关26,27。另一个因素是，部分COPD患者在暴露于臭氧后症状加重，表明臭氧可破坏肺功能18,28,29。因此，我们通过将小鼠反复暴露于高浓度臭氧中7周，建立了一种新的COPD模型；该模型导致的气流受限和肺实质损伤与既往研究结果相似30,31,32。在本研究中，我们将臭氧暴露（OE）方案扩展至雌性小鼠，并成功再现了我们在前期研究中于雄性小鼠观察到的肺气肿表型30,31,32。由于在许多国家，男性COPD死亡率已下降，而女性COPD死亡率却呈上升趋势33，因此亟需建立雌性COPD模型，以研究其发病机制并开发针对女性COPD患者的治疗方法。臭氧暴露模型在不同性别中的适用性进一步支持了其作为COPD动物模型的可靠性。

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方案

注意：OE 模型已在先前报道的研究中构建并使用30,31,32。所有动物实验均经上海交通大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 小鼠

  1. 在动物实验设施内，将7至9周龄的雌性BALB/c小鼠饲养于独立通风笼具中，环境温度控制在20 °C，相对湿度维持在40 - 60%。提供12小时光照/12小时黑暗循环 小时光照和12 设施内保持12小时光照与12小时黑暗循环。提供食物和水 随意摄取.

2. 臭氧或空气暴露

  1. 在密封的丙烯酸（例如 聚甲基丙烯酸甲酯，Perspex）箱内使用电晕放电式臭氧发生器产生臭氧。通过连接在箱体内外的通风管，利用小型气泵将箱内空气排出。使用臭氧探头监测箱内臭氧浓度，待浓度达到2.5百万分率（ppm）时停止。
    注意：臭氧探头可自动控制臭氧发生器的开关，从而将箱内臭氧浓度维持在2.5 ppm。
  2. 当箱内臭氧浓度达到2.5 ppm时，将小鼠放入箱中。每次使小鼠在箱内暴露于臭氧环境中3小时。
    注意：在3小时暴露期间，系统可通过自动启停臭氧发生器，并将小鼠代谢产生的CO2排出箱外，从而维持箱内臭氧浓度稳定在2.5 ppm。
  3. 每周进行两次臭氧暴露处理，每次暴露持续3小时，间隔3天，共持续7周；同时，对照组小鼠在相同时间段内暴露于普通空气环境中。

3. 微型计算机断层扫描

  1. 第7周结束时，通过腹腔注射戊巴比妥钠（1%，0.6 - 0.8 ml/100 g）对小鼠进行麻醉 ，根据个体情况调整剂量，确保小鼠对脚趾夹捏无反应 。监测并维持小鼠呼吸频率稳定，在操作过程中确保无自主运动。
  2. 将麻醉后的小鼠置于微型计算机断层扫描仪（µCT）的扫描腔内。
  3. 按照标准操作流程及制造商说明对µCT进行校准。将X射线管电压设为50 kV，电流设为450 µA。
    注意：X射线源和探测器均围绕小鼠旋转。
  4. 进行µCT扫描，采集515个投影图像，有效像素尺寸为0.092 mm，单层曝光时间为300 ms，层厚为0.093 mm。
  5. 使用软件对采集的图像进行肺部重建。通过将灰度范围的最小值和最大值分别设为-750和-550 Hounsfield单位，调节灰度图像的亮度。
    注意：软件将自动计算肺实质和低衰减区域（LAA）的体积34,35。
  6. 通过将LAA体积除以总肺容积，计算LAA所占百分比（LAA%）。

4. 跑台实验

  1. 在跑台跑步机上以 10 m/min 的速度对小鼠进行持续 10 分钟的适应性测试。 注意：操作过程中电源始终处于关闭状态。 
  2. 对小鼠进行疲劳测试。
    1. 以 10 m/min 的速度让小鼠热身 5 分钟。
    2. 将速度提高至 15 m/min，持续 10 分钟。
    3. 逐步增加运动强度：从 20 m/min 开始，每 30 分钟增加速度 5 m/min，直至小鼠无法继续奔跑36。
  3. 分别记录总跑步距离和跑步时间，作为疲劳距离和疲劳时间。

