上述 秀丽隐杆线虫 排泄管是用于可视化研究的单细胞独特模型 在体内 分析 从头 极性膜生物合成。本方案描述了标准遗传学/RNAi与成像技术的结合方法，可适用于鉴定和表征调控单细胞管状发生以及顶膜和管腔生物合成的分子。
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方法文章
TheC. elegans排泄管作为细胞内管腔形态发生和单细胞管状结构形成的模型体内单细胞中的极性膜生物发生：GFP融合蛋白标记、RNAi相互作用筛选与成像
本文内容
摘要
摘要
四个 秀丽隐杆线虫 排泄管是由单个细胞延伸出的狭窄管道，贯穿整个动物体，其内部具有几乎同等长度延伸的细胞内内管，通过具有顶膜特性的膜结构和膜下细胞骨架构建并稳定管腔。排泄细胞在形成这些管道时长度约伸长2,000倍，使该模型成为在体内研究从头极化膜生物合成、细胞内管腔形态发生及单细胞管状结构形成的独特体系 在体内 评估 从头 极性膜生物合成、细胞内管腔形态发生及单细胞管形成。本方案展示了如何结合标准标记、功能获得与功能缺失的遗传学或RNA干扰（RNAi）以及显微技术，利用该模型在分子水平上对这些过程进行可视化解析和功能分析。作为标记方法的示例，本方案概述了构建表达荧光融合蛋白的转基因动物，以实现对管形成过程的活体分析。作为遗传学方法的示例，重点介绍了基于RNAi的视觉互作筛选的关键环节，该筛选旨在修饰一种功能获得性的囊状管表型。文中具体描述的方法包括：通过表达荧光蛋白对管道进行标记与可视化；构建靶向RNAi文库并设计RNAi筛选策略，用于管道形态发生的分子分析；通过荧光显微镜观察评估管道表型的改变，并对其进行评分；利用共聚焦显微镜高分辨率地表征管道的亚细胞组分；以及对可视化参数进行定量分析。该方法适用于希望利用中国台湾产线虫（C. elegans）排泄管系统来鉴定和表征在进化上保守的细胞内管腔与单细胞管形态发生相关基因的研究人员。 秀丽隐杆线虫 利用排泄管鉴定和表征参与细胞内管腔及单细胞管形态发生这一进化保守过程的基因。
引言
所有内部器官均由管道构成，这些管道在多种不同功能中起着关键作用，例如气体、液体和营养物质的运输与交换，以及代谢废物的排泄。这些器官具有极性特征，拥有明确的顶膜和腔膜，以适应其特定功能；而内膜系统和质膜系统的生物合成缺陷则是导致人类疾病常见的原因。1,2大多数血管和内脏器官的管道为多细胞结构，通过细胞间方式形成管腔；然而，单细胞管道则通过细胞内方式形成管腔，例如可占人类毛细血管床的30–50%2多细胞和单细胞管道的极化膜在组成上相似，尽管其微区可能因管道的具体功能而有所不同（例如，排泄管小管与肠微绒毛的比较 秀丽隐杆线虫；参见随附论文 秀丽隐杆线虫 肠道管状结构发生3极化膜生物合成与管状结构形成的原理在后生动物中是保守的，且由相似的分子机制进行调控1,2,4.
C. elegans 的排泄系统由五个细胞组成：排泄细胞（EC）、导管细胞（DC）、孔细胞（PC）以及两个腺细胞。消融 EC、DC 或 PC 会导致体腔内....
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方案
1. 标记 秀丽隐杆线虫 荧光融合蛋白标记排泄管14
注：参见关于肠道管状发生的相关论文3 用于标记 原位 适用于排泄管的抗体染色步骤。参见 表1 用于可视化示例的已证实有效的分子 秀丽隐杆线虫 排泄管内膜和质膜 表 2 有关驱动外排管表达的启动子示例，以及 表3 有关更全面的标记物和启动子资源，包括讨论不同荧光团选择的相关参考文献。
- 通过限制性内切酶克隆法构建组织特异性荧光标记质粒15
注意：参见 讨论 有关构建荧光融合蛋白的替代技术。- 在 WormBase 中确定目的基因的启动子序列（用于转录融合）或包含其启动子的完整基因序列（用于翻译融合）44.
