水平整体封片：一种用于皮肤厚三维组织切片的新型制备与成像方案

摘要

本研究提出了一种用于厚型三维组织切片分析的新型处理与成像方案，可充分挖掘共聚焦成像技术的潜力。该方案能够保持抗原性，是一种分析皮肤组织学结构以及其他潜在组织类型的可靠系统。

摘要

处理感兴趣的组织以获得支持科学论点的显微图像可能具有挑战性。高质量显微图像的获取不仅取决于显微镜本身的性能，更依赖于组织处理的方法，而这些方法通常涉及多个关键步骤。此外，皮肤及其他组织中的间充质细胞类型给组织制备和成像带来了新的难题。本文中，我们介绍了一套完整的流程，从组织取材到显微观察。我们所采用的技术称为“"水平整体封片"，该方法易于掌握，适用于初学者，并可在使用冷冻切片机切割的60–300 µm厚组织切片中实现抗原的有效保存与检测。此类厚度的切片有助于在三维环境中更清晰地展示组织微结构。此外，与传统的冷冻切片或石蜡切片相比，本方案能更好地保存间充质细胞，从而提升免疫染色的图像质量，增强其实验效果与可靠性。我们相信，该技术将有益于所有从事皮肤可视化研究的实验室，并可能适用于其他组织和器官的研究。

引言

显微成像设备的革新推动了复杂且高分辨率成像仪器的发展。然而，在获取完整的三维（3D）组织横截面显微图像时，样本制备面临巨大挑战，并可能成为决定图像质量的关键限制因素。每一个独立的步骤都需要仔细考量，以保持组织形态和目标蛋白的抗原性，尽量减少制备过程中引入的人为假象，并最大限度地提升最终图像质量。例如，皮肤的传统分析需要能够同时观察表皮和真皮结构的图像，并包含方向正确的毛囊，从而实现对干细胞区室在皮肤稳态中贡献的解剖学分析^1,2。这要求对皮肤的包埋和切片方式给予充分关注。重要的是，毛囊的厚度可超过100 µm，远超常规石蜡包埋或冰冻切片的厚度标准，导致其分析质量低于整体封片或厚切片方法^3,4,5。

综上所述，显微分析前的每一步样本制备都是影响图像分析的关键因素。本文介绍了一种用于厚组织三维切片分析的新型处理方案，我们称之为“"水平整体封片"”。该方案能高度保留抗原性，并利用标准共聚焦成像设备充分挖掘皮肤厚切片的分析潜力。本指南全面介绍了皮肤组织用于厚组织横切面处理与成像的完整流程，包括组织取材与多聚甲醛（PFA）辅助的冷冻保存（步骤1）、使用冷冻切片机获取厚度为100 µm的组织横切面（步骤2），以及免疫荧光标记与封片（步骤3和4）。代表性结果对比了两种不同组织学制备技术——传统冷冻切片与厚三维组织横切片——的共聚焦图像，突出了该方案潜在使用者采用“"水平整体封片"”的优势。

方案

所有动物实验均经过当地伦理审批，并根据英国政府内政部许可证的条款进行。

1. 皮肤采集与冷冻保存

1. 准备工作。
   1. 准备一个100毫米培养皿，加入25 mL 4%多聚甲醛（PFA），另准备两个100毫米培养皿，各加入25 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）。
   2. 用最佳切割温度化合物（O.C.T.）填充矩形可剥离冷冻模具，填充至其容积的三分之二。
   3. 将一块可用于后续步骤放置冷冻块的金属板放入-80 °C冰箱中预冷。
2. 皮肤取材、固定与冷冻保存。
   1. 使用干燥的电动剃毛器修剪动物尸体背部区域。
      注：本示例中使用的是出生后第21天的野生型小鼠。
   2. 取下皮肤上感兴趣区域。
      注：小鼠皮肤的背中区（图1a）含有最高比例且排列均匀、方向一致的毛囊，有利于切片时获得最佳取向。去除皮下非真皮组织并非必需，但可根据需要进行。
   3. 将取得的皮肤修剪成适当大小的矩形片，以适配冷冻模具底部，并注意毛囊生长方向。
      注：初学者可采用较小的皮肤切片，因其在孵育和贴附过程中不易缠绕。本例展示的是一块约1 cm²的背部皮肤，可放入22 × 30 × 20 mm的冷冻模具中（图2a）。
   4. 根据皮肤样本厚度，在25 mL 4% PFA中室温固定10–30分钟（图1b）。
   5. 用25 mL PBS洗涤皮肤样本两次，每次至少5分钟（图1b）。
   6. 将皮肤样本在纸巾上轻拍，小心去除组织表面多余的PBS，以免在冷冻过程中产生结晶，影响冰冻切片效果。
      注：本方法无需标准蔗糖梯度处理。但使用者可根据需要自行选择是否加入此步骤。
   7. 注意每块皮肤样本中毛囊的方向。可借助解剖显微镜进行观察辅助（尤其是首次操作本方案者）。将皮肤样本放入盛有O.C.T.的冷冻模具中，并用镊子去除附着在剪短毛发表面的气泡，使皮肤各区域充分浸润于O.C.T.中（图2a和2b）。
   8. 将皮肤推至O.C.T.填充块的底部，使其紧贴模具底部。
      注：皮肤可按任意方向放置，只要记录毛囊走向以便后续正确切片即可。在将冷冻块安装至冰冻切片机进行切片时，模具方向可重新调整。请在冷冻模具上标记毛囊方向，因为此步骤决定了后续冰冻切片的切割取向。
   9. 将冷冻块转移至-80 °C冰箱内的金属板上，以防止组织漂浮或移位。
   10. 监控冷冻过程，确保皮肤始终保持在冷冻模具底部的正确位置，因为未察觉的气泡可能导致皮肤上浮至O.C.T.表面。
       注：含组织的冷冻模具可在-80 °C长期保存超过一年，并可重复用于后续切片。

