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方法文章

TheC. elegans排泄管作为细胞内管腔形态发生和单细胞管状结构形成的模型体内单细胞中的极性膜生物发生：GFP融合蛋白标记、RNAi相互作用筛选与成像

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DOI：

10.3791/56101

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2017年10月3日

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1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital for Children, Harvard Medical School, 2College of Life Sciences, Jilin University, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau

本文内容

摘要

上述 秀丽隐杆线虫 排泄管是用于可视化研究的单细胞独特模型 在体内 分析 从头 极性膜生物合成。本方案描述了标准遗传学/RNAi与成像技术的结合方法，可适用于鉴定和表征调控单细胞管状发生以及顶膜和管腔生物合成的分子。

摘要

四个 秀丽隐杆线虫 排泄管是由单个细胞延伸出的狭窄管道，贯穿整个动物体，其内部具有几乎同等长度延伸的细胞内内管，通过具有顶膜特性的膜结构和膜下细胞骨架构建并稳定管腔。排泄细胞在形成这些管道时长度约伸长2,000倍，使该模型成为在体内研究从头极化膜生物合成、细胞内管腔形态发生及单细胞管状结构形成的独特体系 在体内 评估 从头 极性膜生物合成、细胞内管腔形态发生及单细胞管形成。本方案展示了如何结合标准标记、功能获得与功能缺失的遗传学或RNA干扰（RNAi）以及显微技术，利用该模型在分子水平上对这些过程进行可视化解析和功能分析。作为标记方法的示例，本方案概述了构建表达荧光融合蛋白的转基因动物，以实现对管形成过程的活体分析。作为遗传学方法的示例，重点介绍了基于RNAi的视觉互作筛选的关键环节，该筛选旨在修饰一种功能获得性的囊状管表型。文中具体描述的方法包括：通过表达荧光蛋白对管道进行标记与可视化；构建靶向RNAi文库并设计RNAi筛选策略，用于管道形态发生的分子分析；通过荧光显微镜观察评估管道表型的改变，并对其进行评分；利用共聚焦显微镜高分辨率地表征管道的亚细胞组分；以及对可视化参数进行定量分析。该方法适用于希望利用中国台湾产线虫（C. elegans）排泄管系统来鉴定和表征在进化上保守的细胞内管腔与单细胞管形态发生相关基因的研究人员。 秀丽隐杆线虫 利用排泄管鉴定和表征参与细胞内管腔及单细胞管形态发生这一进化保守过程的基因。

引言

所有内部器官均由管道构成，这些管道在多种不同功能中起着关键作用，例如气体、液体和营养物质的运输与交换，以及代谢废物的排泄。这些器官具有极性特征，拥有明确的顶膜和腔膜，以适应其特定功能；而内膜系统和质膜系统的生物合成缺陷则是导致人类疾病常见的原因。1,2大多数血管和内脏器官的管道为多细胞结构，通过细胞间方式形成管腔；然而，单细胞管道则通过细胞内方式形成管腔，例如可占人类毛细血管床的30–50%2多细胞和单细胞管道的极化膜在组成上相似，尽管其微区可能因管道的具体功能而有所不同（例如，排泄管小管与肠微绒毛的比较 秀丽隐杆线虫；参见随附论文 秀丽隐杆线虫 肠道管状结构发生3极化膜生物合成与管状结构形成的原理在后生动物中是保守的，且由相似的分子机制进行调控1,2,4.

C. elegans 的排泄系统由五个细胞组成：排泄细胞（EC）、导管细胞（DC）、孔细胞（PC）以及两个腺细胞。消融 EC、DC 或 PC 会导致体腔内液体积聚，动物在早期幼虫阶段即死亡5。引人注目的是，这三个单细胞管通过三种不同的方式形成其管腔：通过细胞中空化（EC）；通过细胞包裹并伴随自细胞连接形成（PC）；以及通过细胞包裹并伴随自融合（DC）；这些管腔形态发生机制在系统发育上均具有保守性6,7。EC 位于后部咽球左侧，在此处发出两条侧向延伸结构，从中分出四条排泄管，分别向前和向后（左右两侧）延伸至线虫的头部前端和尾部末端（图1）5,6,8。EC 的长度从约 1 µm 扩展至 2 × 1,000 µm，是该生物体内最大的细胞。在亚细胞水平上，排泄管是一种简单管状结构，由朝向假体腔的基底膜发育而来，并由管腔膜（内管）贯穿形成管状通道。排泄管的管腔膜在其唯一的细胞间连接处与导管的管腔膜相连；除此之外，排泄管在其全长上无其他连接结构（图1）。排泄管的管腔膜及其膜下细胞骨架具有顶膜特性，其分子组成类似于多细胞管（如肠道）以及其他（例如，扁平）上皮细胞的顶膜和膜下细胞骨架。细胞质中的细胞器，包括内体囊泡及其他（例如，高尔基体）内膜系统，沿排泄管全长分布。此外，多种小管囊泡——或与管腔膜相连，或彼此连接，或孤立存在——贯穿于排泄管的细胞质中7,8,9,10。这种动态的质膜/小管连接进一步扩展了排泄管的膜系统，并参与管腔形态发生和渗透调节过程10。因此，排泄管几乎完全由内膜和质膜构成，是研究极化膜生物发生以及内膜与质膜界面调控的优良模型。在排泄管形态发生过程中顶膜发生的剧烈扩张——在此单细胞系统中与管腔延伸同步进行——也使得研究为稳定和居中定位细胞内管腔膜而产生的结构问题成为可能。本实验方案重点关注排泄管及管腔结构形态发生的分析，以及该过程所需的细胞内膜动态变化，而非调控细胞运动以建立 EC 在排泄系统中的位置及其与其他细胞元件复杂连接的信号通路（详见文献6综述）。

