通过反复臭氧暴露在小鼠中建立慢性阻塞性肺疾病模型

摘要

本研究描述了通过反复将小鼠暴露于高浓度臭氧中，成功建立一种新的慢性阻塞性肺疾病（COPD）动物模型的方法。

摘要

慢性阻塞性肺疾病（COPD）的特征是持续性气流受限和肺实质破坏，在老年人群中发病率极高。目前COPD的常规治疗主要集中于缓解症状的药物，因此迫切需要开发新的治疗方法。合适的COPD动物模型有助于阐明其潜在发病机制，并可用于新药筛选。现有的COPD模型，如脂多糖（LPS）或猪胰弹性蛋白酶（PPE）诱导的肺气肿模型，虽可在肺和气道中产生类似COPD的病变，但其发病过程并不完全模拟人类COPD的病理过程。香烟烟雾（CS）诱导模型仍是目前最常用的方法之一，因为它不仅能在呼吸系统中模拟出类似COPD的病变，而且其致病因素——香烟烟雾——正是导致人类COPD的主要危险因素之一。然而，CS诱导模型耗时长、劳动强度大，严重限制了其在新药筛选中的应用。在本研究中，我们通过将小鼠暴露于高浓度臭氧环境中，成功建立了一种新的COPD模型。该模型表现出以下特征：1）用力呼气容积25、50和75占用力肺活量的比值（FEV₂₅/FVC、FEV₅₀/FVC和FEV₇₅/FVC）下降，提示肺功能恶化；2）肺泡扩大，伴有肺实质破坏；3）疲劳时间与运动距离缩短；4）炎症反应增强。综上所述，这些数据表明臭氧暴露（OE）模型是一种可靠的动物模型，且与人类COPD具有相似性，因为臭氧过度暴露是COPD的病因因素之一。此外，根据我们以往的研究，建立OE模型仅需6至8周，而香烟烟雾模型则需要3至12个月，表明OE模型可能是开展COPD研究的理想选择。

引言

据估计，慢性阻塞性肺疾病（COPD），包括肺气肿和慢性支气管炎，可能在2020年成为全球第三大死因^1,2。预计在未来40年内，40岁以上人群中COPD的潜在发病率在男性中约为12.7%，在女性中约为8.3%³。目前尚无药物能够逆转COPD患者的进行性肺功能恶化⁴。可靠的COPD动物模型不仅需要模拟疾病的病理过程，还应具备较短的建模周期。现有的COPD模型，如脂多糖（LPS）或猪胰弹性蛋白酶（PPE）诱导模型，可引发类似肺气肿的症状^5,6。对小鼠或大鼠单次给予LPS或PPE，或进行为期一周的反复刺激，可导致支气管肺泡灌洗液（BALF）中显著的中性粒细胞增多，增加BALF或血清中促炎介质（例如，TNF-α 和 IL-1β）的水平，引起肺实质破坏、肺泡腔扩大，并导致气流受限^5,6,7,8,

方案

注意：OE 模型已在先前报道的研究中构建并使用^30,31,32。所有动物实验均经上海交通大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 小鼠

1. 在动物实验设施内，将7至9周龄的雌性BALB/c小鼠饲养于独立通风笼具中，环境温度控制在20 °C，相对湿度维持在40 - 60%。提供12小时光照/12小时黑暗循环 小时光照和12 设施内保持黑暗周期。提供食物和水 随意摄取.

2. 臭氧或空气暴露

1. 在密封的丙烯酸（例如 聚甲基丙烯酸甲酯，Perspex）箱内使用电晕放电式臭氧发生器产生臭氧。通过连接在箱体内外的通风管，利用小型鼓风机将箱内空气排出。使用臭氧探头监测箱内臭氧浓度，直至浓度达到2.5百万分率（ppm）。
   注意：臭氧探头可自动开启或关闭臭氧发生器，从而将箱内臭氧浓度维持在2.5 ppm。
2. 当臭氧浓度达到2.5 ppm时，将小鼠放入箱内。每次使小鼠在箱中停留3小时，以实现臭氧暴露。
   注意：在3小时暴露期间，系统可通过自动控制臭氧发生器的开关，并将小鼠代谢产生的CO<....