图1. 小鼠皮肤的取材与固定。
(a) 从小鼠尸体的背中区获取皮肤组织。该区域的毛囊排列均匀且方向一致，因此在切片过程中可实现最佳取向，如箭头所示。(b) 将皮肤剪成适合冷冻包埋盒大小的方形组织块后，用4%多聚甲醛（PFA）固定15分钟，并用PBS洗涤两次，每次5分钟。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 厚组织切片

1. 冷冻切片机上样品的准备与组织定位。
   1. 准备一个100 mm的培养皿，加入15 mL PBS，放置在冷冻切片机附近便于取用的位置。同时准备一个12孔板，每孔加入2.5 mL PBS，并根据样品进行标记，用于在4 °C下长期保存切片。使用镊子操作切片。
   2. 将冷冻切片机的温度调节至-20 °C。
      注意：温度会影响切片效果，但通常以-20 °C作为起始温度较为合适。
   3. 为获得约两个毛囊厚度的切片，将冷冻切片机调整为切割150 µm厚的切片。
      注意：切片厚度可根据用户需求及后续用于分析的显微镜的限制进行调整。
      注意：样品的取向对于获得具有正确方向毛囊的皮肤切片至关重要。这需要将样品正确安装在冷冻切片机的样品块上。确保切片平面与毛囊的方向平行（图2c）。如前所述，皮肤样品中切片平面的正确取向是决定后续成像质量的关键步骤。

图2. 包埋、冷冻保存与切片。
(a) 在冷冻模具上标记毛囊（HF）方向（由黑色箭头指示）对于冷冻切片过程中正确的取向至关重要。(b) 切面必须与毛囊的方向对齐，以获得完整保留毛囊全长的切片。(c) 根据冷冻模具上黑色箭头所示的毛囊方向进行切片。(d) 使用金属镊子收集较厚的组织横截面，并(e) 转移至含有1x PBS的100 mm培养皿中。(f) 在室温下，PBS会溶解包裹在厚组织横截面上的O.C.T.包埋剂（由白色箭头指示），随后切片在PBS中自由漂浮。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 冷冻切片。
   1. 使用冷冻切片机进行切片。用镊子取出含有包埋皮肤组织的O.C.T.材料（图2d）。
      注意：建议使用可在X、Y和Z轴方向独立移动和调节的冷冻切片机，以实现最佳的样本定位，从而获得理想对齐的组织横截面。
   2. 将切下的组织片从冷冻切片机转移至盛有PBS的100 mm培养皿中，并继续切下一刀。不要将样本直接收集在载玻片上（图2e）。
      注意：在室温下，PBS会溶解O.C.T.，从而释放出易于用镊子操作的皮肤切片（图2f）。
      注意：当多个厚度为100 µm的组织切片溶解后，100 mm培养皿中的PBS可能需要更换为新鲜PBS，可根据实际情况进行更换。
   3. 用镊子将漂浮的皮肤切片转移至已正确标记的12孔板中的孔内，每孔加入2.5 mL PBS（图3a，左图）。
      注意：样本可在4 °C条件下保存至少两天。对于切片后含有皮肤的O.C.T.块的长期保存，应在切面处滴加一滴新鲜O.C.T.密封切面。待O.C.T.滴液冻结后，用Parafilm膜包裹O.C.T.块，并放回-80 °C冰箱中保存。