C. elegans 单细胞管状系统在分析极化膜和细胞内腔室生物发生方面的一个进一步优势在于，它能够在发育时间上分离其膜和连接结构不同组分的生成过程。排泄细胞（EC）在腹侧闭合时期诞生，并于胚胎中期定居于咽部腹侧-外侧位置5,6,8，此时侧向管的延伸和分支开始发生。随后，在胚胎发育晚期发生前后方向的管延伸，这一过程持续至L1幼虫阶段（图1）。在刚孵化的幼虫中，后部管尖端大约到达虫体中部，并在L1阶段末期完全延伸至尾部，此后管的伸长与虫体整体生长同步进行8。因此，管的主动生长速度超过动物整体生长速度的阶段在第一幼虫阶段结束，但在后续幼虫阶段（L2–4）中，管仍会随着整个动物的生长而继续伸长。这种发育设置使得研究者能够在不依赖极化细胞分裂或细胞迁移的情况下，独立分析从头极化膜生物发生的各个步骤。此外，该系统还能将这一过程与连接结构的组装相分离（连接结构在胚胎中腔室启动之前即已形成）；而连接结构在膜极化中的确切作用，目前仍是细胞极性领域中的一个未解问题。最后，该系统还能独特地将顶膜扩展与基底膜扩展区分开来，其中后者在排泄管中早于前者发生10。因此，C. elegans 排泄管模型是对肠道模型的一个极具信息价值的补充：肠道模型在分析极化膜生物发生方面也具备若干类似优势，但其过程发生于多细胞环境中（参见同期发表的关于肠道管状结构形成的论文3）。

尽管野生型导管在此微小蠕虫中为极细的管状结构，但利用该透明动物的微分干涉差显微镜（Nomarski optics）可直接观察其管腔。事实上，无需标记即可通过低倍解剖显微镜观察突变体囊状导管的形态，该方法已在正向遗传筛选中被高效用于鉴定参与管状结构形成的基因。11然而，为了更清晰地观察管道的形态，并区分其极化膜、细胞骨架组分、不同细胞器及其他亚细胞结构，需要进行标记，并采用更高倍率的荧光解剖显微镜和共聚焦显微镜观察。尽管管道的精细结构在标记和显微成像方面带来诸多挑战，但可通过各区室特有的标志性分子来区分膜结构和亚细胞组分；同时，只要采取适当预防措施以避免引入人为假象，即可安全地将线虫样本装载用于显微观察（参见 实验方案 以及 讨论可通过免疫组织化学方法在固定样本中进行标记，或通过构建转基因线虫实现在其自身启动子或排泄管特异性启动子调控下表达荧光融合蛋白进行标记 在体内 成像。本方案描述了后一种标记技术（有关抗体染色，请参见 accompanying paper on intestinal tubulogenesis）3).

