植物启动子分析：菜豆根瘤特异性启动子的鉴定与表征

摘要

启动子表达分析对于深入理解基因调控机制以及目标基因在时空上的表达模式至关重要。本文介绍了一种用于鉴定、分离和克隆植物启动子的实验方案，并进一步描述了在菜豆毛状根中对根瘤特异性启动子的表征方法。

摘要

基因编码序列的上游序列被称为启动子序列。研究启动子的表达模式对于理解基因调控以及目标基因的时空表达模式具有重要意义。另一方面，建立快速、高效且可重复的启动子评估工具和遗传转化技术也至关重要。在本研究中，我们分析了根瘤菌共生特异性结瘤起始基因（NIN）启动子在转基因毛状根中的时空表达模式，该启动子来源于菜豆（Phaseolus vulgaris）。利用植物基因组数据库和分析工具，我们鉴定、分离并克隆了P. vulgaris NIN启动子，并将其与嵌合报告基因β-葡萄糖醛酸酶（GUS）GUS增强型::GFP进行转录融合。此外，本实验方案描述了一种利用根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）诱导产生毛状根，实现P. vulgaris快速且多功能遗传转化的系统。该系统在转化后10至12天内可产生长度≥2 cm的毛状根。随后，我们在接种根瘤菌（Rhizobium）后的不同时间点，评估了NIN启动子在毛状根中的时空表达情况。GUS活性结果显示，NIN启动子在结瘤过程中具有活性。综上所述，本实验方案展示了如何在菜豆毛状根中鉴定、分离、克隆并表征植物启动子。此外，该方案适用于非专业实验室，操作简便。

引言

启动子是重要的分子生物学工具，在理解目的基因表达调控中发挥着关键作用。启动子是位于基因序列翻译起始密码子上游的DNA序列，携带基因的核心调控信息；因此，对其准确注释和表征对于理解基因功能至关重要。根据表达模式的不同，植物启动子可分为组成型启动子、组织特异性启动子、发育阶段特异性启动子和诱导型启动子¹。转录组学技术的进步、计算机建模方法的改进，以及多种植物物种基因组序列数据的日益丰富，促进了启动子序列的大规模预测²。

另一方面，建立快速、高效且可重复的启动子评估工具和遗传转化技术也至关重要。与其他模式植物不同，普通菜豆（P. vulgaris）基因的功能表征主要受限于Phaseolus属植物在稳定遗传转化方面的顽拗性。瞬时转化系统可作为快速进行基因功能研究的替代方法³。在豆科植物共生研究中，豆科宿主植物与根瘤菌之间的相互作用是进行根瘤特异性基因功能分析和启动子研究中最易操作的模型系统之一。迄今为止，已有多个与这些共生过程相关的豆科植物启动子被鉴定，例如Medicago truncatula PT4⁴、SWEET11⁵、Lotus japonicus Cyclops、UBQ⁶、VAG1⁷、Glycine max PT5⁸、Exo70J⁹、P. vulgaris RbohB^10,11,12、TRE1¹³、PI3K¹⁴、TOR¹⁵等。cis元件直接影响基因的调控。转录因子ENBP1A可结合到早期结节素基因VfENOD12的cis调控区（−692 bp），从而促进报告基因在蚕豆（Vicia faba）根瘤原基中的表达¹⁶。将根瘤特异性启动子豆血红蛋白GLB3的cis调控区（−161至−48 bp）替换为异源截短启动子δ-p35S和δ-pNOS后，导致其根瘤特异性丧失且启动子活性降低¹⁷。

先前的研究表明，转录因子 NIN 对于根毛细胞中根瘤菌侵染的启动以及 L. japonicus¹⁸ 的根瘤器官发生均是必需的。在本研究中，我们描述了一种用于鉴定、分离、克隆和表征菜豆毛状根中根瘤特异性启动子的实验方案。为此，我们选取了 P. vulgaris 中一种根瘤菌共生特异性的 NIN 启动子，并将其克隆至与嵌合报告基因 GUS 增强型::GFP 构成的转录融合载体中。此外，本方案还介绍了一种利用 A. rhizogenes 诱导毛状根实现 P. vulgaris 遗传转化的快速且多功能的系统。该系统在转化后不到两周内即可产生毛状根。最后，我们通过 GUS 染色检测了 NIN 启动子在根瘤菌定植的根瘤中的时空表达模式。