注意：对于启动子，通常 1–3 千碱基（kb）已足以满足大多数需求 秀丽隐杆线虫 基因。也可以通过将目的基因置于排泄管特异性启动子下游来构建翻译融合蛋白（参见 表 2).
- 在 WormBase 中确定目的基因的启动子序列（用于转录融合）或包含其启动子的完整基因序列（用于翻译融合）44.
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结果
本方案描述了如何使用 秀丽隐杆线虫 排泄管用于在单个细胞中进行细胞外管状结构形成的视觉与分子分析，以及细胞内管腔形态发生的观察。在从中胚胎期到成体的延伸过程中，四条排泄管持续扩展其基底外侧膜和顶端/管腔膜，同时扩展其小管状结构及内体样内膜系统，从而为研究提供了一个独特的模型 体内 分析 从头合成 极化膜生物发生图1）。通过表达特定的荧光融合蛋白（见方案第1部分），可对顶膜、细胞质以及内体与胆小管囊泡等亚细胞结构进行可视化观察，并可在单个转基因动物中通过双标或三标方法将这些结构彼此区分开来。图2）。一种独特的排泄管表型（图3A–B) 通过过表达一种顶膜相关分子（ERM-1）而产生，用于演示如何开展靶向RNAi筛选，以鉴定在顶膜和管腔形成过程中发挥功能的基因；这作为在此模型中对极化膜形成的分子与可视化分析的一个示.......
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讨论
C. elegans 具有遗传多样性高、通体透明、体形结构简单以及细胞谱系恒定等特点，是研究形态发生的理想模型。本实验方案描述了如何结合常规的遗传操作与成像技术，利用仅 2 微米粗细的 C. elegans 排泄管，研究单细胞管中极性膜与细胞内腔的生物发生过程。
标记
可通过表达荧光融合蛋白对C. elegans排泄管进行标记，从而实现活体分析（本文所述），也可通过抗体或化学染色进行标记（有关抗体染色方法，参见关于肠道管状结构形成的配套论文3）。表达两种或多种不同的荧光蛋白，或结合使用不同的标记技术，可实现对这些细长管状结构的高分辨率可视化解析（图2）。由排泄管特异性启动子驱动、靶向排泄管的荧光融合蛋白是标记排泄管的首选方法，原因包括：（1）许多排泄管蛋白的表达水平较低；（2）排泄管结构精细，若目标蛋白在排泄管外也有表达，则非特异性染色极易掩盖其真实结构。然而，排泄管对异源蛋白.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
感谢美国堪萨斯大学的 M. Buechner、美国纽约罗切斯特大学医学中心的 K. Nehrke，以及由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室资助的Caenorhabditis遗传中心（P40 OD010440）。本研究工作得到了 NIH GM078653、MGH IS 224570 和 SAA 223809 项目对 V.G. 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 克隆 | |||
| 质粒 pPD95.75 | Addgene | 目录号 37464 | |
| PCR试剂盒 | Qiagen | 目录号 27106 | |
| 连接试剂盒 | 新英格兰生物实验室 | 货号 E2611L | |
| DNA标记 | 赛默飞世尔科技 | 货号 SM1331 | |
| 琼脂糖 DNA 级 | Fisher Scientific | 目录号 BP164-100 | |
| 感受态细胞 | New England Biolabs | Cat. No. C2987H | |
| Tris | Fisher Scientific | 产品编号 BP154-1 | |
| EDTA | Sigma | 货号 ED-1KG | |
| 乙酸 | Fisher Scientific | 货号 A38S-500 | |
| 溴化乙锭 | Fisher Scientific | 货号 BP1302-10 | |
| 仪器设备 | |||
| PCR仪 | MJ Research | 产品编号 PTG-200 | |
| 离心 | Eppendorf | 货号 5415C | |
| 水浴 | 精准科学 | 货号 666A3 | |
| 凝胶电泳仪 | Fisher Scientific | 货号 09-528-165 | |
| 凝胶电泳电源 | Fisher Scientific | 货号 45-000-465 | |
| 分子成像仪 Gel Doc XR 系统 | Bio-Rad | 产品编号 1708195EDU | |
| NanoDrop 分光光度计 | Thermo Scientific | 产品编号 ND1000 | |
| 秀丽隐杆线虫 相关1 | 1参见参考文献19 用于标准的 C. elegans 培养与保种操作。 | ||
| LB培养基与平板2 | 2参见参考文献19 用于实验方案。 | ||
| 胰蛋白胨 | Acros Organics | 货号 611845000 | |
| 酵母提取物 | BD Biosciences | 目录号 212750 | |
| NaCl | Sigma | 目录号 S7653 | |