结合的能力 在体内 功能缺失或功能获得研究 在体内 在整个发育过程中对单细胞水平进行成像分析使得 秀丽隐杆线虫 排泄管是进行单细胞管状发生分子与细胞分析的极具优势的模型。可利用野生型或带有标记的转基因动物开展正向或反向遗传学筛选，以鉴定管腔形态发生表型（例如囊肿）及其潜在的基因缺陷。此外，此类筛选也可从突变体表型出发例如，囊状管）并鉴定该表型的抑制因子或增强因子，以识别与导致突变表型的基因存在功能互作的基因。导致突变表型的遗传缺陷可引起功能丧失（例如, 通过 基因缺失）或获得（例如, 通过 一种激活突变或通过引入过量基因拷贝）来研究其功能。正向诱变或系统性RNA干扰（RNAi）筛选无需预先假设基因功能，可无偏倚地鉴定参与特定功能的基因。鉴于全基因组范围的RNAi饲喂文库已可获得，几乎每个基因均可通过RNAi轻松实现敲低 C. elegans，使得任何一个感兴趣的基因或任何一组基因（例如，在靶向筛选中）也可以通过反向遗传学方法快速检测其效应。为了展示多种方法的可能组合，本文描述了一项靶向RNAi相互作用筛选实验，起始于一个表达细胞质绿色荧光蛋白（GFP）标记的囊状排泄管显性获得功能突变体。该突变表型由过表达产生 erm-1，一种高度保守的 C. elegans 膜-肌动蛋白连接蛋白家族 Ezrin-Radixin-Moesin（ERM）的同源物，该家族已在多个物种中被证实参与管腔形态发生及膜结构组织12. C. elegans ERM-1 定位于内部器官（如排泄管和肠道）的管腔膜，并且在两者管腔的形成过程中均是必需的13ERM-1 过表达将过量的肌动蛋白和囊泡募集至管腔膜，增加向管腔内的物质转运，导致形成较短的囊状管腔和带有增厚肌动蛋白下涂层的皱缩管腔膜9该方案描述了如何构建表达标记融合蛋白（或其他蛋白）的排泄管转基因品系；如何利用这些品系开展靶向RNA干扰（RNAi）筛选，以鉴定影响排泄管表型的修饰因子；以及如何通过荧光解剖显微镜和共聚焦显微镜对筛选结果进行可视化分析，包括对具有信息量的管状发生表型进行简单量化的方法。有关其他标记技术及针对常致死性管状发生基因优化的RNAi实验细节，可参见同期发表的关于肠道管状发生的研究论文。3所有方法均可以不同组合方式用于探究导管管状形成过程中的其他问题。

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方案

1. 标记 秀丽隐杆线虫 荧光融合蛋白标记排泄管14

注：参见关于肠道管状发生的相关论文3 用于标记 原位 适用于排泄管的抗体染色步骤。参见 表1 用于可视化示例的已证实有效的分子 秀丽隐杆线虫 排泄管内膜和质膜 表 2 有关驱动外排管表达的启动子示例，以及 表3 有关更全面的标记物和启动子资源，包括讨论不同荧光团选择的相关参考文献。

