本实验方案旨在通过评估空间记忆障碍、神经元病理学改变、神经元内淀粉样β蛋白（Aβ）沉积以及神经纤维缠结的聚集情况，建立一种模拟大鼠阿尔茨海默病的模型。该模型通过联合注射Aβ25-35、三氯化铝及重组人转化生长因子-β1诱导而成。
方法文章
通过脑室内注射复合β-淀粉样蛋白建立大鼠阿尔茨海默病动物模型的有效模拟方法 关键词：阿尔茨海默病，动物模型，大鼠，脑室内注射，β-淀粉样蛋白，Aβ，神经退行性疾病，认知功能障碍，病理模拟
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本文内容
摘要
摘要
阿尔茨海默病（AD）是一种不可逆的进行性脑部疾病，会逐渐破坏记忆，并伴随神经元丢失和脑结构改变。随着全球AD患者人数的增加，该疾病的病理机制和治疗已成为国际制药行业的研究重点。因此，在实验室中建立模拟AD的动物模型具有重要意义。
本文详细描述了一种通过向大鼠脑室内注射β-淀粉样蛋白25-35（Aβ25-35）联合三氯化铝（AlCl3），并同时向丘脑前背核注射重组人转化生长因子-β1（RHTGF-β1），建立阿尔茨海默病（AD）大鼠动物模型的模拟方法。检测了与AD相关的多种标志物，包括：空间记忆能力、神经元结构与亚结构、神经元内Aβ沉积以及神经纤维缠结（NFT）的形成。该大鼠模型表现出空间记忆障碍、神经元结构与亚结构的病理改变、神经元内Aβ负荷增加以及NFT的聚集，能够较好地模拟临床AD患者神经元结构与功能的紊乱状态。因此，该AD大鼠模型为研究神经元功能、神经病理机制以及AD药物筛选提供了一种有价值的体内研究工具。
引言
众所周知，阿尔茨海默病（AD）是一种慢性进行性神经退行性疾病，以渐进性记忆丧失为主要临床综合征。在一般病理表现中，存在神经组织萎缩、神经元和突触丢失，以及神经元亚细胞结构与功能障碍，这些均参与了AD的发生与发展1,2。据报道，当动物脑室内注射Aβ后，脑内会发生一系列神经毒性事件，包括神经元丢失、钙稳态失衡、神经元凋亡以及活性氧的过度产生3。然而，AD的发病机制涉及多种因素，因此建立更理想的AD模型至关重要。
本文详细描述了一种建立 体内 通过脑室内注射Aβ25-35和AlCl3模拟AD模型3，同时向大鼠前背侧丘脑核注射 RHTGF-β1。该大鼠模型高度模拟人类阿尔茨海默病（AD）的神经功能及组织病理发生过程，包括记忆障碍、神经元丢失和结构损伤、细胞凋亡、细胞内 Aβ 负荷以及 NFT 聚集4,5,6,7,8,9. AlCl₃3 抑制沉积的Aβ形成可溶性Aβ，而RHTGF-β1可促进沉积Aβ的产生并加速AD的发生10这种来自多种因素对神经元的攻击符合阿尔茨海默病的多因素发病机制。
整个实验持续了86天： 图1 展示了实验设计的时间线，包括动物手术、动物模型筛选、动物空间记忆测试和样本制备的时间节点。手术第1天，将RHTGF-β1微量注射至丘脑前背内侧核；手术第2天，注射Aβ25-35和AlCl3 每天分别在上午对大鼠侧脑室进行显微注射，连续注射14天，下午连续注射5天。所有大鼠在手术后恢复45天。采用Morris水迷宫筛选存在记忆障碍的成功建模大鼠，并评估大鼠的空间记忆能力。大鼠接受连续4天的水迷宫训练，每天2次；在第4天训练期间，通过Morris水迷宫表现评估大鼠的记忆障碍情况。在动物模型筛选后，所有大鼠继续饲养37天。术后第79至85天连续7天，利用Morris水迷宫检测大鼠的空间记忆能力。所有大鼠于第86天经断头处死，用于脑组织样本制备。
图1．实验设计的时间线。请点击此处查看该图的放大版本。
方案
本实验程序遵循中国国家科学技术委员会于1988年10月31日发布的《实验动物管理条例》11。科研人员应遵守其所属机构及国家动物管理机构制定并批准的指导原则。
注意：实验动物与试剂：本实验所用动物为4月龄雄性Sprague-Dawley大鼠（300–350 g）。所有大鼠均以每笼4至5只的群居方式饲养，环境温度保持在23 ± 1 °C 采用12小时光照-黑暗循环。食物和水自由供应 随意摄取大鼠在实施操作前于饲养环境中适应7天。将Aβ25-35溶于含1% DMSO的生理盐水中，浓度为1 mg/mL，随后在超声振荡器中超声处理5分钟，直至完全溶解。AlCl3 RHTGF-β1 分别溶于生理盐水中，浓度为 1% 和 0.1 mg/mL。刚果红、硝酸银及其他化学试剂均为分析纯，购自普通商业来源。
1. 手术操作
注意：将20只雄性Sprague-Dawley大鼠通过微量注射将复合Aβ注入侧脑室和丘脑前背核， designated为复合Aβ处理组。另取20只大鼠进行相同手术操作，但微量注射0.1% DMSO生理盐水， designated为假手术组。