3. 免疫荧光标记。

1. 提前至少 2 小时配制 PB 缓冲液（含 0.5% 脱脂奶粉、0.25% 鱼皮明胶和 0.5% Triton X-100 的 PBS），具体方法如前所述⁵。
   注意：为便于重复使用染色缓冲液并保存抗体，可在 PB 缓冲液中添加叠氮化钠。
2. 标记若干 1.5 mL 微量离心管，每管加入 500 µL PB 缓冲液。使用镊子小心将皮肤切片从 PBS 中转移至分别装有 PB 缓冲液的离心管中进行封闭（图 3a，右侧）。确保所有皮肤切片完全浸没。将微量离心管置于摇床（往复式）上，以每分钟不超过 10 次振荡的速度在室温下孵育 1 小时，该速度不应破坏组织完整性。
   注意：摇床速度不得超过每分钟 10 次振荡，否则会导致组织缠绕。
   1. 虽然可在同一微量离心管中放入多个切片，但为节约抗体，建议每管仅放置一个切片。如需进一步减少抗体用量，可将体积减少至 250 µL。
      注意：如有需要，可用 96 孔板等替代微量离心管。然而，将较厚的组织横切片置于 1.5 mL 微量离心管中，可因液体扰动增强而实现最有效的抗体渗透。
3. 为每一片皮肤切片分别标记新的 1.5 mL 微量离心管，每管加入 500 µL PB 缓冲液及适量的一抗。封闭 1 小时后，将皮肤切片转移至新配制的含一抗的离心管中，在 4 °C 下过夜孵育。
   注意：本示例中使用的一抗包括：浓度为 1:50 的 FITC 标记大鼠抗人 CD49f 抗体，以及浓度为 1:100 的山羊抗小鼠/大鼠整合素 α8 抗体。
4. 次日，为每个样本准备两个分别装有 500 µL PBS 的 1.5 mL 微量离心管，将皮肤切片在室温下清洗两次，每次 1 小时。
5. 准备若干单独的 1.5 mL 微量离心管，每管加入 500 µL PB 缓冲液，并添加适当浓度的相应二抗和 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）。
   注意：本示例中使用的二抗为 Alexa Fluor 488 标记驴抗大鼠 IgG 和 Alexa Fluor 555 标记驴抗山羊 IgG，浓度均为 1:500；DAPI 使用浓度为 1:100。
6. 小心将皮肤样本转移至含有二抗和 DAPI 的 PB 缓冲液中，在旋转仪或摇床上以低速于室温孵育 1 小时。
7. 将切片保存在含二抗和 DAPI 的 PB 缓冲液中，置于 4 °C，可保存长达四天；若在 PBS 中添加叠氮化钠，可能保存更长时间。

图 3. 免疫荧光标记与封片。
(a) 漂浮的组织横切片可在4 °C条件下保存于12孔板中至少两天。在进行免疫荧光（IF）标记前，将感兴趣的组织横切片转移至含有PB缓冲液的1.5 mL微量离心管中用于封闭，如箭头1所示。进行IF标记时，需遵循第3步中详述的多步操作流程。第3步的每一步均需小心地将组织横切片转移至新配制的微量离心管中，管内分别含有初级抗体溶液、次级抗体溶液或洗涤缓冲液，如箭头2所示。(b) 完成IF标记后，在甘油滴中借助解剖显微镜将组织横切片展开并压平。(c) 当组织横切片完全展平于盖玻片底部后，使用普通载玻片进行封片。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 显微观察的封片

1. 成像前，将皮肤切片转移至含有 500 µL PBS 的独立微量离心管中，以洗去二抗和 DAPI。
2. 使用 1,000 µL 移液器，但需剪去枪头前端约 0.5 cm，以便正确吸取高黏度的甘油。在解剖显微镜下（图 3b），将 22 × 50 mm 盖玻片置于深色背景上。
3. 在盖玻片上加入一滴 100% 甘油（图 3b）。将皮肤切片从微量离心管中转移至甘油液滴中。利用解剖显微镜和尖头镊子小心展开卷曲的皮肤切片。
   注意：由于切片漂浮在甘油液滴中，可借助组织自然恢复原有形态的趋势进行理顺。切勿强行将其拉直至非自然状态，以免造成组织损伤。
4. 当皮肤切片全长已正确展开并平整地置于盖玻片上后，将其封固于普通载玻片上。此步骤将进一步使皮肤切片展直。
   注意：避免产生气泡（图 3c）。
5. 在接下来的两天内对甘油封片的皮肤切片进行成像。
   注意：长期储存会负面影响组织状态和成像质量。本示例中，所有图像均使用直立共聚焦显微镜配合 20 倍物镜获取。