  1. 通过限制性内切酶克隆法构建组织特异性荧光标记质粒15
    注意：参见 讨论 有关构建荧光融合蛋白的替代技术。
    1. 在 WormBase 中确定目的基因的启动子序列（用于转录融合）或包含其启动子的完整基因序列（用于翻译融合）44.
      注意：对于启动子，通常 1–3 千碱基（kb）已足以满足大多数需求 秀丽隐杆线虫 基因。也可以通过将目的基因置于排泄管特异性启动子下游来构建翻译融合蛋白（参见 表 2).
    2. 为扩增启动子（用于转录融合）和/或包含启动子的完整基因（用于翻译融合），设计上下游引物。在引物的5’和3’端添加限制性内切酶连接子。
      注意：选择存在于载体质粒中的限制性内切酶例如，pPD95.7916对于融合蛋白的构建，3’端连接序列的设计应确保在经限制性内切酶消化并与载体连接后，插入片段的密码子读框与荧光蛋白的密码子读框保持连续。 例如，GFP。可能需要在典型的限制性内切酶连接子中再添加1到2个碱基14；注意不要产生终止密码子。
    3. 使用活体线虫或野生型基因组DNA或cDNA作为模板，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增启动子或全长基因15.
      注意：使用线虫作为模板时，首先将线虫在裂解缓冲液（PCR缓冲液加蛋白酶K）中裂解17混合发育阶段的线虫可用作模板。为避免细菌DNA污染，可使用饥饿处理的线虫。
    4. 对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，以鉴定扩增产物的正确大小。
      注意：如果条带大小正确，则进行下一步。如果产生多条条带，需优化扩增条件以获得单一条带。若仍无法解决，应从凝胶中切下正确大小的条带，并通过标准方法纯化DNA。15 然后进行下一步。
    5. 对PCR产物和含有荧光蛋白的载体质粒进行限制性酶切例如，pPD95.79）在不同试管中通过标准方法进行15.
    6. 通过凝胶电泳分离消化后的DNA，并在不同的离心管中分别回收PCR产物和载体DNA条带。
    7. 通过标准方法从凝胶切片中纯化DNA15使用分光光度计测定DNA浓度。
    8. 采用标准方法将PCR产物与载体DNA连接，并将重组DNA通过标准方法转化至感受态细胞中15.
    9. 铺板 10 μL，50 μL 和 100 μL转化细胞分别接种于三个添加了50的Luria肉汤（LB）平板上 μg/mL 氨苄青霉素
      注意：将不同数量的细胞铺在不同的培养板上，以获得一系列转化效率。例如，若转化效率较高，铺板过密可能不利于单菌落的分离。
    10. 在37℃下孵育培养板 °C 过夜。次日早晨，从培养箱中取出培养板。
      注意：如果菌落非常小，可再孵育数小时。
    11. 通过标准方法从单菌落中制备质粒DNA15将模板DNA与引物混合后送测序（通常在核心服务中心进行）。
    12. 读取序列并验证融合构建体的完整性。
      注意： 关键： 确认插入基因与荧光标记基因之间用于翻译融合的正确密码子阅读框。理想情况下，应对整个基因进行测序，以确认在PCR和连接过程中未引入突变。
    13. 使用步骤 1.1.11 生成更多质粒 DNA，用于步骤 1.2 的显微注射。
  2. 通过DNA显微注射实现生殖系转化以生成转基因动物18
    注意：有关引入转基因的替代技术，请参见讨论部分。所概述的步骤可用于生成携带荧光融合蛋白或任何其他目的蛋白的转基因动物。例如，可将外源蛋白新引入例如，一个异源直系同源物）或内源蛋白可被重新引入（例如，导入相应的生殖系突变体中进行表型拯救）或过表达以产生表型（例如，通过显微注射） erm-1 用于产生过表达囊状管表型，该表型作为后续所述RNAi相互作用筛选的修饰靶标。
    1. 混合构建体DNA（1–50 ng/μL）μL）与标记质粒DNA（通常为100 ng/μL），例如显性标记 rol-6 (su1006) （标记物选项参见1.2.3）
      注意： 关键： 注射DNA的浓度必须通过实验经验确定，以避免在表达对转基因表达特别敏感的排泄管基因时，产生人为表型（如囊肿、延伸缺陷、致死性）。例如，可制备多种浓度为1 ng/μL的质粒混合物μL，10 ng/μL，50 ng/μL，以及100 ng/μL 加入 100 ng/μL rol-6(su1006) 测试一系列浓度，以获得具有理想表达或表型的可存活品系（高浓度可能对管腔形态发生产生非特异性毒性，并可能导致致死）。
    2. 将 DNA 混合物通过 0.22-μm（微米）孔径Spin-X离心管滤器
      注意：不要将管盖打开，以免灰尘进入而堵塞显微注射针。
    3. 通过标准的生殖系转化方法，将重组质粒显微注射到野生型或突变型线虫的生殖腺中（参见参考文献）18 有关实验步骤的详细信息）。
      注：标准标记质粒例如： rol-6(su1006), dpy-20, unc-119, pha-1. 类似显性转基因 rol-6(su1006) 将外源基因导入野生型线虫，而用于挽救表型的转基因则导入相应的突变体中。为便于转基因品系的维持，需共注射标记质粒，因为染色体外的转基因在细胞分裂过程中会随机丢失（见1.2.8）。在注射编码荧光蛋白融合基因时，也可直接使用荧光蛋白GFP本身作为标记。 rol-6 诱导蠕虫绕自身滚动，这通常有利于形态发生表型的评估。
    4. 将注射后的蠕虫转移至 大肠杆菌 接种的线虫生长培养基（NGM）平板（例如，每板5条线虫）（参见参考文献19 用于标准 秀丽隐杆线虫 培养与维持方法 材料表).
    5. 将培养板置于20℃培养，使子代发育 °C下约3天。
    6. 在解剖显微镜下检查F1代子代中的Rol（滚动）蠕虫（或其他任何特定的注射标记）， 例如，GFP）并用挑虫针将滚动子转移到单独的培养板中。
    7. 挑选含有滚动表型F2代动物的平板，在解剖荧光显微镜下确认荧光表达（通常所有滚动表型个体均呈GFP阳性）。
      注：F2 代滚筒表型表明转基因品系成功建立。不同品系之间可能存在差异， 例如，考虑到转基因传递率的问题。因此，建议同时保存和维持多个品系。
    8. 通过筛选标记阳性个体，将转基因品系转移至新的培养板中进行继代培养。
      注意：注射的DNA会作为染色体外阵列整合到生殖系中。染色体外阵列的遗传传递率存在变异，但通常约为50%。因此，为避免丢失品系，必须使用显性标记对手工富集品系至关重要例如，未通过负向筛选固定的品系。
    9. 采用标准冷冻技术将转基因品系在 -80 ℃ 下冷冻保存以实现长期储存 °C19.
      注意：位于染色体外阵列上的转基因还可通过紫外线照射进行额外步骤，将其整合到生殖系中，从而获得均一的品系18例如， erm-1 通过紫外线照射将其整合到生殖系中，以获得 ERM-1[++] 品系 fgIs2[erm-1p::erm-1; rol-6p::rol-6(su1006)] 其中每个动物均携带该转基因，这是将其用于下文所述基于RNAi的相互作用筛选的必要条件。该品系还通过与含有细胞质外排管GFP标记的品系杂交，进一步进行了标记 vha-1p::GFP 转基因（通过与上述相同的方法构建；参见参考文献）20 用于基本的遗传操作（如杂交），并称为 ERM-1[++]; vha-1p::GFP 菌株如下。

