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立体定位图谱引导的激光显微切割技术用于分离受创伤性损伤影响的脑区

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DOI：

10.3791/56134

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2017年9月11日

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Texas Medical Branch

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们描述了使用激光捕获显微切割技术从大鼠脑部不同区域获取特定细胞群体样本，用于基因和微小RNA分析。该技术可用于研究创伤性脑损伤对大鼠脑内特定区域的差异性影响。

摘要

在无法保持特定脑区空间分布的组织解离技术中，分离目标脑区的能力可能受到阻碍。此类技术还可能影响基因表达分析的准确性，因为解离过程本身会改变单个细胞的表达模式。本文介绍一种激光显微切割（LCM）方法，结合改良的尼氏染色（焦油紫染色）方案以及大鼠脑图谱的引导，用于选择性收集受创伤性脑损伤（TBI）影响的特定脑区。LCM技术可获取处于原始解剖位置的脑组织区域，并利用解剖学标志来识别各个特定区域。正因如此，LCM此前已被用于研究TBI中脑区特异性的基因表达。本方案可在同一只动物的不同脑区中，检测TBI诱导的基因及微小RNA表达变化。该方案的基本原理可经修改后应用于多种其他疾病和/或动物模型中基因组表达的研究。

引言

哺乳动物的大脑具有显著的复杂性和异质性，包含数百至数千种不同类型的细胞1。事实上，人类研究表明，在额叶皮层等脑区，白质和灰质在结构与功能上的差异反映为截然不同的转录谱型2。大脑的异质性一直是解读基因表达数据以及脑损伤研究领域的主要障碍。这种不确定性在临床前研究中导致了数百项脑损伤治疗方案的临床试验失败3。

我们采用激光捕获显微切割（LCM）技术研究创伤性脑损伤（TBI）在大鼠脑中引起的基因表达失调4，重点关注海马区，该脑区对学习和记忆至关重要5。通过激光捕获并分析损伤后正在死亡和存活的神经元中的基因表达，有助于我们更深入理解基因表达的随机性在决定TBI后神经元存活结局中的作用6。LCM技术在比较年轻与衰老小鼠7或大鼠8海马神经元受TBI影响的研究中也显示出重要价值。

在近期的研究中，我们考察了大鼠脑部其他受创伤性脑损伤（TBI）不利影响的区域，重点关注与执行功能（即 前额叶皮层9）以及TBI共病相关的区域，这些共病包括抑郁（即 伏隔核10）和昼夜节律紊乱（视交叉上核11）。在先前的研究中，Huusko 和 Pitkanen12 以及 Drexel 等13 利用激光显微切割（LCM）技术研究了丘脑和下丘脑中的基因表达。本研究在这些前期观察的基础上，进一步纳入了另外四个脑区。为了研究TBI后不同脑区特异性的分子变化，必须掌握利用LCM系统识别并获取这些脑区特定细胞类型的实验技术。该系统配备紫外切割激光和红外（IR）激光，可对目标脑区进行精确的显微切割。本文中，我们描述了如何依据大鼠脑图谱14中的立体定位坐标，利用该LCM系统引导，识别并激光捕获四个在实验性液体冲击脑损伤模型4中受到不同程度影响的大鼠脑区。

方案

注意：所有动物实验均经德克萨斯大学医学分部（位于德克萨斯州加尔维斯顿）机构动物护理和使用委员会批准，符合美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（第8版，国家研究委员会）的规定。

