从小鼠植入前胚胎中建立干细胞系

摘要

本文介绍了一种从囊胚阶段小鼠胚胎中高效建立和培养多能干细胞系的实验方案。

摘要

小鼠胚胎干细胞（mESC）的分离是指从小鼠着床前胚胎中建立多能性细胞系的过程。这些细胞系在特定条件下具有自我更新或分化的能力。由于这些特性，mESC 在再生医学、疾病建模和组织工程研究中是一种重要的工具。本文介绍了一种简单的方法，通过将容许性小鼠品系的囊胚在含有白血病抑制因子的确定培养基中接种于饲养层细胞上，可高效获得 mESC 细胞系（分离效率达 60–80%）。该方法也可通过在分离培养基中简单添加两种小分子抑制剂（2i 培养基），高效地从小鼠非容许性品系中分离 mESC 细胞系。文中提供了饲养层细胞的制备与培养、小鼠胚胎的收集与培养，以及 mESC 细胞系的分离与培养的详细操作步骤。该方案无需特殊设备，任何具备基本哺乳动物细胞培养经验的实验室均可实施。

引言

胚胎干细胞（ESC）是来源于着床前胚胎的多能细胞，具有在特定条件下自我更新或分化的能力¹。基于这些特性，胚胎干细胞已成为再生医学、疾病建模和组织工程研究中的重要工具²。

ESC 首次从小鼠囊胚中分离获得，由此建立了小鼠 ESC（mESC）细胞系，但成功率较低^3,4多年来，由于难以维持多能性，诱导效率一直较低 体外. 除了饲养层细胞的存在外⁵，可提高分化效率、促进集落贴附，并增强核型稳定性⁶，该方案的几项改进有助于提高多能性的维持，其中最重要的是在mESC培养基中添加白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor, LIF）^7,8，使用来自129S2许可背景的小鼠胚胎⁹ 以及在添加了明确成分、不含潜在分化因子的无血清培养基中培养小鼠胚胎干细胞（mESC）¹⁰最近，有力的证据表明，在小鼠胚胎干细胞（mESC）培养基中添加两种信....

方案

下文所述动物实验的使用已获得巴塞罗那自治大学动物与人类研究伦理委员会以及加泰罗尼亚自治区农业、畜牧业、渔业和食品部的批准（方案编号 #8741）。

1. 饲养细胞的灭活与保存

注意：人包皮成纤维细胞（HFF-1）此前已用1 mL冻存液冻存，冻存液由90%胎牛血清（FBS）和10%二甲基亚砜（DMSO）组成，储存于液氮中，待用时取出。

1. 将一管 HFF-1 冻存细胞（1 mL）放入 37 °C 水浴中解冻。
2. 将解冻后的细胞悬液加入预热的含 10% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，使细胞稀释至 1:10。
3. 将稀释后的细胞悬液（10 mL）接种至 T75 培养瓶中，在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养。
4. 次日更换培养基以去除残留的二甲基亚砜（DMSO）。吸去旧培养基，加入 10 mL 预热的含 10% FBS 的 DMEM。
5. 继续培养 HFF 细胞，每 48 小时更换一次培养基，直至细胞达到汇合状态。此过程可能需要约 7 至 10 天。
6. 配制灭活溶液：将丝裂霉素 C 溶于含 10% FBS 的 DMEM 中，使其终浓度为 10 µg/mL。将细胞与灭活溶液在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 3 小时。
7. 移除灭活....

结果

按照本方案，培养第一周后应有超过95%的组织块形成细胞集落（图1A）。小鼠胚胎干细胞系在连续传代六次后的建立效率在不同实验重复间存在差异，平均成功率为60–80%。在使用允许性小鼠品系（如129S2背景）时，添加2i对结果无显著改善作用，但在非允许性品系中则是必需的。

小鼠ESC集落未经处理培养时应呈现规则形态，具有扁平形状和清晰的边缘图1B- C）或使用2i培养（图1D）。应弃去呈现边缘分化迹象的菌落（图1E- F）。如果获得的诱导效率低于预期值，需控制小鼠胚胎干细胞（mESC）集落的生长，并更频繁地传代，以避免过度生长，因为过度生长可能导致细胞死.......