- 通过吸入100%异氟烷对大鼠进行麻醉，随后将其固定于脑立体定位仪上。
- 用手术剪刀剃除头顶部的毛发，并用碘伏消毒。然后，在头部覆盖一次性手术巾。
- 沿颅骨中线纵向用外科手术刀和剪刀在头部皮肤上做切口。
- 分离皮下组织和筋膜，用无菌干棉球擦拭颅骨顶骨以止血，并用记号笔标记前囟。
- 参考大鼠脑立体定位图谱12以bregma为原点，标记三个点：用于注射RHTGF-β1并固定第一颗螺钉的丘脑前背侧核（ad）（后向（P）：距bregma 2.0 mm；外侧（L）：距中线 1.4 mm）；用于注射Aβ25-35和AlCl3的侧脑室（LV）区域（后向（P）：距bregma 0.8 mm；外侧（L）：距中线 2.0 mm）；以及第二颗螺钉的固定位置（前向（F）：距bregma 2.0 mm；外侧（L）：距中线 1.5 mm）。
- 使用可弯曲骨钻在颅骨上述三个位置（步骤1.5）轻轻钻出三个直径为1 mm的孔。切勿过度旋入，以免刺伤脑组织。
- 止血并反复用无菌干棉签清洁颅骨表面。
- 将连接至微注射泵的针头插入脑内深度4.6 mm处，缓慢注射 1 μL RHTGF-β1（10 ng）注入ad区域。注射后留针2分钟，然后缓慢拔出针头（补充文件 1).
- 使用小螺丝刀将两颗螺丝固定在颅骨上标记为 ad 点和颅骨第二螺丝固定位置（在 1.5 步骤中标记）的部位。螺丝旋入深度不得超过必要程度，以避免刺伤脑组织。
- 组装套管植入系统（补充文件 2），高压消毒后，将假导管插入导向导管中。
- 将不锈钢导管套管通过颅骨孔插入脑内侧脑室（LV）区域，深度为4.6 mm（补充文件 3借助大鼠立体定位仪的套管固定器。
- 将义齿基托材料与义齿基托水按每1 mL加1.5 g的比例混合，将所得糊状物涂抹于导引套管的塑料基座及用于固定导引套管的两枚螺钉处，并覆盖整个皮肤切口，以防止皮肤感染。
- 在手术第2天，使用小动物麻醉机通过吸入异氟烷对大鼠进行麻醉。拔出假内管，将真内管插入导向管中，并拧紧固定螺钉以固定内管。
- 设置连接显微注射泵与内套管的聚乙烯管，并调节注射速度至 1 μL/min向侧脑室（LV）微量注射 Aβ25-35 或 AlCl3。
- 显微注射 4 μg (1 μL）Aβ25-35 每日一次，连续14天，于早晨给药 3 μL AlCl3 (1%) 每日一次，连续5天，于异氟烷麻醉下于下午给药。
- 注射结束后等待5分钟，轻轻抽出内管，再次将假管插入导向管中。
- 术后第15天（对应Aβ25-35最后一次注射日），拆除套管植入系统。用手术剪和镊子轻轻去除与基托材料固化的组织，拧下两枚螺丝，拔出导向套管，并用碘伏对伤口进行消毒。用骨水泥填充颅骨孔洞，采用单纯间断缝合法缝合皮肤。
- 对假手术组进行相同操作，并微量注射0.1% DMSO生理盐水。
- 术后护理
- 术后每笼饲养 2 只大鼠，持续提供食物 30 天。
注：假手术组存活18只大鼠（手术成功率为90%），复合物处理Aβ组存活19只大鼠（手术成功率为95%）。
- 术后每笼饲养 2 只大鼠，持续提供食物 30 天。
2. 利用莫里斯水迷宫筛选成功建模的大鼠并评估空间记忆能力
- 莫里斯水迷宫
注意：莫里斯水迷宫用于评估大鼠的空间记忆能力13。莫里斯水迷宫是一个不锈钢制的圆形水槽，直径为120 cm，深度为50 cm。水迷宫实验依据J. Nunez在《行为神经科学》中描述的“金标准”范式进行14。- 向水槽中加入数滴食用色素，使池水呈黑色。
- 保持水深为31.5 cm，水温为23 ± 1 °C。
- 在水面下设置一个直径1.5 cm的圆形透明聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）平台。
- 确保水迷宫周围所有空间线索在实验期间保持不变。
- 通过假想的两条垂直线将水池均分为四个象限，用于描述性数据采集。
- 将隐藏平台置于水迷宫的第一个象限（Q1）中。
- 通过位于水迷宫上方的视频摄像机记录大鼠游泳行为（以潜伏期、轨迹或穿越次数为指标），并连接基于计算机的图像分析软件进行分析。
- 筛选复合Aβ处理组中的成功建模大鼠
- 术后第45天，连续4天进行莫里斯水迷宫训练，以筛选出具有记忆障碍的成功建模大鼠，并计算筛选比值（SR）。
注意：SR定义为复合Aβ处理组每只大鼠与假手术组大鼠在水迷宫训练第4天找到水面下隐藏平台的平均潜伏期之比。在以下公式中，“A”表示每只复合Aβ处理大鼠在训练第4天找到隐藏平台的平均潜伏期，“B”表示假手术组大鼠在训练第4天找到隐藏平台的平均潜伏期：