1. 组织采集、区域鉴定与切片

  1. 按照Shimamura等4所述方法，对约六周大、体重250 - 300 g的成年雄性Sprague-Dawley大鼠进行实验性液体打击损伤。
  2. 实验性TBI后24小时，将动物置于异氟烷浓度为4%的密闭室中，直至深度麻醉，实施人道安乐死。通过断头确认死亡，取出脑组织，并立即在粉末干冰中速冻。将冷冻脑组织保存于-80 °C冰箱中，待切片时使用。
  3. 在进行任何包含转录分析的激光显微切割（LCM）操作前，需使用去除RNase的清洁剂彻底清洁所有操作表面，以降低污染和RNA降解的风险。
    注：清洁范围应包括染色操作区域、组织切片用的冷冻切片机以及LCM设备周围的区域。
  4. 从储存处取出脑组织，放入预冷至-20 °C的冷冻切片机中，使脑组织在切片机腔室内平衡约10分钟。
  5. 将脑组织腹面朝上放置于冷冻切片机载物台的纱布上。使用洁净且无RNase的剃刀片，切除小脑前方稍远处的后部组织（可保存或丢弃），以及视交叉（och）前方稍远处的前部组织。
  6. 取少量最佳切割温度（OCT）包埋剂，分别加入两个独立的冷冻模具中。将含有额叶联合皮层（FrA）和伏隔核核心（AcbC）的脑组织以腹面朝下方式放入冷冻模具中，并加入足量OCT包埋剂完全覆盖组织。
    1. 对含有海马（Hp）和视交叉上核（SCN）的脑组织重复此步骤。
    2. 在冷冻切片机中使OCT包埋剂完全冻结，约需20分钟。
  7. 待组织和OCT包埋剂完全冻结后，在样品头（mounting head）上挤少量OCT，将含有组织的冷冻模具压附于样品头上。待OCT完全冻结，使含组织的模具牢固固定于样品头。
  8. 将样品头固定于切片装置上并拧紧螺丝。使用调节杠杆调整切片角度，使其与冷冻切片机刀片对齐，确保切片均匀。
  9. 设定切片厚度为30 µm。在切取含FrA和AcbC的组织块时，先开始切片直至大脑皮层清晰可见，然后开始收集切片。
  10. 参照《大鼠脑图谱》12，切片并收集组织切片：将室温下的聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜载玻片轻轻置于切片组织上，持续收集FrA区域切片，直至到达前囟后5.16 mm处的次级运动皮层（M2）。
    1. 通过肉眼观察确认组织与OCT是否完全熔融附着于载玻片上。所有含组织切片的载玻片均应暂存于冷冻切片机中，待染色时使用。
  11. 继续切片，直至前连合（aca）变得可见，并在前囟后1.80 mm处，于明显可见的侧脑室（LV）下方融合为一条完整的连合结构。
  12. 继续收集切片，直至在前囟后0.84 mm处，侧脑室（LV）与前连合（aca）相连。
  13. 完成FrA和AcbC区域的切片后，取下已固定的组织块，更换为含有海马（HP）和视交叉上核（SCN）的组织块。
  14. 切片至前囟后-0.48 mm处，当视交叉（och）变平且第三脑室（3V）清晰可见时停止。
  15. 从此位置开始收集视交叉上核（SCN）切片，直至前囟后-0.72 mm处，即视上交叉（sox）开始出现的位置。
    注：由于SCN区域容易被跳过，可能需要在视交叉（och）区域收集更多组织切片。
  16. 对于海马（HP）的收集，切片至前囟后-3.00 mm处，当颗粒细胞层齿状回（GrDG）的角部清晰可见时停止。
  17. 继续收集切片，直至在前囟后-4.78 mm处，冠状切面上海马CA亚区融合为一整体。此范围可确保在开颅和损伤部位下方的海马组织被完整收集。
    注：根据本实验室先前发表的研究结果，大多数受损细胞均位于此范围内，适用于基因或微小RNA表达分析。

2. 染色方案

  1. 染色前，需在化学通风橱内使用去除RNase的洗涤剂清洗所有器皿及染色区域。此步骤可降低因污染导致RNA降解的风险。
  2. 所有染色试剂和溶液均应使用无核酸酶的水配制。
  3. 取存放于冷冻切片机中的载玻片架，置于通风橱内，让载玻片复温30秒。随后将载玻片依次浸入以下溶液中（均用无核酸酶的水配制）：75% EtOH中1分钟，无核酸酶的水中1分钟，1%焦宁Y染液中1分钟，无核酸酶的水中30秒，无核酸酶的水中30秒，95% EtOH中30秒，100% EtOH中30秒，二甲苯中3分钟，以及再次在二甲苯中3分钟。
  4. 将载玻片架置于通风橱内室温下自然干燥，时间不超过10分钟。也可将载玻片架放入无RNase的真空干燥器中以加快干燥。干燥后应立即进行激光显微切割（LCM）。