2. 构建靶向RNAi文库及设计RNAi相互作用筛选以修饰导管表型

注意：本文描述了一种基于靶向RNA干扰（RNAi）的遗传相互作用筛选方法，利用过表达导致的囊状管腔表型来寻找与排泄管形态发生相关的相互作用基因。ERM-1[++]品系（见步骤1.2.9）作为示例9。该方法仅为排泄管管腔形态发生遗传分析的多种可能方法之一（其他遗传学方法参见引言和讨论部分）。有关RNAi的背景知识、RNAi实验操作细节、RNAi强度的调节（针对常致死的管腔形成相关基因）以及与RNAi相关技术问题的讨论，请参见配套的肠道管腔形成研究论文3及参考文献17,21,22。有关标准线虫培养与保种方法，请参见参考文献19及材料表。

  1. 在数据库和已发表的文章中搜索 ERM-1（或其它目的基因）相互作用分子。
    注意：潜在的 ERM-1 相互作用分子包括在任何物种中已被实验证实与 ERM 蛋白存在功能、遗传或物理相互作用的所有分子，和/或任何方法预测可能与其相互作用的分子 在计算机中，高通量或系统生物学方法（参见 表3 有关数据库和资源的示例）。
  2. 生成所有基因的列表并查找 秀丽隐杆线虫 在需要时使用同源基因。
    注意：可考虑将已鉴定基因列表扩展为基因类别，这能够结合目标基因的功能，并扩大相互作用因子的筛选范围（例如，针对膜-肌动蛋白连接蛋白 ERM-1，选择所有肌动蛋白及肌动蛋白相关分子。
  3. 在商业化的全基因组细菌RNAi文库中，鉴定出所有基因对应的RNAi细菌饲喂克隆例如，Ahringer基因组 秀丽隐杆线虫 RNAi 饲喂文库21; 材料清单)
  4. 为所有基因及其对应的 RNAi 板和孔位编号生成一个电子表格。
  5. 每天挑取并划线约50个RNAi克隆至LB/氨苄青霉素/四环素平板（抗生素的选择取决于文库构建方式），持续操作直至构建完成靶向RNAi文库。
    注意：根据文库规模和预期工作流程，可省略构建完整文库的步骤，直接进行批量分析。平板可在 4℃ 保存 °C，时间不超过约2周（如有需要，可在此之后重新划线接种至新平板）。反之，也可在96孔或384孔板中制备更大规模的复制冷冻文库，于-80℃长期保存 °C.
  6. 在 37 ℃ 下孵育培养皿 °C过夜。次日早晨，从培养箱中取出培养板，于4℃保存 °C.
  7. 用无菌牙签从平板上挑取RNAi细菌，与600 μL LB/氨苄青霉素（50 ng/μL）肉汤中，置于1.5 mL微量离心管内，将各管在37℃孵育 °C，振荡6小时。
    注意：通过将接种针（牙签或微量移液器吸头）沿微量离心管管壁摩擦，将RNAi细菌接种至液体培养基中。
  8. 接种 70 μ将L培养的细菌以每孔分别接种至6孔RNAi板中，每个样本设两个或三个重复孔。将RNAi板在22℃下孵育 °C 过夜。
    注：RNAi 平板通过标准程序制备（材料表 以及参考文献3,17,21）在此采用6孔组织培养板格式，以实现较高通量的实验流程，同时仍可在板内对活体动物的管腔形态发生进行显微观察。
  9. 第二天早上，挑选3只L4期的ERM-1[++]； vha-1p::将表达GFP的蠕虫转移到每个RNAi平板的孔中。
    1. 为避免与OP50细菌污染（参见参考文献）19）会干扰RNAi，因此首先将线虫接种到不含细菌的NGM平板上，让线虫爬行约10分钟。仅使用未饥饿的健康线虫。
  10. 在22℃下孵育培养板 °在20°C下培养3天，以使动物产生后代。
  11. 在解剖荧光显微镜下观察F1代子代的排泄管表型。