此处描述的方法不仅可能对豆科植物结瘤和菌根共生的研究有用¹¹，还可用于研究根部启动子的表达模式¹⁹。此外，该方案易于在非专业实验室中应用。

方案

1. P. Vulgaris NIN 启动子的鉴定、分离与克隆

1. 确定目标基因的启动子序列。目前有多种适用于植物的基因组数据库和分析工具，例如 Phytozome、Ensembl Plants、NCBI。 等等。 一种豆科植物启动子 P. vulgaris 本研究中使用了NIN（PvNIN；Phvul.009G115800）²⁰.
2. 根据所使用的载体系统，设计用于Gateway或传统限制性内切酶克隆的寡核苷酸图1A).
   注意：标准（25–35 bp）脱盐引物即可满足要求。建议使用位于启动子与基因之间的反向寡核苷酸序列。
3. 扩增新鲜分离的 PvNIN 启动子区域（或目的基因的启动子区域） P. vulgaris 使用特异性启动子引物组从基因组DNA进行扩增。采用高保真聚合酶，PCR反应条件如下：95 °C 预变性5 min；30个循环（95 °C 变性30 s，55 °C 退火30 s，72 °C 延伸1 min）；最后72 °C 延伸5 min。
4. 在7 x 10 cm的凝胶板上用1%琼脂糖凝胶于60 V电压下电泳分离扩增产物，并回收相应条带的扩增子（700 bp， 图1B）并根据制造商说明将其克隆至pENTR/D-TOPO载体中。
5. 将2 µL反应产物转入感受态细胞 大肠杆菌 根据制造商说明书制备细胞，并将150 µL转化混合物接种于添加50 mg/L卡那霉素（Kan50）的LB（Lysogeny Broth）培养基平板上。将接种后的细胞于37 °C培养过夜。
6. 挑取3-6个菌落，接种于含卡那霉素50 μg/mL的LB培养基中过夜培养。采用选定的方法提取质粒DNA，并使用载体特异性的M13引物通过PCR分析质粒。PCR反应体系包含：100 ng质粒DNA、0.3 pmol引物、10× PCR缓冲液、0.5 U Taq DNA聚合酶和10 mM dNTPs。
7. 使用以下PCR扩增条件：95 °C 预变性3 min；30个循环（95 °C 变性30 s，58 °C 退火30 s，72 °C 延伸75 s）；最后72 °C 延伸7 min。将PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。应确认正确插入的样品在1,024 bp处出现条带，而无插入片段的载体则在324 bp处出现条带。图1C).
8. 在入门载体（pENTR/D-TOPO-PvNIN）与目的载体pBGWFS7.0之间进行LR反应²¹ 按照制造商说明使用商用酶混合物。
9. 将2 µL的LR反应产物转化至感受态细胞中 E. coli 使用标准技术按照制造商说明书进行细胞转化，并将150 µL转化混合物涂布于添加了100 mg/L壮观霉素（Spe100）的LB培养基平板上。将涂布的细胞在37 °C下培养过夜。
10. 挑取约5个菌落，于含Spe100的LB培养基中过夜培养。选用适宜方法提取质粒DNA，并利用启动子特异性引物通过PCR分析质粒。
11. 使用步骤1.3中的PCR条件。在1%琼脂糖凝胶上检测PCR产物以确认扩增，扩增片段为700 bp。
12. 测序阳性质粒 pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (图1D使用特异性启动子引物验证插入片段的真实性。
13. 将质粒转化至 A. rhizogenes 菌株 K599（然而，也可使用其他任何菌株的 A. rhizogenes 可使用）。将2 µL质粒样品加入50 µL电转感受态细胞中，用1 mm比色皿在以下参数下进行电转化：1.8 kV、25 µF、200 Ω。
14. 在约 500 µL SOC 培养基中重悬细胞，于 28 °C 振荡培养 2 小时。涂布于 LB-Spe100 平板，于 28 °C 培养 2 天。
15. 按照步骤1.7所述进行菌落筛选，并采用步骤1.3中的PCR反应条件。从阳性克隆中制备甘油菌种，于-80 °C保存。
16. 使用 A. rhizogenes 携带空pBGWFS7.0载体的培养物作为阴性对照。