3. 基于立体定位图谱引导的LCM系统激光显微切割

  1. 在开始任何用于RNA分析的LCM实验前，使用去除RNase的清洁剂和100%乙醇擦拭样本收集区域及设备周围区域。
  2. 在打开显微镜底座电源之前，先开启红外激光发生单元的电源开关，并等待系统初始化完成，然后从桌面启动软件。
    注意：若不按此顺序操作，软件将无法识别显微镜。
  3. 软件启动并完成初始化步骤后，按下 "当前阶段" 软件中的按钮 "设置面板" 模块化载台将移动至可装载和卸载激光显微切割大帽和载玻片的位置。
  4. 将PEN膜载玻片放入载片夹中（每次最多三片），磨砂边缘朝向右侧。
    注意：若放置于支架时方向错误，软件可能无法正确识别所需的红外或紫外切割区域。
  5. 点击 "膜" 复选框中的 "盖玻片与载玻片操作区" 紧邻相应的切片即，A、B 或 C）。此步骤用于指示该载玻片是否为膜玻璃载玻片。然后点击要首先采集的载玻片。
  6. 为使相机拍摄用于确定组织位置和方向以及帽状结构放置的拼接图像，请选择 "图像" 在工具栏上单击并选择 "获取概述。"
    注意：如果用户熟悉所采集的组织，可使用手动滚轮直接定位，从而省略此步骤 "区域中心" 用于收集。
  7. 将光标置于拼接图像上的目标区域（或无拼接图像时的相对位置），右键单击并选择 "将盖片置于区域中心。" 软件将自动在选定位置放置一个封端。
  8. 选择一个位置。
    注意：为确保红外激光正确对准，并仅捕获软件标记区域，在继续操作前必须完成激光定位。
    1. 移动到盖片中无组织的区域。点击 "i" 在 "显微解剖工具面板" 并选择 "红外定位" 从面板发射一次红外测试光，以评估红外激光的发射位置和光斑大小。
    2. 使用光标右键点击红外光斑中心，然后选择 "定位红外光斑。"
      注意：可通过手动调整红外光束的大小和强度来改变其尺寸和强度 "功率、直径或持续时间" 根据每个光斑尺寸标识或通过移动对话框底部的滑动标尺来调整。可能需要进行多次测试射击，以确保合适的光斑尺寸。每次帽盖位置发生移动或更换载玻片时，都必须重新定位红外激光。
    3. 对于紫外切割，通过选择来定位紫外激光器 "紫外定位" 对话框中的选项卡。
      注意：由于紫外激光器与红外激光器同步移动，每次改变位置后无需重新定位紫外激光器。
  9. 选择 "徒手绘图" 选项在 "选择工具窗格"使用触控笔在触摸屏上沿感兴趣区域的边界描画，确保触控笔笔头与触摸屏始终保持接触。描画时需将起点与终点连接闭合。
    注意：红外斑点将通过软件自动点样，但用户可选择额外点样，以确保在紫外切割后组织能够黏附于帽上。
  10. 在采集 FrA 时，在冠状面位于 Bregma 5.16 mm 处、M2 皮层刚出现之前，对皮层组织进行大体激光显微切割捕获。
    注意：可根据需要修改该步骤，仅收集 FrA 的特定部分或特定细胞类型。
  11. 采集AcbC时，使用激光显微切割技术捕获靠近aca区域的部位。
    AcbC 的核心与壳具有不同的功能，且在生理上彼此独立。因此，应尽可能严格参照脑图谱进行操作。建议采集位置不超过前囟后 0.84 mm，因为这两个亚区在此处已过于紧密相邻。
  12. 为收集海马组织，从Bregma 3.00 mm处开始，利用形态学特征，以完全形成的颗粒下层（GrDG）作为解剖标志，通过激光捕获显微切割技术分离CA1、CA2和CA3海马亚区。
    注意：本研究中，不要收集前囟后 -4.78 mm 以外的脑区，该位置在形态上可辨认为海马亚区融合并向腹侧延伸的部位。选择该区域的原因是大多数受损神经元可直接位于损伤部位下方被发现。6.
  13. 对于SCN的采集，首先在视交叉背侧视觉辨认紧密排列的核团，然后进行采集。
  14. 在采集完上述区域后，将LCM Macro Caps转移至 "质量控制岗位" 检查组织是否完全贴附，通过肉眼观察确认经紫外切割的组织已粘附于膜上。迅速将盖子盖到含有100 µL细胞裂解缓冲液的无RNase 0.5 mL薄壁反应管上。
  15. 涡旋混匀样品以确保充分裂解，并于 -80 °C 保存。至此，激光显微切割（LCM）可暂停，样品可储存至后续基因组分析时使用。6.