当某只复合Aβ处理大鼠的SR大于0.2时，该大鼠被视为具有记忆障碍的成功建模大鼠15。日内记忆表现通过两次试验的平均值计算，即大鼠找到隐藏平台所需时间的平均值。莫里斯水迷宫实验设计为允许大鼠在水迷宫中自由游泳并在60秒内寻找隐藏平台。若大鼠在60秒内未能找到隐藏平台，则由实验人员将其手动放置于平台上。当大鼠到达隐藏平台（自主或辅助）后，让其在平台上停留20秒。随后将大鼠从水槽中取出，并在两次试验之间给予10秒的身体恢复时间。
- 术后第45天，连续4天进行莫里斯水迷宫训练，以筛选出具有记忆障碍的成功建模大鼠，并计算筛选比值（SR）。
3. 神经元观察
- 术后第86天，在异氟烷麻醉下，通过断头法处死大鼠（图1）。
- 将脑组织置于冰上，沿中缝轻轻分离两个半球。取视交叉左侧半球，用4%甲醛固定，用于光镜下观察神经元的苏木精-伊红（HE）、刚果红或硝酸银染色（见第4–6节）。将右侧半球海马CA1区用2.5%戊二醛固定，用于透射电镜观察（第7节）。
- 按照先前所述方法进行脑组织的光镜/电镜样品制备16,17。
4. 神经元HE染色
- 在通风橱中，将每张切片依次用梯度酒精（100%、95%、90%、80% 和 70% 酒精）脱蜡，每次 20 分钟，最后转移至蒸馏水中。
- 用 0.5% (w/v) 苏木精染色 3 分钟，然后用自来水冲洗切片，以去除未结合的染料。
- 用含 0.1% 盐酸的酒精溶液冲洗 1 秒，以去除未染色细胞核的颜色。
- 浸入 0.5% 氨水溶液中 2 分钟，直至背景变为浅蓝色。
- 用 1% 伊红染色 1 分钟。
- 用梯度酒精（70%、80%、90%、95% 和 100% 酒精）脱水 5 分钟。
- 用二甲苯透明，并用树脂封片剂封片。
- 在光学显微镜下以 400 倍放大观察海马 CA1 区中部每 0.125 mm 及大脑皮层每 0.0352 mm2 范围内 HE 染色的存活神经元数量，计数者需对实验设计设盲。
5. 检测神经元 Aβ 负荷的刚果红染色法
- 在通风橱中，将每张切片用梯度乙醇（100%、95%、90%、80% 和 70% 乙醇）处理 20 分钟，然后转移至蒸馏水中。
- 用刚果红工作液（0.5 g 刚果红，80 mL 甲醇，20 mL 甘油）染色 20 分钟。
- 用蒸馏水冲洗 5 分钟。
- 用碱性 80% 乙醇溶液（0.2 g 乙醇/100 mL 氢氧化钾）快速分化 3 秒。
- 用蒸馏水冲洗两次，每次 5 分钟。
- 用 Gill 苏木精复染 3 分钟。
- 用自来水冲洗 2 分钟。
- 浸入氨水（向自来水中加入数滴氢氧化铵，充分混匀）30 秒，或直至组织切片变为蓝色。
- 用自来水冲洗 5 分钟。
- 用梯度乙醇（70%、80%、90%、95% 和 100% 乙醇）脱水。
- 用二甲苯透明，然后用树脂封片剂封片。
- 在不知晓实验设计的情况下，由操作者使用光学显微镜在 400× 放大倍数下观察并计数被刚果红染色的细胞。
6. 银染法检测神经元神经纤维缠结的形成
- 在通风橱中，将每张切片用梯度酒精（100%、95%、90%、80% 和 70% 酒精）脱蜡 20 分钟，然后转移至蒸馏水中。
- 在避光条件下，将切片浸入 20% 硝酸银溶液和封端剂中 20 分钟。
- 用蒸馏水洗涤两次，每次 5 分钟。
- 将切片浸入银氨溶液中。将氨水逐滴加入 20% 硝酸银溶液中，边加边用玻璃棒搅拌，直至溶液由浑浊变为澄清。继续搅拌 15 分钟后，将切片转入 1% 稀释的氢氧化铵溶液中 2 分钟。
- 将切片放入显影工作液中 3–7 分钟，直至在轴突中观察到黑色沉淀。
- 将切片浸入 0.1% 稀释氨溶液中 1 分钟，然后用水冲洗 1 分钟。
- 用 5% 硫代硫酸钠处理 2 分钟，然后用水冲洗 5 分钟。
- 用梯度酒精（70%、80%、90%、95% 和 100% 酒精）脱水。
- 用二甲苯透明，然后用树脂封片剂封片。
- 由对实验设计不知情的人员，在光学显微镜下以 400 倍放大倍数观察并记录硝酸银染色的细胞。
7. 海马神经元超微结构测量
- 将大鼠海马CA1区切成若干个（1 × 1 × 1 mm3）的小块，置于2.5%戊二醛中，4 °C固定2小时。
- 用PBS缓冲液漂洗组织块三次（pH 7.2，每次10分钟）。
- 将组织块置于1%锇酸中，4 °C固定2小时。
- 用重蒸水漂洗组织块3次（每次10分钟）。
- 用梯度乙醇脱水：50%、70%、90%乙醇各10分钟，100%乙醇两次，每次15分钟。
- 用丙烯酸甲酯置换两次（每次15分钟），丙烯酸甲酯:树脂（1:1）置换两次（每次60分钟，室温），丙烯酸甲酯:树脂（1:4）置换两次（每次60分钟，室温）；最后在纯树脂中浸泡120分钟（室温）。
- 包埋于EPON 812树脂中，并进行聚合（35 °C 5小时，60 °C 5小时，80 °C 5小时）。