5. 肺功能测量

  1. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（1%，0.6 - 0.8 ml/100 g）对小鼠进行麻醉，根据个体情况调整剂量，确保小鼠对足趾夹捏无反应 ，并等待小鼠维持自主呼吸。 监测并保持小鼠呼吸频率稳定；确保在操作过程中无任何自主运动。
  2. 小心地对小鼠进行气管切开术，并将其置于与计算机控制呼吸机相连的体容积描记仪中。
    注：通气通过位于气管插管近端的阀门控制。该装置可提供多种半自动操作，包括准静态压力-容积操作和快速流速-容积操作。
  3. 通过压力控制通气，向麻醉小鼠施加平均呼吸频率150次/分钟，直至获得规律的呼吸模式，并在每个呼吸周期中实现完全呼气。
  4. 利用体容积描记仪产生的负压，通过设备执行准静态压力-容积操作。
  5. 在准静态压力-容积环内执行快速流速-容积操作，以记录用力肺活量（FVC）和用力呼气量（FEV）。将肺部充气至+30 cm H2O，随后立即连接至高度负压，强制呼气直至残气量达到-30 cm H2O。记录呼气开始后前25、50和75毫秒内的FEV值（分别为FEV25、FEV50和FEV75）。排除不理想的操作。每次对单个小鼠的测试中，至少进行三次可接受的操作，以获得所有数值参数的可靠均值。

6. 支气管肺泡灌洗液采集

  1. 在使用戊巴比妥钠（1%，1.8–2.4 ml/100 g）进行终末麻醉后 根据个体情况调整剂量，确保小鼠对脚趾夹捏无反应且呼吸停止）， 通过直径为1 mm的气管插管，用2 mL PBS对小鼠进行灌洗，然后收集支气管肺泡灌洗液（BALF）10.
  2. 将收集的灌洗液等分试样合并，在 4 °C、250 x g 条件下离心 10 分钟。
  3. 收集上清液用于立即实验，其余部分储存于 -80 °C 或液氮中。
  4. 使用血细胞计数板对细胞总数进行计数。
  5. 将细胞沉淀重悬于PBS中，取250 µL重悬细胞，用玻片离心机以1,400 × g离心6分钟，使细胞沉降到载玻片上。
  6. 根据制造商说明书，对载玻片上的细胞进行瑞氏染色。
  7. 每只小鼠计数200个细胞；在400倍显微镜下根据标准形态学特征鉴定巨噬细胞或中性粒细胞，并记录其数量。

7. 心脏采血

  1. 通过心脏穿刺采集血液，将血液装入1.5 mL离心管中，并在冰上放置30分钟。
  2. 在4 °C条件下，以2,000 × g离心血液样本5分钟。
  3. 将上清液（血清）转移至新管中，并在-80 °C或液氮中保存。
  4. 使用相应的ELISA试剂盒，对血清进行IL-1β、IL-10和TNF-α检测的准备工作。

8. 肺形态计量学分析

  1. 从小鼠中解剖肺和气管。
    1. 处死后立即将每只小鼠固定在手术板上。
    2. 解剖分离颈阔肌和气管前肌肉，以暴露并接触到气管环。
    3. 打开胸腔，解剖取出肺和气管，但不要将心脏与肺分离。
  2. 通过PE90聚乙烯管将气管内导管连接至含有4%多聚甲醛的注射器。
    注意：多聚甲醛具有毒性。操作时应佩戴手套和护目镜，并在通风橱内使用。
  3. 通过气管内导管注入4%多聚甲醛（10滴，约200 µL）将肺完全充盈。充盈完成后移除心脏。
  4. 将肺组织置于含10 mL 4%多聚甲醛的15 mL离心管中，固定至少4小时。
  5. 将肺组织包埋于石蜡中，使用旋转式切片机对石蜡块进行切片，获得5 µm厚的切片。切片过程中应尽可能暴露支气管树区域内的最大肺组织表面积。
  6. 进行形态计量分析时，对切片进行苏木精-伊红（H&E）染色。
  7. 使用明场直立显微镜（物镜倍数：20X；曝光时间：1.667 ms）对切片进行成像。
  8. 由两名不了解处理方案的研究人员独立对组织切片进行盲法计数。采用平均线性截距（Lm）作为衡量肺泡间隔壁距离的参数。通过以下步骤测定Lm：
    1. 在Photoshop中打开切片图像，并在图像上绘制包含五条550 µm 长直线的网格。
    2. 统计网格线穿过的肺泡数量。
    3. 通过将网格线长度除以肺泡数量计算Lm。定量分析时，每只小鼠取五个切片，每个切片采集十张图像（每视野一张图像），并随机评估。在选择视野时，应避开气道和血管区域，可向前移动一个视野或更换方向。
      注：数据以均值±标准误（S.E.M.）表示。采用非配对t检验比较空气暴露小鼠与臭氧暴露小鼠之间的差异。每组使用三只动物以计算显著性差异。以p值<0.05为具有统计学意义。

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结果

各组小鼠的三维显微计算机断层扫描（µCT）图像示例如图1a所示。与空气暴露的对照组小鼠相比，臭氧暴露小鼠的总肺容积（图1a和b）和肺低衰减区域百分比（LAA%）（图1c）显著增大。在持续六周的臭氧暴露后，肺容积和LAA%仍维持在较高水平31,32。肺容积和LAA%的增加代表了肺气肿表型。如图2a所示的肺泡扩大示例，直观地展示了肺气肿的形成。臭氧暴露小鼠的平均线性截距（Lm）增加（图2b），证实了...