3. 在体 成像 秀丽隐杆线虫 荧光解剖显微镜观察排泄管及管状发生表型评分

  1. 准备表型评分表（示例见表4和图5）。
  2. 将含有线虫的琼脂平板直接置于荧光解剖显微镜下，打开平板盖进行观察，使用较低倍率进行对焦。
    注意：本方案描述了使用配备1.5X和10X物镜、变倍范围为3.5至45的显微镜（见材料表）。
  3. 依次聚焦每个孔进行观察，从第1孔开始，逐行向下完成整块平板的评估。
    注意：始终先评估对照组。例如，阴性对照（空载体模拟对照）（不含或含有无关基因插入片段的HT115 RNAi细菌（参见参考文献17,21）），以及适当的阳性对照，例如，在本相互作用筛选中，erm-1 RNAi（可抑制ERM-1[++]表型）和sma-1/spectrin RNAi（可增强ERM-1[++]管腔表型）。
  4. 首先在明场光下检查可观察到的一般表型（例如：Let/致死、Clr/透明、Emb/胚胎致死、Ste/不育、Unc/运动失调、Dpy/矮胖，等），通过统计动物总数及具有该表型的动物数量来量化表型，并记录数据（见表4）。
    注意：对于因基因敲低导致可能影响管腔表型评估的缺陷（例如，Emb、Ste），可考虑采用条件性、胚胎后RNAi重复实验（参见相关论文中的操作步骤3）。
  5. 其次在荧光光下观察排泄管表型，对可量化的表型（例如，管腔长度、管腔宽度、囊泡）进行评分，记录数据并在评分表上描述表型（见表4，图5）。
    注意：评估较细微的管腔表型需要使用更高的放大倍数（变倍范围）。在低倍与高倍之间来回切换，仔细评估管腔的长度、宽度及其他管腔形态发生表型。对于简单表型的定量或半定量分析，应统计100只动物（例如，本靶向RNAi筛选中的L4期幼虫；表型包括：后部管腔延伸长度达1/4、1/2、3/4及完全延伸，后部管腔直径，小囊泡（< 体宽的1/3），大囊泡（> 体宽的1/3）；见表4）。
  6. 使用显微镜配备的数字电荷耦合器件（CCD）相机及相应成像软件，获取至少3个不同个体中主要表型的图像（见材料表）
    1. 获取图像时，首先打开相机电源，启动连接的计算机，双击图像采集软件图标，在低倍镜下手动对准线虫平板的观察区域并对焦，然后打开相机快门。
    2. 点击计算机屏幕上图像采集软件的“实时预览”图标，使线虫在屏幕上可见，手动调节对焦以清晰显示线虫，随后点击“拍摄”图标，再点击“保存”图标。
      注意：线虫在荧光照明下移动更快，因此一手移动平板至目标区域时，另一手应随时准备点击鼠标。一旦目标区域清晰，立即点击“拍摄”图标以获取图像。通常经过数次尝试即可获得理想图像。
    3. 将获取的图像以合适的文件名保存（应包含品系名称、RNAi克隆名称和日期）。
      注意：野生型线虫移动较快，且其管腔细长，成像难度高于突变体。具有囊状管腔和/或其他表型的突变体通常移动缓慢，更易于成像。使用Rol等标记质粒有助于固定动物位置，防止其向前移动，同时当动物自身翻滚时，可能提供更清晰的表型观察视角。