- 切半薄切片（1 µm），用亚甲蓝染色，并在显微镜下定位。
- 用醋酸铀和柠檬酸铅对超薄切片（50 nm）进行染色。
- 在JEM-1400透射电子显微镜下观察并采集图像。
结果
所有数据均以均值 ± 标准误表示。采用SAS/STAT软件包进行统计分析。记忆获取和记忆再学习测试中各组寻找隐藏平台潜伏期的组间差异，通过重复测量双因素方差分析（ANOVA）进行分析。探针试验中各组差异及神经元数量的组间比较采用单因素方差分析，随后进行邓肯多范围检验（Duncan’s multiple-range test）。以 p < 0.05 为差异具有统计学意义18。
复合Aβ处理组记忆障碍成功模型大鼠的筛选：
结果如图2AA1 和 2AA2所示，假手术组大鼠始终能够自由游泳，而复合Aβ处理组大鼠（图2AB1、AB2）在Morris水迷宫的适应性游泳中始终沿水池边缘游动。在为期4天的记忆障碍模型大鼠筛选过程中，所有大鼠找到隐藏平台所需的时间（潜伏期）均逐渐缩短（图2B）。在Morris水迷宫训练的第4天，若某只复合Aβ处理大鼠的SR值大于0.2（该值基于每只复合Aβ处理大鼠与假手术组大鼠找到隐藏平台的潜伏期计算得出），则判定该复合Aβ处理大鼠为记忆障碍成功建模大鼠。19只术后存活大鼠中有18只（94.70%）通过了成功建模筛选。每组各选取6只大鼠用于后续实验。
图 2. 使用 Morris 水迷宫训练筛选经复合 Aβ 处理组中具有记忆障碍的成功模型大鼠。（A）大鼠在 Morris 水迷宫中的适应性游泳轨迹。（AA1-AA2）假手术组；（AB1-AB2）复合 Aβ 处理组。（B）假手术组与复合 Aβ 处理组在 Morris 水迷宫训练筛选试验中连续 4 天寻找隐藏平台的平均潜伏期。图示修改自参考文献 4。请点击此处查看该图的放大版本。
复合 Aβ 导致大鼠记忆获得和记忆再学习能力受损：
大鼠的记忆获得能力通过术后第79天和第80天（即Morris水迷宫测试的第1天和第2天）的定位导航试验进行评估。在为期2天的记忆获得试验期间，所有大鼠找到隐藏平台的潜伏期均呈逐渐下降趋势。如图3所示，在Morris水迷宫测试的第1天和第2天，复合Aβ处理组大鼠找到隐藏平台的潜伏期分别比假手术组高出360.67%和558.28%（F (1, 5) = 238.67，p < 0.01）。这表明复合Aβ可诱导大鼠出现记忆获得障碍。
通过第4、5、6天的莫里斯水迷宫测试反向试验评估大鼠记忆再学习能力，对应术后第82、83和84天。如图3所示，复合Aβ处理组大鼠找到隐藏平台的潜伏时间分别比假手术组延长了306.20%、650.16%和936.92%（F (1, 5) = 138.76，p < 0.01）。这表明复合Aβ可加重大鼠的记忆再学习障碍（图3）。
图3。复合Aβ导致大鼠记忆获得和记忆再学习能力受损。 定位导航试验用于评估大鼠在莫里斯水迷宫实验第1天和第2天连续两天的游泳表现，以评价记忆获得能力，该试验在术后第79天和第80天进行。逆转试验用于评估记忆再学习能力，通过莫里斯水迷宫实验第4、5、6天连续三天的游泳成绩进行评估，对应于手术后的第82、83和84天。折线图显示了各组在莫里斯水迷宫实验第1、2、4、5和6天找到隐藏平台的平均潜伏期。数据采用双因素重复测量方差分析（时间×组别）进行分析。均值±标准误（SEM），n = 6。**p < 0.01，与假手术组相比。本图经修改自参考文献4。请点击此处查看该图的放大版本。
复合 Aβ 导致大鼠记忆保持能力受损：
大鼠的记忆保持能力通过莫里斯水迷宫实验第3天（即术后第81天）的探针试验进行测量。在为期1天的记忆保持试验中，复合Aβ处理组大鼠在60秒内于第一象限（Q1）的游泳时间、游泳距离和穿越次数均少于假手术组，分别减少了32.14%、30.11%和78.95%（p < 0.01）（图4A, 4B）。这些结果表明，复合Aβ可导致大鼠出现记忆保持障碍。
图4。复合Aβ导致大鼠记忆保持能力受损。 通过术后第81天进行的莫里斯水迷宫实验，在第3天进行为期1天的游泳训练后，利用探针试验评估记忆保持能力。（A）探针试验中（无平台）60秒内Q1象限的游泳时间、游泳距离和穿越次数。数据采用单因素方差分析（ANOVA）结合多重比较检验进行分析。均值±标准误（SEM），n = 6。**p < 0.01，与假手术组相比。（B）探针试验中大鼠的游泳轨迹。（A）假手术组，显示在目标象限（Q1）内的游泳时间和距离更长。（B）复合Aβ处理组，显示在目标象限（Q1）内的游泳时间和距离更短。本图已根据参考文献4修改。请点击此处查看此图的放大版本。
复合Aβ对大鼠游泳速度的影响：