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讨论

在本研究中，我们提出了一种构建新型慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型的可靠方法。与其他模型相比（即， LPS 或 PPE 模型）相比，该 OE 模型可重现慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者的病理过程。由于香烟烟雾是导致人类 COPD 患者发病的主要有害物质40，慢性支气管炎模型仍然是最常用的慢性阻塞性肺疾病模型41,42然而，CS模型需要3至12个月的R&D 新药研发周期。与CS模型相比，当前的OE模型将造模周期缩短至6-8周。在前期研究中，我们已观察到雄性小鼠经6周臭氧暴露后出现肺气肿表现。30,31,32在本研究中，我们对雌性小鼠应用了为期7周的OE方案，并成功建立了雌性OE模型。已有报道称，在一些国家，慢性阻塞性肺疾病（COPD）的死亡率在男性中下降，但...

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披露

Z.W.S. 和 W.W. 目前就职于中生北控生物科技股份有限公司（纳斯达克代码：CBMG），并持有该公司股票期权。其他作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者谨向秦博寅先生（上海公共卫生临床中心）致以感谢，感谢其在本方案的 µCT 评估中提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BALB/c 小鼠Slac 实验动物，中国上海N/A本研究使用7至9周龄的雌性BALB/c小鼠。
独立通风笼具苏杭，中国上海型号：MU64S7该笼具用于动物实验设施中饲养小鼠。
密封有机玻璃箱苏杭，中国上海N/A该箱体用于 放置臭氧发生器，小鼠在箱内暴露于臭氧。
臭氧发生器Sander Ozoniser，德国Uetze-Eltze型号 500 该设备用于生成臭氧。
臭氧探头ATi Technologies，英国阿什顿-安德-莱恩，大曼彻斯特Ozone 300该设备用于监测和控制臭氧的生成。
戊巴比妥钠Sigma，美国密苏里州圣路易斯P3761通过腹腔注射戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉。
微型计算机断层扫描仪GE Healthcare，加拿大安大略省伦敦RS0800639-0075该设备用于获取肺部图像。
Micro-view 2.01 ABA 软件GE Healthcare，加拿大安大略省伦敦Micro-view 2.01 该软件用于重建肺部结构，并分析肺体积及肺气肿面积（LAA）。
跑步机 杭州杜氏，中国浙江杭州DSPT-208该设备用于疲劳测试。
体描计eSpira™ 强制操作系统，EMMS，英国爱丁堡强制操作系统该设备用于检测肺功能中的肺量计指标。
呼吸机eSpira™ 强制操作系统，EMMS，英国爱丁堡强制操作系统该设备用于检测肺功能中的肺量计指标。
载片离心机Denville Scientific，美国马萨诸塞州霍利斯顿C1183 用于将支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞离心至载玻片上。
瑞氏染色液上海瀚鸿，中国上海RE04000054 用于对悬浮的支气管肺泡灌洗液（BALF）中的巨噬细胞和中性粒细胞进行染色。
血细胞计数板Hausser Scientific，美国宾夕法尼亚州霍舍姆4000用于细胞计数。
IL-1βAbcam，美国马萨诸塞州剑桥ab100704用于检测血清中相应因子的水平。
IL-10Abcam，美国马萨诸塞州剑桥ab46103用于检测血清中相应因子的水平。
TNF-αAbcam，美国马萨诸塞州剑桥ab100747用于检测血清中相应因子的水平。
多聚甲醛 Sigma，美国密苏里州圣路易斯P6148使用4%多聚甲醛对肺组织进行灌注固定。
石蜡华凌，中国上海56#用于肺组织包埋。
旋转式切片机Leica，德国黑森州韦茨拉尔 RM2255用于肺组织切片。
苏木精-伊红（H&E）染色液索莱宝，中国北京G1120进行H&E染色以用于形态计量学分析。
正置明场显微镜Olympus，美国宾夕法尼亚州中心谷CX41用于拍摄H&E染色切片图像。
Adobe Photoshop 12Adobe，美国加利福尼亚州圣何塞Adobe Photoshop 12用于统计H&E染色图像中肺泡的数量。
GraphPad Prism 5GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥GraphPad Prism 5用于数据分析和图表制作。

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臭氧暴露模型小鼠慢性阻塞性肺疾病模型肺功能评估微型计算机断层扫描体容积描记仪运动耐量测试支气管肺泡灌洗心脏采血多聚甲醛固定
通过反复臭氧暴露在小鼠中建立慢性阻塞性肺疾病模型
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