2. 菜豆的根癌农杆菌（A. rhizogenes）转化毛状根

1. 将约20粒菜豆（P. vulgaris cv. Negro Jamapa）种子在50 mL 96%乙醇中灭菌1分钟，弃去乙醇；然后加入50 mL 20%次氯酸钠溶液（漂白剂），在超净工作台中持续振荡处理10分钟，随后去除漂白剂，并用过量无菌水清洗3次。
   注意：其他P. vulgaris品种也可用于毛状根诱导。
2. 将灭菌后的种子置于经Broughton & Dilworth（B&D）溶液²²（表1）润湿的无菌滤纸上，在28 °C黑暗条件下萌发2天。
3. 转化前一天准备以下材料：
   1. 取150 µL携带双元载体的A. rhizogenes菌液（按步骤1.13和1.14制备），划线接种于含链霉素100 mg/L的固体LB培养基平板上，28 °C过夜培养。
   2. 取一支15 mL离心管加入B&D溶液，将螺口盖替换为双层铝箔封口。将此离心管插入含有10 mL B&D溶液的22 cm玻璃管中（图2C），并进行高压灭菌。
4. 转化当天，在超净工作台中准备好以下无菌材料：步骤2.2中已萌发的种子、步骤2.3.1的培养平板、步骤2.3.2的试管、无菌双蒸水（10 mL）、移液器及吸头、无菌镊子和3 mL注射器。
5. 使用弯曲的200 µL吸头从平板上刮取A. rhizogenes菌体至微量离心管中，用1 mL无菌双蒸水重悬。同样方法单独制备空载体对照菌液。
   1. 轻轻混匀使菌体重悬，切勿涡旋振荡。
6. 用无菌吸头在步骤2.3.2中试管的铝箔上打一个直径3 mm的小孔。
7. 用注射器吸取步骤2.5中制备的菌液（启动子组或空载体对照组），用针尖轻微刺破已萌发种子的下胚轴（图2G）。
   注意：确保针头刺入下胚轴维管组织4–6次，并在不同位置的伤口处注入少量（约5 µL）菌液。
8. 小心将注射后的幼苗根部插入含B&D溶液的15 mL离心管的3 mm孔中，将整个装置放回22 mL玻璃管内，并密封以保持湿度。
9. 将试管置于培养室中，28 °C条件下培养，光照周期为16小时光照：8小时黑暗。
   注意：培养3–4天后，植株生长至22 mL玻璃管口边缘。此时应取下管盖，并用封口膜围绕茎部密封管口，如图2I所示。
10. 转化后5–7天观察伤口处愈伤组织形成情况，10–12天可见长约2 cm的毛状根。
    注意：需始终保持塑料管和玻璃管中的B&D溶液充足。
11. 两周后，剪除毛状根下方约2 cm处的主根，将幼苗移栽至装有无菌蛭石的花盆中。将植株继续培养于生长室（28 °C，16小时光照：8小时黑暗），并定期用B&D溶液浇灌。

3. 启动子分析：菜豆根瘤菌根瘤中NIN启动子的表达

1. 为诱导根瘤形成，将与菜豆相容的 Rhizobium tropici 或 Rhizobium etli 接种于 100 mL PY 培养基（含 0.5 g 胰蛋白胨、0.3 g 酵母提取物）中，并添加 700 mM CaCl₂ 和 20 mg mL⁻¹ 萘啶酸。在 30 °C、300 rpm 振荡条件下培养 24 小时。
   注意：若使用转基因 Rhizobium，可根据需要选用其他特定抗生素。
2. 在室温下以 2,800 × g 离心 3 分钟收集菌体，用 10 mL 10 mM MgSO₄ 重悬菌体。用 10 mM MgSO₄ 稀释调节菌液在 OD₆₀₀ 处的光密度至 0.6。
3. 每株植物（包括启动子和载体对照）接种 1–2 mL 培养物（来自步骤 3.2），以诱导毛状根上形成根瘤。使用低氮 B&D 溶液（含 2 mM KNO₃）浇灌植物，以促进结瘤。
4. 根据实验需求，在不同时间点采集毛状根。接种后 3–5 天（dpi）采集样品用于观察侵染线。
   注意：原基期根瘤和幼嫩根瘤可分别在接种后 6–9 天和 10–12 天进行研究；成熟且具有功能的根瘤可在接种后 14–21 天进行研究，衰老根瘤则在 > 28 dpi 时研究。
5. 对根/根瘤进行报告基因（GUS 或 GFP）活性检测。按照 Jefferson²³ 描述的方案分析 GUS 活性。在荧光显微镜下观察 GFP 信号，使用蓝色氩离子激光（488 nm）激发 GFP 荧光，并收集 510 至 540 nm 的发射荧光。