大鼠游泳速度是通过术后第85天（即Morris水迷宫实验第7天）可见平台试验计算得出的。根据各组大鼠在水中游动距离和登上平台所用时间的计算结果，各组之间的游泳速度差异无统计学意义。因此，可排除大鼠游泳速度的个体差异，表明所有大鼠的动机和运动能力基本完好（图5）。
图5。 复合Aβ影响大鼠游泳速度。大鼠游泳速度通过Morris水迷宫实验第7天的可见平台试验计算得出，该实验在术后第85天进行。各组大鼠游泳速度之间无显著差异。数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合多重比较检验进行分析。均值±标准误（SEM）。n = 6。本图经修改自参考文献4。请点击此处查看此图的放大版本。
复合Aβ导致大鼠神经元形态学改变：
所有大鼠在术后第86天通过断头处死。肉眼观察发现，数只复合Aβ处理组大鼠出现黄色表面或变薄、塌陷的大脑皮层。与假手术组（图6AA2）相比，经HE染色后对复合Aβ处理组进行光学显微镜观察，发现海马神经元存在病理性改变，如神经原纤维变性、噬神经现象、核固缩和核边集（图6AB2）。此外，复合Aβ处理组部分大脑皮层呈现典型的液化性坏死，其特征为细胞膜破裂、核碎裂以及坏死区域大量炎性细胞浸润（图6AB3）。上述结果表明，复合Aβ可能导致大鼠神经元结构的病理性损伤。
除了神经元结构的病理改变外，与假手术组相比，复合Aβ处理组的海马和大脑皮层（液化坏死样本除外）神经元数量也显著减少。在0.125 mm的海马CA1区切片中，神经元数量比假手术组低63.86%（p < 0.01），在0.0352 mm²的大脑皮层切片中低55.46%（p < 0.01）（图6B），提示复合Aβ可导致神经元数量减少。
图6．复合Aβ导致大鼠神经元形态学改变。（A）海马和大脑皮层神经元的代表性HE染色图像。（A1-B1）海马区，40倍；（A2-B2）海马CA1区，400倍；（A3-B3）大脑皮层，400倍。（A1-A3）假手术组；（B1-B3）复合Aβ处理组；显示海马区神经元明显丢失、神经原纤维变性（→）、神经元吞噬现象（←）、细胞核固缩（↗）、核边集（↙）；在部分复合Aβ处理组的大脑皮层中可见典型液化性坏死（★）、细胞膜破裂、大量炎性细胞浸润。标尺：A1, B1 = 10 µm；标尺：A2, B2, A3, B3 = 100 µm。（B）在光学显微镜下（400倍）计数海马和大脑皮层经HE染色的神经元数量。每个数据点表示3个独立样本中9个视野的均值 ± 标准误（n = 3）。**p < 0.01，与假手术组比较。本图经修改自参考文献4。请点击此处查看该图的放大版本。
透射电子显微镜观察了海马神经元的亚细胞超微结构。与假手术组（图7A1–A4）相比，复合Aβ处理组海马神经元的亚细胞结构（图7B1–B4）出现显著破坏，表现为线粒体肿胀、嵴断裂，线粒体电子密度增高，粗面内质网扩张，多聚核糖体和多微管解聚，部分突触后致密区（PSD）存在，胞质内可见大量次级溶酶体及脂褐素沉积。核膜皱缩、凹陷，常染色质凝聚并变性，髓鞘层松散或发生变性，轴突及纤维结构变细。这些结果表明，复合Aβ可在大鼠中引起神经元亚结构损伤。
图7通过电子显微镜观察评估海马神经元的亚细胞结构。A1-A4：假手术组。比例尺 A1 = 4 µm，12,000×；比例尺 A2 = 3 µm，15,000×；比例尺 A3 = 5 µm，10,000×；比例尺为 A4 = 1 µm，35,000×。B1-B4) 复合Aβ处理组。B1神经元及细胞核固缩（←），常染色质凝聚或变性（#），星形胶质细胞足突肿胀（*），线粒体电子密度增高（▲），髓鞘层松散或变薄（→）；（B2) GFAP表达增强，线粒体电子密度增高（▲），髓鞘层松散或变薄（），次级溶酶体增多（↑），周细胞固缩，周细胞常染色质凝聚或变性（☆），星形胶质细胞足突肿胀（*），线粒体电子密度增高（▲），脂褐素增多（↓），髓鞘层松散或变薄（→）。B4：兴奋性神经递质增多（##），线粒体电子密度增高或膜损伤（▲），突触减少。比例尺为 B1, B2 = 10 µm，5,000×；比例尺 B3 = 5 µm，8,000倍；比例尺 B4 = 1 µm，40,000×。该图改编自参考文献4。 请点击此处以查看此图的放大版本。
复合Aβ导致大鼠神经元中Aβ负荷：
使用刚果红染色法检测神经元中的Aβ沉积。结果显示，复合Aβ可显著诱导大鼠海马和大脑皮层内的细胞内Aβ沉积（图8A）。与假手术组相比，复合Aβ处理组海马和大脑皮层中经刚果红染色呈Aβ阳性的细胞数量分别增加了8.05倍和4.09倍（p < 0.01）（图8B）。这表明复合Aβ可增加大鼠神经元中的Aβ沉积负担。