结果

图中所示示意图 图1 展示了图谱引导的特定脑区激光显微切割（LCM）的整体工作流程及潜在的下游分析应用。本研究聚焦于与创伤性脑损伤（TBI）病理生理学及共病发展相关的四个脑区：FrA、AcbC、SCN 和 Hp。特定脑区激光显微切割存在的一项局限性在于，解剖位置常因边界定义不清而难以辨识，这一点在图中可见 图2 （A，D，G，J）使用脑图谱指导切片及特定脑区的激光显微切割，可降低目标区域以外脑组织污染样本的可能性。只要在切片过程及尼氏染色后仔细遵循组织解剖标志，激光显微切割技术即可成为获取特定细胞群、细胞核或脑区的高一致性手段15这些研究的长期目标是鉴定出可能作为脑区特异性损伤的替代性、非侵入性生物标志物的基因和微小RNA（microRNAs）。该生物标志物开发流程的第一步是在实验性创伤性脑损伤（TBI）后，对组织特异性转录变化进行表征。随后可将这些数据与损伤引起的循环生物液体中的变化进行关联分析。

为降低RNA降解风险，本文所述实验步骤经过优化，以便在定量实时PCR（RT-qPCR）之前对激光显微切割（LCM）获得的总RNA进行反转录分析。采用基于柱的分离方法，从激光捕获的单个脑区组织中提取总RNA（包括小分子和大分子RNA）。为评估分离后RNA的完整性、质量和数量，将RNA样本在70 °C短暂变性后上样至RNA分析仪进行检测。定性评估指标包括分析18S和28S rRNA条带的峰高(图3)——其可反映整体降解程度，以及使用“RNA完整性数值”（RIN）。若严格采用无RNase操作技术，从LCM样本中提取的RNA通常可获得6–8范围内的RIN值。较低的RIN值提示RNA质量较差，可能降低基因和微小RNA表达分析的准确性；而较高的RIN值则有助于提高RNA分析结果可靠性的置信度。

采用针对特定基因和 microRNA 的引物/探针组合进行 RT-qPCR 检测（图4）。约 1 ng 总 RNA 被逆转录为 cDNA，并在按照制造商说明书进行 qPCR 检测前进行预扩增。本研究评估的与损伤相关的基因包括 BCL2 相关 X，凋亡调节因子（Bax）、B 细胞 CLL/淋巴瘤 2（Bcl-2）、半胱天冬酶 3，凋亡相关半胱氨酸肽酶（Casp3）、脑源性神经营养因子（Bdnf）以及 cAMP 应答元件结合蛋白 1（Creb）。选择 miR-15b 是因为已有研究表明，在实验性创伤性脑损伤（TBI）后，单个神经元发生凋亡时其表达水平会发生改变。此外，miR-15b 具有经实验验证及生物信息学预测的靶基因，这些靶基因具有促存活功能（未发表数据）。通过 ΔΔCt 法计算归一化后的相对表达倍数变化，比较 TBI 动物与未处理对照组中基因和 microRNA 的表达水平，并分别以内参基因（Gapdh）或小 RNA（U6）进行归一化。表达倍数大于 1 表示该基因或 microRNA 整体上调，反之，表达倍数小于 1 则表示下调。统计分析显示，TBI 组与未处理对照组之间的基因表达存在显著差异（p ≤ 0.05），且这种差异具有脑区依赖性。在 TBI 组与未处理对照组之间未检测到 miR-15b 表达的显著变化，但在不同脑区呈现出表达升高或降低的趋势。这些结果提示，进一步优化实验条件对于准确评估 microRNA 表达变化是必要的。此外，样本量可能过小而难以达到统计学显著性，部分原因在于基因表达本身存在固有的变异性。未来的研究将纳入假手术动物，以确保观察到的基因和 microRNA 表达变化确实归因于 TBI，而非手术操作本身所致。