结果

本研究的目的是评估结节特异性P. vulgaris NIN的时空表达模式。为此，选取了NIN基因翻译起始密码子上游700 bp的区域，并设计了一组引物，如图1A所示。使用高保真DNA聚合酶扩增NIN启动子片段，经分离纯化（图1B）后，通过Gateway克隆技术将其插入到双元载体pBGWFS7.0中（图1C），构建形成与嵌合报告基因GUS增强型GFP（GUS-enhanced GFP）的转录融合载体（pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP）。pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP载体构建通常可获得数百个独立克隆。利用基因特异性引物进行菌落PCR筛选，可快速鉴定出正确克隆（图2D）。随后使用启动子特异性引物对PCR阳性质粒进行Sanger测序，以验证插入片段的真实性。

讨论

在基因功能分析过程中，基因表达模式的研究对于理解基因的空间和时间调控具有重要作用 体内研究基因表达模式的常用方法是将目标基因的启动子区域克隆至报告基因（如荧光标记基因 GFP、RFP）的上游。 等。) 或 β-葡萄糖醛酸酶。本文中，我们选择根瘤共生（RNS）特异性基因 NIN 的启动子区域，以研究其在时空表达模式中的表现 P. vulgaris 在RNS期间，已通过Gateway方法将选定的启动子序列克隆至GFP::GUS报告基因的上游，插入启动子表达载体中。

我们已描述了共生特异性启动子在毛根系统中的表达 P. vulgaris 毛状根系统已广泛用于难转化作物中基因的功能鉴定，包括RNAi介导的基因敲低、基因的异位组成型表达、启动子活性分析以及蛋白质定位研究。该系统的主要优势在于操作简便、可重复性强、结果可靠，同时不需耗费大量人力。毛状根系统已在其他豆科作物中成功应用，例如 G. max²⁴, M. truncatula

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>qRT-PCR检测引物
pNIN 正向引物	CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT
pNIN 反向	CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C
M13正向引物	GTA AAA CGA CGG CCA G
M13 反向引物	CAG GAA ACA GCT ATG AC
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>试剂
pENTR/D-TOPO 克隆试剂盒	Invitrogen	K243520
Gateway LR Clonase II 酶混合物	Invitrogen	11791100
pBGWFS7.0	植物系统生物学	https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/
Platinum Taq DNA 聚合酶	赛默飞世尔科技	10966018
DNeasy 植物迷你试剂盒	Qiagen	69104
PureLink Quick Gel Extraction Kit	赛默飞世尔科技	K210012
Platinum Pfx DNA 聚合酶	Invitrogen	11708013
认证分子生物学琼脂糖	伯乐（Bio-Rad）	1613102
One Shot TOP10 化学感受态 E. coli	Invitrogen	C404006
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
胰蛋白胨	Sigma-Aldrich	T7293-250G
酵母提取物	Sigma-Aldrich	Y1625-250G
细菌学琼脂	Sigma-Aldrich	A5306-1KG
硫酸卡那霉素	Sigma-Aldrich	60615-25G
硫酸壮观霉素	Sigma-Aldrich	PHR1441
乙醇	Sigma-Aldrich	E7023
细菌学蛋白胨	Sigma-Aldrich	P0556
氯化钙	Sigma-Aldrich	C1016
萘啶酸	Sigma-Aldrich	N8878
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M7506
上样缓冲液	Sigma-Aldrich	G7654
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>设备
PCR仪	Veriti 梯度PCR仪	4375786
离心	Sigma	Sigma 1-14K
凝胶成像系统	Carestream	Gel Logic 212 PRO
MaxQ SHKE6000 6000 型振荡培养箱 - 115VAC	赛默飞世尔科技	EW-51708-70
植物生长培养箱	MRC	PGI-550RH
水平层流洁净工作台	Lumistell	LH-120
荧光显微镜	Leica	DM4500 B
培养皿	sym 实验室	90X15
手术刀刀片	Fisher Scientific	53223
Falcon 15 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	14-959-53A
22 mL 玻璃试管	托马斯科学	45048-16150