图8．复合Aβ导致大鼠神经元中Aβ沉积。（A）海马体和大脑皮层中经刚果红染色的Aβ阳性神经元的代表性图像。（A1-B1）海马体CA1区，400×；（A2-B2）大脑皮层，400×。（A1-A2）假手术组；（B1-B2）复合Aβ处理组，显示更多经刚果红染色的Aβ阳性细胞。比例尺＝10 µm，400×。（B）在光学显微镜下（400×）计数的海马体和大脑皮层中经刚果红染色的Aβ阳性神经元数量。每个数据点表示3个独立样本中9个视野的均值±标准误（n = 3）。**p ＜ 0.01，与假手术组相比。请点击此处查看该图的高清版本。
复合Aβ导致大鼠神经元中出现神经原纤维缠结沉积：
采用银染法检测神经元中神经纤维缠结（NFT）的沉积。结果显示，复合Aβ可显著引起大鼠海马和大脑皮层内神经纤维缠结的沉积（图9A）。与假手术组相比，复合Aβ处理组海马和大脑皮层中银染呈棕褐色的NFT阳性细胞数量分别增加9.75倍和4.82倍（p < 0.01）（图9B）。该结果表明，复合Aβ可促进大鼠神经元中神经纤维缠结的聚集。
图9复合的 Aβ 导致大鼠神经元中神经纤维缠结的聚集。 (A) 海马体和大脑皮层中经硝酸银染色的阳性神经纤维缠结（NFT）神经元的代表性图像。 (A1-B1) 海马CA1区 400倍；(A2-B2大脑皮层 400倍。A1-A2) 假手术组；(B1-B2) 复合Aβ处理组，显示复合处理组中硝酸银染色的NFT阳性细胞更多。比例尺 = 10 µm，400倍。B海马和大脑皮层中经硝酸银染色的NFT阳性神经元数量，于光学显微镜下（400×）计数。每个数据点表示3个独立样本中9个视野的平均值±标准误（n = 3）。 **p < 0.01，与假手术组相比。 请点击此处查看此图的放大版本。
讨论
众所周知，学习和记忆能力的丧失是阿尔茨海默病（AD）患者的主要临床症状2。本文所述方法是一种用于研究AD的体内实验方法；我们改进了一项先前发表的用于评估药物缓解大鼠模型记忆缺陷和神经元损伤的实验方案4。本实验方案提供了获取有价值数据的重要细节，并确保动物具有较高的存活率，成功建立模拟AD特征的动物模型，包括手术成功、记忆缺陷、神经元损伤、Aβ负荷以及NFT沉积（在本实验中，动物术后存活率和模型成功率均超过90%）。成功建模的大鼠被用于通过莫里斯水迷宫实验检测其空间记忆能力。定位导航试验发现，复合Aβ可导致大鼠记忆获取能力受损；探针试验发现，复合Aβ可降低大鼠记忆保持能力；逆向试验发现，复合Aβ可导致大鼠再学习能力受损。这些莫里斯水迷宫实验数据表明，复合Aβ可诱导大鼠空间记忆障碍。总体而言，通过脑室内联合注射Aβ25-35、AlCl3和TGF-β1，成功构建了一种可行且可靠的实验室用体内类AD动物模型。
既往研究表明，阿尔茨海默病（AD）患者的脑体积比健康个体减少10%。通过肉眼观察可在大脑半球发现多种萎缩现象。皮层萎缩程度与记忆障碍呈正相关19。组织学上，大量神经元丢失及严重的形态学病理改变直接干扰AD患者的记忆功能20。本研究通过光镜/电镜观察发现，注射复合Aβ的大鼠出现显著的神经病理学改变，包括神经元丢失以及神经元和亚细胞结构的破坏。该结果印证了复合Aβ诱导的大鼠空间记忆障碍，且与AD患者的状态相似。
众所周知，脑内Aβ沉积和NFT聚集被认为是阿尔茨海默病（AD）最重要的组织病理学特征。它们可破坏神经元结构，干扰神经信号传导，损害神经元功能，并导致严重的痴呆17。本动物模型在脑内观察到Aβ沉积和NFT聚集，与AD患者的状态一致。因此，由复合Aβ诱导的大鼠神经元损伤可作为研究AD神经病理机制及治疗策略的模型。
以下是在阿尔茨海默病大鼠模型中筛选药物效应的示例：Zhao 等报道指出，黄芩茎叶（SSF）和半枝莲（SBF）中的黄酮类化合物均可减轻由复合Aβ诱导的大鼠记忆损伤和细胞凋亡8,9. Guo 等，还报道了SBF可抑制复合Aβ处理大鼠中神经纤维缠结（NFT）的聚集以及tau蛋白在Ser199、Ser214、Ser202、Ser404和Thr231位点的过度磷酸化，并降低GSK-3β、CDK5和PKA蛋白及其mRNA的表达水平21. 同时，Shang 等，还报道了SBF能够抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的增殖，并降低复合Aβ大鼠脑内Aβ1-40、Aβ1-42以及β位点APP裂解酶1（BACE1）mRNA的表达水平22根据上述结果，我们的动物模型相较于其他类似阿尔茨海默病的模型具有优势，后者涉及更严重的神经元功能和结构紊乱。