结果

为了突出本技术的优势，我们将所建立的厚组织三维切片技术“水平整体封片法”与传统的冷冻切片法进行了比较。传统的冷冻切片按先前所述方法制备⁵。为了在显微图像中清晰显示表皮结构，我们对整合素α-6（Itga6）进行了免疫染色，Itga6是表皮细胞锚定于基底膜的重要组分⁶。同时，我们利用整合素α-8对竖毛肌（APM）进行标记，该肌肉负责毛发竖立（即“鸡皮疙瘩”）⁷。在传统冷冻切片中，大多数通过Itga6标记显示的毛囊并未沿其全长被完整切到，导致每张切片中毛囊多呈不完整状态，而水平整体封片法则能获得更完整的毛囊结构（图4a-4d）。厚组织切片相比传统的10-µm切片可获取更多的Z轴层扫图像，从而实现更完整的三维成像。这一优势在观察与毛囊及上方基底膜相关联的竖毛肌完整性时尤为明显。在传统冷冻切片中，绝大多数竖毛肌结构被分割断裂（图4a-4d）。此外，与冷冻切片贴附于温热载玻片时因冻融效应导致脂肪细胞破坏这一常见人工假象相比，水平整体封片法能更好地保持皮下组织区室的组织完整性（图4a-4b，对比皮下区域）⁸。

图4. 水平整体装片与传统冷冻切片的比较。
(a) 传统方法获得的10 µm厚皮肤冷冻切片和(b) 100 µm厚的三维组织横切面分别用整合素α-6（Itga6）和整合素α-8（Itga8）进行标记，以分别显示表皮区和立毛肌。厚组织横切面的图像是大范围Z轴堆栈的最大投影图。白色框表示被放大的区域，在(c) 传统切片和(d) 水平整体装片中展示。在传统切片和水平整体装片中分别对(e) 完整毛囊和(f) 完整立毛肌进行了定量分析。比例尺为100 µm。数据以均值±均值标准误（SEM）表示。每个生物学重复样本分析一个切片（n=3）。非配对t检验 *P<0.05，***P<0.0005。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在这里，我们介绍“水平整体封片”技术，该技术相较于传统的冰冻切片具有多项优势。其一，该方法可使用常规组织学设备和共聚焦显微镜轻松完成。其二，与标准冷冻切片相比，该技术能更优地保持组织完整性。例如，位于皮下层的脂肪细胞（即， 真皮白色脂肪细胞（DWAT）⁹ 在标准冷冻切片中严重受损，使得富含脂肪组织的研究变得不可能。我们的技术能够对该层中的脂肪细胞进行全面分析，并可适用于其他富含脂肪细胞的组织。此外，该方法有助于在谱系示踪研究中更有效地检测间充质细胞 ^2,10.

标准冷冻切片本质上无法通过共聚焦显微镜揭示组织真实的三维结构。这意味着在皮肤分析中，较厚的切片更具优势，因为毛囊及其亚结构可能跨越的深度会超过经典冷冻切片常用的10 µm标准厚度。我们注意到，其他组织（例如肠道和脑组织）在以三维结构观察时也面临类似的挑战^2,7,11,12,13。有趣的是，已有研究表明我们的技术在肠道某些应用中具有优势¹⁴。我们认为，我们所采用的水平整体封片方案有望应用于任何需要进行三维分析的其他组织。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS			自制
明胶（来自冷水鱼皮）	Sigma	G7765	250ML
甘油	BDH 实验室用品	444482V
O.C.T. 包埋剂	VWR 化学品	361603E
Peel-A-Way 包埋模具	Sigma	E6032-1CS	方形 S-22
脱脂奶粉粉末	Bio Basic Inc.	NB0669
Triton X-100	Sigma	T9284	500ML
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二乳酸盐（DAPI）	Invitrogen	D3571
FITC 标记大鼠抗人 CD49f 抗体	BD Pharmingen	555735
小鼠/大鼠整合素 alpha 8 抗体	R&D Systems	AF4076
Alexa Fluor 488 标记驴抗大鼠 IgG	Life Technologies	A21208
Alexa Fluor 555 标记驴抗山羊 IgG	Life Technologies	A21432
CryoStar NX70	Thermo Fisher Scientific
100 mm 培养皿
一次性手术刀片	Swann-Morton	Ref 0501
尖头金属镊子
1.5 ml 微量离心管	VWR	211-2130
12 孔板	Sigma	CLS3513
解剖显微镜	Nikon
20 µl 和 1000 µl 移液器	Gilson
1000µl XL 带刻度 TipOne 滤芯吸头（无菌）	Star Lab	S1122-1830
20µl 斜面 TipOne 滤芯吸头（无菌）	Star Lab	S1120-1810
摇床振荡器
显微镜载玻片，Menzel Glaeser	Thermo Scientific	631-9483	Superfrost Plus
盖玻片，Menzel Glaeser	Thermo Scientific	MENZBB024060AB	24 × 60 mm
共聚焦显微镜	Nikon