在生物安全 containment 环境中利用胶囊进行病毒样本的负染色

摘要

本方案提供了对病毒样本进行负染色的操作说明，可轻松应用于生物安全二级、三级或四级实验室。方案中包括使用一种创新的处理胶囊，该胶囊可保护透射电子显微镜载网，并在生物 containment 环境中更复杂的操作条件下为使用者提供更便捷的操作体验。

摘要

透射电子显微镜（TEM）可用于以纳米级分辨率观察病毒及其他微生物病原体的超微结构。大多数生物材料不含能够散射电子以形成图像的致密元素，因此需要使用负染法，即利用致密的重金属盐包裹样品周围。为了在透射电子显微镜下观察悬浮状态的病毒，必须将样品加载到覆盖有仅数纳米厚透明支持膜的小网格上。由于这些网格尺寸微小且易碎，操作困难，容易受到气流影响而移动。其表面薄膜极易受损，导致样品难以甚至无法成像。具有感染性的病毒必须在生物安全柜（BSC）中操作，某些病毒还需在生物 containment 实验室环境中处理。在生物安全等级（BSL）-3 和 -4 条件下对病毒进行染色尤为困难，因为这些环境气流更紊乱，且技术人员必须穿戴个人防护装备（PPE），从而降低了操作灵活性。

本研究评估了一种用于生物安全防护环境中病毒负染的新装置。该装置是一种胶囊式结构，可作为专用的移液器吸头使用。将载网装入胶囊后，用户只需将试剂吸入胶囊内，即可将病毒和染液递送至胶囊内的载网上，从而避免了对载网的直接人工操作。尽管该技术最初专为生物安全三级（BSL-3）或四级（BSL-4）防护环境设计，但它也可在任何实验室环境中简化样品制备过程，实现便捷的病毒负染。该方法同样适用于纳米颗粒、大分子及其他类似样品的负染透射电镜（TEM）标本制备。

引言

透射电子显微镜（TEM）是一种有效的工具，可用于观察生物样本的形态和超微结构，这些样本过于微小，无法通过传统的光学显微镜观察^1,2,3,4。TEM 将电子束穿过非常薄的样本，由于电子的波长比光短得多，因此可产生更高分辨率的图像。样本中使电子发生偏转或阻挡电子的区域呈现为暗色，而允许电子通过的区域则呈现为亮色。

由于缺乏电子致密物质，病毒在透射电子显微镜（TEM）下难以观察，因为它们无法有效散射电子。负染色法是最常用的增强对比度以在TEM下观察病毒的方法。最早的负染色技术由Brenner和Horne于1959年提出，其依据是Hall（1955年）和Huxley（1957年）的一项实验，他们发现当生物结构浸入电子致密物质中时，会呈现出反向对比的影像⁵。在过去半个世纪中，负染色技术几乎未发生改变。负染色过程包括将重金属盐溶液短暂地施加到TEM载网上的样品，目的是使致密物质包围病毒颗粒，但不渗入病毒内部⁶。这样可形成深色轮廓，从而揭示颗粒的形态⁵。本研究采用两种负染试剂：醋酸铀酰（UA）和....

方案

1. 在处理病毒样本前于BSL-2环境中的实验准备工作

1. 制备或购买覆有Formvar和碳膜的透射电镜铜网，通常为200-400目。
2. 将包被好的透射电镜铜网插入胶囊中。
   1. 使用放大镜以方便操作。每个胶囊中可插入一个或两个铜网。如需要，可直接购买预装铜网的胶囊，以省去此步骤。
3. 将装有包被铜网的胶囊连同其他耗材和试剂一并转移至生物 containment 环境，用于病毒的负染操作。

2. 使用水性戊二醛和1%四氧化锇蒸气灭活在生物安全条件下进行负染色的胶囊法

1. 在生物安全柜内，用移液器吸取40 µL病毒悬液至其连接的胶囊中。
   注意：移液器在操作完成前始终与胶囊保持连接。病毒制备方法参见我们之前的发表文献¹⁴。
2. 将移液器侧放10分钟，使网格保持水平方向，以促进病毒颗粒在包被网格上的均匀分布。
3. 在生物安全柜内的胶囊中对病毒进行灭活。
   1. 拿起移液器，按压推杆，将病毒溶液排入废液容器中。
   2. 向胶囊中吸取40 µL的2%戊二醛固定液。
      注意：戊二醛为危险化学品，操作时需采取适当防护措施。戊二醛可在普通生物安全柜中短时间使....

结果

包埋法可制备出适用于透射电子显微镜成像的高质量负染样本：

首先，我们评估了使用手动液滴法和胶囊法对扎伊尔埃博拉病毒进行负染色所生成图像的质量。埃博拉病毒与马尔堡病毒同属于丝状病毒科（Filoviridae）。埃博拉病毒直径通常为80至100 nm，长度可超过1,000 nm。处理埃博拉病毒必须在生物安全四级（BSL-4） containment 环境中进行。图2展示了使用手动液滴法和胶囊法进行负染色所获得的图像。图2A（手动液滴法）和图2B（胶囊法）显示埃博拉病毒样本具有清晰的细节，病毒颗粒中心可见核衣壳结构，表面可观察到埃博拉病毒糖蛋白。因此，胶囊法和液滴法均能够产生相似质量的透射电镜（TEM）图像。

讨论

负染色是一种有价值的透射电子显微镜（TEM）技术，用于评估和测定病毒、蛋白质复合物及纳米颗粒的大小。半个多世纪以来，通过手动将载网从试剂转移至负染液中制备液滴样本一直是经典的操作方案。该方法虽然简单，但需要经过培训获得熟练技巧才能成功完成。目前，高质量的负染色技术仍被视为先进技能，在许多透射电镜实验室中备受青睐。与传统的手动液滴法相比，胶囊法具有若干明显优势，尤其是在生物安全防护实验室中。首先，手动液滴法需要大量培训和实践经验才能熟练掌握，而胶囊法操作简便，初级技术人员仅需通过移液即可完成。手动液滴法在生物安全三级（BSL-3）和四级（BSL-4）个人防护装备条件下最大的挑战是使用镊子操作TEM载网时触觉感知和灵活性显著下降。涂覆层脆弱的TEM载网极易被镊子损坏或刺穿，而这种损伤通常直到在透射电镜下观察时才会被发现。胶囊法的第二个优势在于，TEM载网仅在插入胶囊和取出送入电子显微镜时被直接操作。无论是在生物安全防护实验室还是在BSL-2级别的电镜设施中工作，均无需直接接触载网。胶囊法的第三个优势是载网的两面均可附着病毒和染色剂。当样本浓度较低时，这一特点尤为有用；但如果样本浓度过高，则可能导致样本过多，或需在使用前对样本进行稀释。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Formvar/碳膜包被透射电镜载网	SPI	3420C-MB	200目铜网，每包100个
mPrep/g胶囊	EMS	85010-01	盒装
mPrep/f连接器	EMS	85010-11	标准型，每包16个
戊二醛	EMS	16320	50%溶液，电镜级
四氧化锇	EMS	19190	4%水溶液
醋酸铀酰	EMS	22400	粉末
磷钨酸钾	EMS	19500	粉末
滤纸	Whatman	1450-090	50号
透射电子显微镜	JEOL	JEM-1011	TEM