关于其他阿尔茨海默病（AD）样模型，单次脑室内注射Aβ可导致大鼠出现记忆障碍、神经元丢失和神经胶质细胞增殖，但可能不伴随Aβ沉积和神经原纤维缠结（NFT）形成23。暴露于高剂量铝（Al）的大鼠模型具有较高的成功率，能够模拟AD病理特征，是一种经济有效的动物模型，表现为记忆损伤、神经元丢失、神经胶质细胞增殖以及脑内老年斑（SP）和NFT聚集。然而，高剂量铝可能导致大鼠肝损伤和厌食，并伴随体重下降24。老龄大鼠是另一种AD样模型，其表现出记忆障碍、神经元结构/亚结构的病理性改变以及脂褐素沉积，但无Aβ负荷和NFT聚集。该模型通常采用24月龄以上的大鼠，因此需要较长的饲养周期，成本较高17,25。SAMP8小鼠和APP转基因小鼠是最接近AD病理特征的模型，也是研究AD最理想的动物模型。但这两种模型价格较高，且仅限于实验室使用26,27。与上述动物模型相比，我们建立的复合Aβ处理动物模型成本较低且性能优良，是研究AD的理想工具。
综上所述，将 Aβ25-35 与 AlCl3 和 TGF-β1 联合通过脑室内注射给予大鼠，提供了一种有价值的 in vivo 动物模型，有助于更好地理解阿尔茨海默病（AD）中空间记忆障碍、神经元损伤、Aβ 负荷以及神经纤维缠结（NFT）沉积的病理机制。该模型具有快速、相对简便的实验方案，动物存活率高，造模成功率高，且可重复性强，具有较高的经济性。目前的动物模型能够有效模拟 AD，并可通过用于模拟其他多种疾病而进一步验证其适用性。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目由河北省自然科学基金（编号：C2009001007，H2014406048）、河北省中医药管理局（编号：05027）以及河北省高校重点学科建设项目资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 斯普拉格-多利大鼠 | 北京维通利华实验动物技术有限公司，中国 | SCXK(京) 2012-0001 | 300–350 g |
| 莫里斯水迷宫 | 中国医学科学院 & 北京协和医学院，中国 | 无 | |
| 可移动小型动物麻醉机 | 瑞沃德生命科技有限公司，中国 | R580 | |
| 脑立体定位仪 | 瑞沃德生命科技有限公司，中国 | 68001 | |
| 柔性骨钻 | 上海软隆科技发展有限公司，中国 | BW-sD908 | |
| 透射电子显微镜 | 日立有限公司，日本 | JEM-1400 | |
| 双通道微量注射泵 | 瑞沃德生命科技有限公司，中国 | RWD202 | |
| 电镜切片机 | 日立有限公司，中国 | H-7650 | |
| 假导管 | 瑞沃德生命科技有限公司，中国 | 62001 | 外径0.64×内径0.45 mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html |
| 引导导管 | 瑞沃德生命科技有限公司，中国 | 62101 | 外径0.40 mm/M3.5 |
| 内导管 | 瑞沃德生命科技有限公司，中国 | 62201 | 外径0.41×内径0.25 mm/ M3.5 |
| 紧固螺母 | 瑞沃德生命科技有限公司，中国 | 62501 | 外径5.5 mm/长度7.5 mm/M3.5 |
| 固定螺钉 | 瑞沃德生命科技有限公司，中国 | 62514 | M1.2×L2.0 mm (100BAO) |
| 螺丝刀 | 瑞沃德生命科技有限公司，中国 | 62999 | 45*1 mm |
| PE导管 | 瑞沃德生命科技有限公司，中国 | 62302 | |
| β-淀粉样蛋白 25-35 | Sigma Aldrich 公司，美国 | SCP0002-5MG | |
| 重组人转化生长因子-β1 | PeproTech 公司，美国 | 100-21 | |
| 三氯化铝 | 天津科密欧化学试剂有限公司，中国 | 3011080 | |
| 刚果红 | 天津科密欧化学试剂有限公司，中国 | 3010016 | |
| 硝酸银 | 国药集团化学试剂有限公司，中国 | 20150720 | |
| 义齿基托材料 | 上海新世纪 Dental 材料有限公司，中国 | 20170609 |
参考文献
- Robinson, M., Lee, B. Y., Hane, F. T. Recent Progress in Alzheimer's Disease Research, Part 2: Genetics and Epidemiology. J. Alzheimers. Dis. , (2017).
- Hane, F. T., Lee, B. Y., Leonenko, Z. Recent Progress in Alzheimer's Disease Research, Part 1: Pathology. J. Alzheimers Dis. , (2017).