讨论

尽管小鼠胚胎干细胞（mESC）系的建立是一种在许多实验室中常规使用且广为人知的技术，但由于多种因素可能干扰多能性的维持，其建系效率并不总能达到预期水平。本文将逐步介绍如何采用一种简单且可靠的方案高效建立mESC细胞系，所获得的效率与文献报道的结果相当。

为了确保最佳效率，应每天或每隔一天对细胞进行一次观察和控制，因为所提示的时间点仅具有参考性。必须避免克隆过度生长，因为这会促进细胞死亡和分化。在传代过程中，还应尽可能减少克隆对胰蛋白酶-EDTA的暴露时间，因为这同样可能降低细胞活力。

另一个关键因素是饲养层细胞的来源及其培养条件。多项研究表明，人包皮成纤维细胞（HFF）、小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和小鼠STO成纤维细胞在支持胚胎干细胞（ESC）的分离和培养方面具有同等效果¹⁵。然而，HFF在培养中的存活时间比MEF和STO长一倍，从而为小鼠胚胎干细胞（mESC）的生长提供了更长的时间¹⁶。因此，使用HFF可避免额外的mESC传代培.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器	BD	309628
2-β-巯基乙醇	Life Technologies	31350-010
4 孔板	Thermo Scientific Nunc	176740
酸性 Tyrode 溶液	自制		配方参见 Nagy 等，2003。短期储存（最长 1 个月）请置于 4ºC。如需长期储存，则置于 -20ºC。若溶液效率下降，可加入一滴 1M HCl 进行酸化处理。
BSA	Sigma	A3311
鸡抗小鼠 IgG，Alexa Fluor 488	Molecular Probes - Invitrogen	A-21200	1:500 稀释。用于 Oct4、Tuj1、αSMA 和 AFP 小鼠抗体的二抗。
CHIR990212	Axon Medchem	1386	每毫克粉末用 2.15 ml DMSO 重悬，配制成 1 mM 储存液。按所需体积分装后置于 -20ºC 保存。避免反复冻融。
CryoTube	Thermo Scientific Nunc	3754518
DMSO	Sigma	41640
DMEM	BioWest	L0107
FBS	BioWest	S1810	使用前于 56ºC 加热 30 分钟以灭活。分装后置于 -20ºC 保存
冲洗针头	BD	304000	剪断针头末端，并在磨石上打磨成钝端
猪皮明胶	Fluka	48724	以蒸馏水稀释至 0.2%，高压灭菌。每次稀释后可使用一个月。
山羊抗兔 IgG，Alexa Fluor 594	Molecular Probes - Invitrogen	A-11037	1:500 稀释。用于 Sox2 兔抗体的二抗。
HBSS	BioWest	L0611
HEPES 缓冲 CZB	自制		成分参见 Chatot 等，1989
人绒毛膜促性腺激素	Divasa-Farmavic	Veterin-Corion 3000 UI	用 0.9% NaCl 稀释至 50 IU/ml。分装为 1 ml 每管，置于 -20ºC 保存，最长两个月。解冻后请勿再次冷冻。
人包皮成纤维细胞	ATCC	ATCCSCRC-1041	建议长期储存于液氮中。
KnockOut 血清替代物	Life Technologies	10828-028	避光。建议分装为 10 ml 等小体积，置于 -20ºC 保存（注意查看有效期）。避免反复冻融。
KSOMaag Evolve	Zenith Biotech	ZEKS-050	添加 4 mg/ml BSA。使用前一天于 37ºC 和 5% CO2 条件下平衡。
白血病抑制因子	Merk Millipore	ESG1106
小鼠	Charles River/Harlan		建议使用易于分离 mESC 的品系（如 129S2 或 C57BL）。然而，近交系产生胚胎的效率较低。因此，建议使用杂交品系，如 129S2 × C57BL 或 B6CBAF1，以利用杂种优势。
矿物油	Sigma	M8410	经胚胎测试。避光。
丝裂霉素 C	Serva	2980501	用 MilliQ 水将粉末重悬至 0.5 mg/ml。避光置于 4ºC 保存。注意：有害，疑似致癌物。
小鼠抗微管蛋白 β III (Tuj1)	Biolegend	MMS-435P	1:500 稀释
小鼠单克隆抗-αSMA	Sigma	A5228	1:200 稀释
小鼠单克隆抗 AFP	R&D Systems	MAB1368	1:50 稀释
小鼠单克隆抗 Oct3/4	Santa Cruz	Sc-5279	1:50 稀释
非必需氨基酸	Life Technologies	11140-035
PD0325901	Axon Medchem	1408	每毫克粉末用 2.08 ml DMSO 重悬，配制成 1 mM 储存液。按所需体积分装后置于 -20ºC 保存。避免反复冻融。
培养皿 (35 mm)	Thermo Scientific Nunc	153066
培养皿 (60 mm)	Thermo Scientific Nunc	150288
孕马血清促性腺激素	Foligon	Foligon-1000 UI	用 0.9% NaCl 稀释至 50 IU/ml。分装为 1 ml 每管，置于 -20ºC 保存，最长两个月。解冻后请勿再次冷冻。
兔多克隆抗 Sox2	Merck Millipore	AB5603	1:200 稀释
T75 方瓶	Thermo Scientific	130190
胰蛋白酶-EDTA 10 倍浓缩液	BioWest	X0930	用 HBSS 1:10 稀释，得到 1 倍工作液