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图1. 用于下游基因组分析的图谱引导显微切割工作流程。 (A-F) 从动物准备到下游qPCR分析的操作步骤：(A) 成年雄性Sprague Dawley大鼠（约6周龄，体重300 g）经麻醉后接受液体脉冲致伤性创伤性脑损伤（TBI），并在损伤后24小时实施人道安乐死。(B) 根据Paxinos和Watson《大鼠脑图谱》中特定脑区（FrA、AcbC、Hp、SCN）的坐标，制备新鲜冷冻脑组织的连续切片（30 µm）。(C) 切片经固定、尼氏染色（1%焦油紫）、脱水和空气干燥处理。(D) 使用激光显微切割系统对已识别的脑区进行显微切割。(E) 将激光显微切割获得的Macro Caps转移至无RNase的0.5 mL离心管中，加入100 μL细胞裂解缓冲液，于-80 ºC保存，直至进行RNA提取以开展下游基因组分析。提取的RNA可进一步逆转录，用于基因或微小RNA的RT-qPCR分析，以检测TBI后及/或不同目标脑区之间分子靶点的差异表达情况(F)。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2. 创伤性脑损伤受影响脑区的激光显微切割。 使用激光显微切割系统（LCM）的红外（IR）和紫外（UV）激光功能，从损伤部位同侧采集组织切片的代表性图像 (A-I)。组织在恒冷箱中切片（30 µm），并收集到PEN膜载玻片上。随后对切片进行固定，用1%焦油紫进行尼氏染色，并脱水处理，以根据Paxinos和Watson《大鼠脑图谱》中的解剖标志识别特定脑区。(A-C) 前额叶联合皮层（FrA）区域；(D-F) 海马（Hp）CA1、CA2和CA3锥体细胞层的组成部分，位于齿状回颗粒层（GrDG）完全成形的角状结构旁；(G-I) 位于前连合（aca）近端且靠前部的伏隔核核心区域（AcbC）；(J-K) 位于视上交叉（och）前方的视交叉上核（SCN）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3. RNA质量的代表性扫描结果。 来自激光显微切割（LCM）获取组织的RNA的代表性电泳图谱及其对应的凝胶图像 (A-D)。电泳图谱及对应的凝胶图像显示完整的RNA，依据为18S和28S rRNA峰及凝胶条带的存在。该RNA适用于所有下游应用，包括基因组学和蛋白质组学分析。(A) 额叶联合皮层（FrA）RNA。RIN值为6.1。(B) 海马（Hp）RNA。RIN值为4.4。(C) 伏隔核核心（AcbC）RNA。RIN值为7.3。(D) 视交叉上核（SCN）RNA。RIN值为7.6。请点击此处查看此图的放大版本。

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图4. 脑区特异性基因与微小RNA表达的下游分析 通过 RT-qPCR 目的基因的个体RT-qPCR（Bax，Bcl-2，Bdnf，Casp3，Creb) 并在创伤性脑损伤（TBI）后通过激光捕获显微切割获取的脑区（海马体和伏隔核核心部 n=5，前额叶皮层 n=4）中检测目标微小RNA（miR-15b），并与未受伤的正常动物（n=4）进行比较。对与TBI发病机制相关基因的分析在海马体、伏隔核核心部和额叶皮层中进行。数据以相对于正常对照组脑区的标准化倍数变化比值表示（采用Welch校正的非配对t检验） ± 扫描电子显微镜；* p ≤ 0.05) （A）不同脑区中miR-15b的差异表达以相对于未处理对照组的标准化倍数变化表示（± 扫描电子显微镜（SEM） （B）SCN 数据（n=2）未包含在内。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