- Perl, D. P. Neuropathology of Alzheimer's disease. Mt. Sinai. J. Med. 77, 32-42 (2010).
- Wu, X. G., Wang, S. S., Miao, H., Cheng, J. J., Zhang, S. F., Shang, Y. Z. Scutellaria barbata flavonoids alleviate memory deficits and neuronal injuries induced by composited Aβ in rats. Behav. Brain Funct. 12, 33-43 (2016).
- Guo, K., Wu, X. G., Miao, H., Cheng, J. J., Cui, Y. D., Shang, Y. Z. Regulation and mechanism of Scutellaria bartata flavonoids on apopotosis of cortical neurons and cytochondriome induced by composited Aβ. Chin Hosp Pharm J. 35, 1994-1999 (2015).
- Guo, K., Miao, H., Wang, S. S., Cheng, J. J., Shang, Y. Z. Scutellaria barbata flavonoids inhibits NFT aggregation and regulatory mechanism in rats induced by composited Aβ. Chin. J. Pathophysio. 32, 2147-2156 (2016).
- Hou, X. C., et al. Scutellaria Barbata flavonoids inhibit the brain's Aβ and NFT abnormal generation and affect the related enzymes expression in rats induced by composited Aβ. Chin J New Drugs. , Accepted (2017).
- Zhao, H. X., Guo, K., Cui, Y. D., Wu, X. G., Shang, Y. Z. Effect of Scutellaria barbata flavonoids on abnormal changes of Bcl-2, Bax, Bcl-xL and Bak protein expression in mitochondrial membrane induced by composite Aβ25-35. Chin J Pathophysiol. 30, 2262-2266 (2014).
- Cheng, J. J., et al. Flavonoid extract from Scutellaria stem and leaf attenuates composited Aβ- induced memory impairment and apoptosis in rats. Chin.J. New Drugs. 25, 2627-2636 (2016).
- Fang, F., Yan, Y., Feng, Z. H., Liu, X. Q., Wen, M., Huang, H. Study of Alzheimer's disease model induced multiple factors. Chongqing Med. 36, 146-151 (2007).
- Regulations for the Administration of Affairs Concerning Experimental Animals. The Ministry of Science and Technology of the People's Republic of China. , 10-31 (1988).
- Bao, X. M., Shu, S. Y. The stereotaxic atlas of the rat brain. , People's medical publishing house. (1991).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rats. J. Neurosic. Methods. 11, 47-60 (1984).
- Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897(2008).
- Yu, J. C., Liu, C. Z., Zhang, X. Z., Han, J. X. Acupuncture improved cognitive impairment caused by multi-infarct dementia in rats. Physiol. & Behav. 86, 434-441 (2005).
- Shang, Y. Z., Miao, H., Cheng, J. J., Qi, J. M. Effects of amelioration of total flavonoids from stems and leaves of Scutellaria baicalensis Georgi on cognitive deficits, neuronal damage and free radicals disorder induced by cerebral ischemia in rats. Biol. Pharm. Bull. 29, 805-810 (2006).
- Song, H. R., Cheng, J. J., Miao, H. J., Shang, Y. Z. Scutellaria flavonoid supplementation reverses ageing-related cognitive impairment and neuronal changes in aged rats. Brain Inj. 23, 146-153 (2009).
- Wang, M., et al. Novel RAS inhibitors Poricoic Acid ZG and Poricoic Acid ZH attenuate renal fibrosis via a Wnt/β-Catenin patheway and targeted phosphorylation of smad3 signaling. J Agric Food Chem. 66, 1828-1842 (2018).
- Pini, L., et al. Brain atrophy in Alzheimer's Disease and aging. Ageing Res. Rev. 30, 25-48 (2016).
- Ubhi, K., Masliah, E. Alzheimer's disease: recent advances and future perspectives. J. Alzheimers Dis. 33, 85-94 (2013).
- Guo, K. Scutellaria barbata flavonoids inhibite NFTs aggregation, tau protein phosphorylation and the regulated mechanism of related enzymes in rats induced by composited Aβ. , Master's thesis (2016).
- Shang, Y. Z. Effects and Mechanism of Scutellaria Barbata Flavonoids on Rat's Memory Impairment Induced by Compound Aβ25-35. , Doctoral Thesis (2013).
- Zussy, C., et al. Alzheimer's disease related markers, cellular toxicity and behavioral deficits induced six weeks after oligomeric amyloid-β peptide injection in rats. PLoS One. 8, 1-20 (2013).
- Walton, J. R. Aluminum involvement in the progression of Alzheimer's disease. J. Alzheimers Dis. 35, 7-43 (2013).
- Neils-Strunjas, J., Groves-Wright, K., Mashima, P., Harnish, S. Dysgraphia in Alzheimer's disease: a review for clinical and research purposes. J. Speech Lang Hear Res. 49, 1313-1330 (2006).
- Morley, J. E., Farr, S. A., Kumar, V. B., Armbrecht, H. J. The SAMP8 mouse: a model to develop therapeutic interventions for Alzheimer's disease. Curr Pharm Des. 18, 1123-1130 (2012).
- Puzzo, D., Gulisano, W., Palmeri, A., Arancio, O. Rodent models for Alzheimer's disease drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 10, 703-711 (2015).
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