4. 利用激光扫描共聚焦显微镜高分辨率成像 C. elegans 排泄管

  1. 活体动物的制备
    1. 在干净的玻璃载玻片中央，用棉签或食指指尖蘸取少量润滑脂或凡士林，将油脂涂抹开，形成直径约6–8 mm的极薄油环。
    2. 放置 6 μ用微量移液器将5%利多卡因溶液（麻醉剂）加入圆圈中。
      注意：利多卡因储备液可通过将利多卡因粉末溶于水制备。用M9缓冲液稀释至5%19 (材料表）。在分析排泄管时，必须避免使用常见的固定溶液（如叠氮化钠），因为这些溶液会导致囊泡破裂并诱导排泄管表型改变。
    3. 从RNAi培养板中挑选数只线虫，用挑虫针将线虫放入利多卡因溶液中19 加入溶液中。
      注意：最好选择特定发育阶段的动物，以确保厚度均匀，便于平整封片。可预先在解剖荧光显微镜下筛选动物。
    4. 将22 mm × 22 mm盖玻片置于载玻片上，使其轻轻沉降到油脂圈上。
      注意：切勿对盖玻片施加任何物理压力，以免损伤管腔形态，尤其是在具有管腔及其他表型的突变体或经RNAi处理的线虫中。因此，应避免使用过厚的封片油脂圈；理想情况下，应将线虫轻轻夹在载玻片与盖玻片之间。
    5. 在玻璃载玻片的磨砂面上写下样品名称。立即将载玻片送至共聚焦显微镜，用于分析排泄管表型并采集图像。
      注意：延迟可能导致导管囊泡损伤或导管管腔形态改变。
  2. 获取共聚焦图像
    1. 将载玻片置于共聚焦显微镜的样品台上，用低倍镜（10X）聚焦观察线虫。
    2. 在60倍和/或100倍物镜下观察并挑选动物，检查排泄管的细胞及亚细胞表型， 例如，管腔的形状和直径、囊肿的大小和形状；或用于分析的标记亚细胞组分； 例如，顶膜/管腔膜，基底膜，细胞质，内体性与胆小管样囊泡，其他细胞器（参见 讨论, 图2，以及 图4).
    3. 获取目标特定表型的图像。
      注意：本方案描述了激光扫描共聚焦显微镜（材料表）。为了解析这些细长管腔中的亚细胞结构 秀丽隐杆线虫 排泄管，需要使用高倍物镜（60X 至 100X）。可采用转盘共聚焦显微镜采集延时图像，但其共焦性较低（参见 讨论).
      1. 开启共聚焦显微镜时，先打开计算机，双击共聚焦显微镜软件，然后通过点击特定的激光器图标来选择激光。
      2. 单击“扫描”图标以在计算机屏幕上观察聚焦的线虫，通过软件调节激光强度，再次单击“扫描”图标以停止扫描，然后单击“捕获”图标获取图像，最后单击“保存”图标保存图像。
      3. 保存图像时使用适当的文件名，并包含RNAi克隆名称、菌株名称和日期。
        注意：图像可采集为单个或多个层面（例如，沿z轴采集10–15个层面。光学切片可实现三维可视化。根据需要（依显微镜型号而定）获取投影图像并单独保存。为获得最佳分辨率，应使用低增益的激光设置，不要过度打开针孔，并对每幅图像进行多次平均（参见参考文献）。23,24 关于共聚焦成像的一般性讨论，请参见相关文献）。采集图像时应注意亮度低于饱和水平，以便在需要时可通过成像软件进行调整（建议使用未经修改的原始图像）。
      4. 获取双标记或多标记管道的图像（例如 绿色、红色和蓝色以相同方式通过点击多个激光图标来设置，但需使用逐帧扫描以避免通道间的串色（对于共定位研究至关重要）。
        注意：可能需要考虑顺序扫描所需的时间（这也会相应增加光漂白效应），并相应调整扫描仪设置。单次扫描同一载玻片上的动物不得超过30分钟，以避免对管腔形态产生非特异性影响。如需更长时间扫描，应更换新的载玻片。
      5. 获取相应的微分干涉差光学（DIC）/诺马尔斯基图像，特别是在量化与线虫体长和体径相关的排泄管长度和管腔直径时。通过点击“叠加”图标，将荧光图像与诺马尔斯基图像叠加，以显示解剖标志图1D 以及 图4A–D).
    4. 为进行定量分析，使用 ImageJ 软件测量目标标记组分的荧光强度25 (图5C).

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结果

本方案描述了如何使用 秀丽隐杆线虫 排泄管用于在单个细胞中进行细胞外管状结构形成的视觉与分子分析，以及细胞内管腔形态发生的观察。在从中胚胎期到成体的延伸过程中，四条排泄管持续扩展其基底外侧膜和顶端/管腔膜，同时扩展其小管状结构及内体样内膜系统，从而为研究提供了一个独特的模型 体内 分析 从头合成 极化膜生物发生图1）。通过表达特定的荧光融合蛋白（见方案第1部分），可对顶膜、细胞质以及内体与胆小管囊泡等亚细胞结构进行可视化观察，并可在单个转基因动物中通过双标或三标方法将这些结构彼此区分开来。图2）。一种独特的排泄管表型（图3A–B) 通过过表达一种顶膜相关分子（ERM-1）而产生，用于演示如何开展靶向RNAi筛选，以鉴定在顶膜和管腔形成过程中发挥功能的基因；这作为在此模型中对极化膜形成的分子与可视化分析的一个示...

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讨论

C. elegans 具有遗传多样性高、通体透明、体形结构简单以及细胞谱系恒定等特点，是研究形态发生的理想模型。本实验方案描述了如何结合常规的遗传操作与成像技术，利用仅 2 微米粗细的 C. elegans 排泄管，研究单细胞管中极性膜与细胞内腔的生物发生过程。

标记
可通过表达荧光融合蛋白对C. elegans排泄管进行标记，从而实现活体分析（本文所述），也可通过抗体或化学染色进行标记（有关抗体染色方法，参见关于肠道管状结构形成的配套论文3）。表达两种或多种不同的荧光蛋白，或结合使用不同的标记技术，可实现对这些细长管状结构的高分辨率可视化解析（图2）。由排泄管特异性启动子驱动、靶向排泄管的荧光融合蛋白是标记排泄管的首选方法，原因包括：（1）许多排泄管蛋白的表达水平较低；（2）排泄管结构精细，若目标蛋白在排泄管外也有表达，则非特异性染色极易掩盖其真实结构。然而，排泄管对异源蛋白...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