结果

各组小鼠的三维显微计算机断层扫描（µCT）图像示例见图1a。与空气暴露的对照组小鼠相比，臭氧暴露小鼠的总肺容积（图1a和b）和肺低衰减区域百分比（LAA%）（图1c）显著增加。在持续六周的臭氧暴露后，肺容积和LAA%仍维持在较高水平^31,32。肺容积和LAA%的增加代表了肺气肿表型。图2a中肺泡扩大的示例说明了肺气肿的形成。臭氧暴露小鼠的平均线性截距（Lm）增加（图2b），证实了臭氧暴露后发生了.......

讨论

在本研究中，我们提出了一种构建新型慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型的可靠方法。与其他模型相比（即， LPS 或 PPE 模型）相比，该 OE 模型可重现慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者的病理过程。由于香烟烟雾是导致人类 COPD 患者发病的主要有害物质⁴⁰慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型中，CS模型仍然是最常用的模型^41,42然而，CS模型需要3至12个月的R&新药研发的周期。与CS模型相比，当前的OE模型将造模周期缩短至6-8周。在前期研究中，我们已观察到雄性小鼠经6周臭氧暴露后出现肺气肿表现。^30,31,32在本研究中，我们对雌性小鼠应用OE方案持续7周，成功建立了雌性OE模型。已有报道指出，在一些国家，慢性阻塞性肺疾病（COPD）的死亡率在男性中下降，但在女.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BALB/c 小鼠	Slac 实验动物，中国上海	N/A	本研究使用7至9周龄的雌性BALB/c小鼠。
独立通风笼具	苏杭，中国上海	型号：MU64S7	该笼具用于动物实验设施中饲养小鼠。
密封有机玻璃箱	苏杭，中国上海	N/A	该箱体用于 放置臭氧发生器。小鼠在箱内暴露于臭氧。
臭氧发生器	Sander Ozoniser，德国Uetze-Eltze	型号 500	该设备用于生成臭氧。
臭氧探头	ATi Technologies，英国大曼彻斯特郡阿什顿-安-莱恩	Ozone 300	该设备用于监测和控制臭氧的生成。
戊巴比妥钠	Sigma，美国密苏里州圣路易斯	P3761	通过腹腔注射戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉。
微型计算机断层扫描仪	GE Healthcare，加拿大安大略省伦敦	RS0800639-0075	该设备用于获取肺部图像。
Micro-view 2.01 ABA 软件	GE Healthcare，加拿大安大略省伦敦	Micro-view 2.01	该软件用于重建肺部结构，并分析肺体积和肺气肿面积（LAA）。
跑步机	杭州段氏，中国浙江杭州	DSPT-208	该设备用于疲劳测试。
体描计	eSpira™ 强制操作系统，EMMS，英国爱丁堡	强制操作系统	该设备用于检测肺功能中的肺活量测定。
呼吸机	eSpira™ 强制操作系统，EMMS，英国爱丁堡	强制操作系统	该设备用于检测肺功能中的肺活量测定。
载片离心机	Denville Scientific，美国马萨诸塞州霍利斯顿	C1183	用于将支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞离心至载玻片上。
瑞氏染色	上海瀚鸿，中国上海	RE04000054	用于对悬浮的BALF中的巨噬细胞和中性粒细胞进行染色。
血细胞计数板	Hausser Scientific，美国宾夕法尼亚州霍舍姆	4000	用于细胞计数。
IL-1β	Abcam，美国马萨诸塞州剑桥	ab100704	用于检测血清中相应的因子。
IL-10	Abcam，美国马萨诸塞州剑桥	ab46103	用于检测血清中相应的因子。
TNF-α	Abcam，美国马萨诸塞州剑桥	ab100747	用于检测血清中相应的因子。
多聚甲醛	Sigma，美国密苏里州圣路易斯	P6148	使用4%多聚甲醛对肺进行灌注固定。
石蜡	华凌，中国上海	56#	用于肺组织包埋。
旋转式切片机	Leica，德国黑森州韦茨拉尔	RM2255	用于肺组织切片。
苏木精-伊红（H&E）染色液	索莱宝，中国北京	G1120	进行H&E染色以用于形态计量分析。
正置明场显微镜	Olympus，美国宾夕法尼亚州中心谷	CX41	用于拍摄H&E染色切片图像。
Adobe Photoshop 12	Adobe，美国加利福尼亚州圣何塞	Adobe Photoshop 12	用于计数H&E染色图像中的肺泡数量。
GraphPad Prism 5	GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥	GraphPad Prism 5	用于数据分析和图表制作。