| Bacto 琼脂 | BD Biosciences | 目录号 214040 | |
| 氨苄青霉素 | Sigma | 货号 A0116 | |
| 四环素 | Fisher Scientific | 目录号 BP912 | |
| M9 培养基2 | 2参见参考文献19 用于实验方案。 | ||
| NaCl | Sigma | 目录号 S7653 | |
| KH2PO4 | Sigma | 目录号 P0662 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 目录号 S7907 | |
| MgSO₄4 | Sigma | 货号 M2773 | |
| NGM 平板 2 | 2参见参考文献19 用于实验方案。 | ||
| NaCl | Sigma | 产品编号 S7653 | |
| 蛋白胨 | BD Biosciences | 目录号 211677 | |
| 胰蛋白胨 | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |
| Bacto 琼脂 | BD Biosciences | 货号 214040 | |
| MgSO₄4 | Sigma | 目录号 M2773 | |
| CaCl2 | Sigma | 目录号 C3881 | |
| 胆固醇 | Sigma | 目录号 C8667 | |
| K2HPO4 | Sigma | 目录号 P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma | 目录号 P0662 | |
| RNAi 平板3 | 3参见参考文献21 用于实验方案。 | ||
| NaCl | Sigma | 目录号 S7653 | |
| 蛋白胨 | BD Biosciences | 目录号 211677 | |
| 胰蛋白胨 | Acros Organics | 货号 611845000 | |
| Bacto 琼脂 | BD Biosciences | 目录号 214040 | |
| MgSO₄4 | Sigma | 产品编号 M2773 | |
| CaCl2 | Sigma | 产品编号 C3881 | |
| 胆固醇 | Sigma | 目录号 C8667 | |
| K2HPO4 | Sigma | 货号 P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma | 产品编号 P0662 | |
| IPTG | US Biological | 货号 I8500 | |
| 羧苄西林 | Fisher Scientific | 货号 BP2648 | |
| NaOH | Fisher Scientific | 货号 SS266-1 | |
| 次氯酸钠 | Fisher Scientific | 目录编号 50371500 | |
| 细菌 | |||
| OP50 细菌 | CGC | ||
| HT115 细菌 | CGC | ||
| 全基因组RNAi文库 | |||
| Ahringer全基因组RNAi饲喂文库（货号21,58,59) | Source BioScience | ||
| C. elegans ORF-RNAi 饲喂文库（参考文献60) | Source BioScience | ||
| 成像相关 | |||
| 利多卡因 | MP Biomedicals,LLG | 目录号 193917 | |
| 材料 | |||
| 真空润滑脂硅酮 | Beckman | 目录号 335148 | |
| 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 目录号 4448 | |
| 组织培养板，6 孔 | 康宁公司 | 目录号 08-772-33 | |
| 设备 | |||
| SMZ-U 解剖显微镜（Nikon） | |||
| SZX12 体视显微镜（Olympus），配备高倍立体荧光附件（Kramer Scientific）、带 Q capture 软件的 CCD 相机和 X-Cite 荧光灯（Photonic Solutions）。 | |||
| TCS SL 激光扫描共聚焦显微镜（Leica Microsystem） | |||
| 安装在ECLIPSE Ti-E倒置显微镜（Nikon）上的C2激光扫描共聚焦显微系统 |
参考文献
- Lubarsky, B., Krasnow, M. A. Tube morphogenesis: making and shaping biological tubes. Cell. 112 (1), (2003).
- Sundaram, M. V., Cohen, J. D. Time to make the doughnuts: Building and shaping seamless tubes. Semin. Cell Dev. Biol. S1084-9521, 30130-30136 (2016). ....
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重印与许可