感谢美国堪萨斯大学的 M. Buechner、美国纽约罗切斯特大学医学中心的 K. Nehrke，以及由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室资助的Caenorhabditis遗传中心（P40 OD010440）。本研究工作得到了 NIH GM078653、MGH IS 224570 和 SAA 223809 项目对 V.G. 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
克隆
质粒 pPD95.75Addgene目录号 37464
PCR试剂盒Qiagen目录号 27106
连接试剂盒新英格兰生物实验室货号 E2611L
DNA标记赛默飞世尔科技货号 SM1331
琼脂糖 DNA 级Fisher Scientific目录号 BP164-100
感受态细胞New England BiolabsCat. No. C2987H
TrisFisher Scientific产品编号 BP154-1
EDTASigma货号 ED-1KG
乙酸Fisher Scientific货号 A38S-500
溴化乙锭Fisher Scientific货号 BP1302-10
仪器设备
PCR仪 MJ Research产品编号 PTG-200 
离心Eppendorf 货号 5415C
水浴精准科学 货号 666A3 
凝胶电泳仪Fisher Scientific货号 09-528-165
凝胶电泳电源Fisher Scientific货号 45-000-465
分子成像仪 Gel Doc XR 系统Bio-Rad产品编号 1708195EDU
NanoDrop 分光光度计Thermo Scientific产品编号 ND1000
秀丽隐杆线虫 相关11参见参考文献19 用于标准的 C. elegans 培养与保种操作。
LB培养基与平板22参见参考文献19 用于实验方案。
胰蛋白胨 Acros Organics货号 611845000
酵母提取物BD Biosciences目录号 212750
NaClSigma目录号 S7653
Bacto 琼脂 BD Biosciences目录号 214040
氨苄青霉素Sigma货号 A0116
四环素Fisher Scientific目录号 BP912
M9 培养基22参见参考文献19 用于实验方案。
NaClSigma目录号 S7653
KH2PO4Sigma目录号 P0662
Na2HPO4Sigma目录号 S7907
MgSO₄4Sigma货号 M2773
NGM 平板 22参见参考文献19 用于实验方案。
NaClSigma产品编号 S7653
蛋白胨 BD Biosciences目录号 211677
胰蛋白胨 Acros OrganicsCat. no. 611845000
Bacto 琼脂 BD Biosciences货号 214040
MgSO₄4Sigma目录号 M2773
CaCl2Sigma目录号 C3881
胆固醇 Sigma目录号 C8667
K2HPO4 Sigma目录号 P3786
KH2PO4Sigma目录号 P0662
RNAi 平板33参见参考文献21 用于实验方案。
NaClSigma目录号 S7653
蛋白胨 BD Biosciences目录号 211677
胰蛋白胨 Acros Organics货号 611845000
Bacto 琼脂 BD Biosciences目录号 214040
MgSO₄4Sigma产品编号 M2773
CaCl2Sigma产品编号 C3881
胆固醇 Sigma目录号 C8667
K2HPO4 Sigma货号 P3786
KH2PO4Sigma产品编号 P0662
IPTG US Biological货号 I8500
羧苄西林Fisher Scientific货号 BP2648
NaOHFisher Scientific货号 SS266-1
次氯酸钠Fisher Scientific目录编号 50371500
细菌
OP50 细菌CGC
HT115 细菌CGC
全基因组RNAi文库
Ahringer全基因组RNAi饲喂文库（货号21,58,59)Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi 饲喂文库（参考文献60)Source BioScience
成像相关
利多卡因MP Biomedicals,LLG目录号 193917
材料
真空润滑脂硅酮Beckman目录号 335148
显微镜载玻片 Fisher Scientific目录号 4448
组织培养板，6 孔 康宁公司目录号 08-772-33
设备
SMZ-U 解剖显微镜（Nikon）
SZX12 体视显微镜（Olympus），配备高倍立体荧光附件（Kramer Scientific）、带 Q capture 软件的 CCD 相机和 X-Cite 荧光灯（Photonic Solutions）。
TCS SL 激光扫描共聚焦显微镜（Leica Microsystem）
安装在ECLIPSE Ti-E倒置显微镜（Nikon）上的C2激光扫描共聚焦显微系统

参考文献

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单细胞管状形成GFP融合标记共聚焦显微镜成像荧光解剖显微镜观察转基因动物制备表型评分分析
TheC. elegans排泄管作为细胞内管腔形态发生和单细胞管状结构形成的模型体内单细胞中的极性膜生物发生：GFP融合蛋白标记、RNAi相互作用筛选与成像
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