在哺乳动物脑组织的分子研究中，激光显微切割（LCM）已成为一项关键技术。本文表明，利用LCM系统中红外（IR）与紫外（UV）切割激光的结合，可捕获哺乳动物脑内任意区域的基因组变化。这些区域包括可使用常规LCM兼容性染色方法（如焦油紫或苏木精-伊红染色）识别的区域。激光捕获过程速度快，并且能够在聚萘膜（PEN膜）载玻片上对较厚的30 µm切片进行LCM操作，这不仅有助于获得足够数量的细胞样本，还能从LCM样本中分离出适用于各类下游基因组分析的高质量RNA；这些分析包括微阵列16、PCR阵列17和定量实时PCR18。

我们的数据为利用激光显微切割组织的研究提供了理论依据。我们发现，miR-15b 在海马和皮层中表达上调。图4) 但在伏隔核中表达下调，这可能对理解创伤性脑损伤在脑内不同区域的效应具有生物学意义。先前一项研究表明，皮层神经元对损伤的易感性增加是由于多种miRNA的过表达所致，这些miRNA可负向调控促存活基因（如Bcl-2）的表达19靶向扫描分析显示，Bcl-2 也受 miR-15b 调控；因此，我们的数据为脑内特定区域的这一现象提供了潜在的机制性解释 即，FCx）可能对创伤性脑损伤（TBI）具有选择性易损性。需要谨记的是，大多数基因受多种miRNA调控，因此将任一特定miRNA的变化与某个具体靶基因相关联十分困难。此外，这些数据表明，某些基因和微小RNA（microRNA）表达的改变可能作为脑区特异性损伤的生物标志物。事实上，我们目前正在利用这些数据，研究具有抗抑郁特性的新型神经保护药物化合物如何差异性地影响与神经精神疾病相关脑区的基因和微小RNA表达。本研究的一个局限性在于，激光显微切割（LCM）载玻片制备过程中的多个步骤可能导致RNA完整性受损。本方案描述了降低RNA降解风险所必需的操作步骤。另一局限性是用于统计分析的样本量相对较小。在后续研究中，增加样本量将有助于减轻个体动物间基因和miRNA表达变异所带来的影响。

激光显微切割（LCM）的优势在利用人类疾病动物模型和病变组织进行的转化基因组学研究中得以体现20,21,22,23。若无法捕获特定的细胞群体，则不同脑区的转录谱将混杂多种细胞类型，难以解析且无法识别。在脑损伤研究中应用LCM技术，已推动当前对脑区特异性生物标志物的界定工作，并有助于理解这些标志物与循环中的创伤性脑损伤（TBI）生物标志物之间的相关性。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Elizabeth Sumner在编辑本手稿过程中提供的帮助。本项目部分资金由Moody转化性创伤性脑损伤研究项目及HLH获得的RO1NS052532基金提供支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Arcturus 激光捕获显微切割系统Applied Biosystems (Life Technologies)
Agilent 2100 生物分析仪Agilent TechnologiesG2939AA
Agilent 6000 Pico 试剂盒Agilent Technologies5067-1513
Arcturus PEN 膜玻片 Applied Biosystems (Life Technologies)LCM0522
Capsure 激光显微切割帽Applied Biosystems (Life Technologies)LCM0211/LCM0214
醋酸克里西蓝Sigma-AldrichC5042-10G
二甲苯（组织学级）Fisher ScientificX3P-1GAL
乙醇 200 证明（组织学级）UTMB 药房
RNAqueous Micro- 试剂盒Life Technologies (Ambion)AM1931
Taqman 基因表达引物/探针Applied Biosystems (Life Technologies)4331182
Taqman microRNA 表达引物/探针Applied Biosystems (Life Technologies)A25576
Lightcycler 96 系统Roche

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RNA RNA

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