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方法文章

从小鼠植入前胚胎中建立干细胞系

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DOI：

10.3791/56171

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2017年8月20日

 ,  , 
1Unitat de Biologia Cellular, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona

本文内容

摘要

本文介绍了一种从囊胚阶段小鼠胚胎中高效建立和培养多能干细胞系的实验方案。

摘要

小鼠胚胎干细胞（mESC）的分离是指从小鼠着床前胚胎中建立多能性细胞系的过程。这些细胞系在特定条件下具有自我更新或分化的能力。由于这些特性，mESC 在再生医学、疾病建模和组织工程研究中是一种重要的工具。本文介绍了一种简单的方法，通过将容许性小鼠品系的囊胚在含有白血病抑制因子的确定培养基中接种于饲养层细胞上，可高效获得 mESC 细胞系（分离效率达 60–80%）。该方法也可通过在分离培养基中简单添加两种小分子抑制剂（2i 培养基），高效地从小鼠非容许性品系中分离 mESC 细胞系。文中提供了饲养层细胞的制备与培养、小鼠胚胎的收集与培养，以及 mESC 细胞系的分离与培养的详细操作步骤。该方案无需特殊设备，任何具备基本哺乳动物细胞培养经验的实验室均可实施。

引言

胚胎干细胞（ESC）是来源于着床前胚胎的多能细胞，具有在特定条件下自我更新或分化的能力1。基于这些特性，胚胎干细胞已成为再生医学、疾病建模和组织工程研究中的重要工具2。

ESC 首次从小鼠囊胚中分离获得，由此建立了小鼠 ESC（mESC）细胞系，但成功率较低3,4多年来，由于难以维持多能性，诱导效率一直较低 体外. 除了饲养层细胞的存在外5，可提高分化效率、促进集落贴附，并增强核型稳定性6，该方案的几项改进有助于提高多能性的维持，其中最重要的是在mESC培养基中添加白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor, LIF）7,8，使用来自129S2许可背景的小鼠胚胎9 以及在添加了明确成分、不含潜在分化因子的无血清培养基中培养小鼠胚胎干细胞（mESC）10最近，有力的证据表明，在小鼠胚胎干细胞（mESC）培养基中添加两种信号通路小分子调节剂的混合物（称为2i），最有利于维持其多能性。2i混合物包含MEK抑制剂PD0325901和GSK3β抑制剂CHIR99021：前者通过抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路以减少分化信号，后者通过激活Wnt通路在低密度条件下增强细胞存活。11.

本文介绍了一种从小鼠囊胚高效建立胚胎干细胞系（mESC）的简单方案。我们采用标准操作流程，将来自容许性品系的小鼠胚胎在含有LIF和血清替代物的培养基中，接种于饲养层细胞上进行培养12。按照本方案，所获得的mESC系建系效率可达到与2i培养基相当的水平。尽管如此，在维持多能性存在潜在困难的情况下，或使用非容许性品系时，仍可添加2i以避免可能出现的问题。

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方案

下文所述动物实验的使用已获得巴塞罗那自治大学动物与人类研究伦理委员会以及加泰罗尼亚自治区农业、畜牧业、渔业和食品部的批准（方案编号 #8741）。

1. 饲养细胞的灭活与保存

注意：人包皮成纤维细胞（HFF-1）此前已用1 mL冻存液冻存，冻存液由90%胎牛血清（FBS）和10%二甲基亚砜（DMSO）组成，储存于液氮中，待用时取出。

  1. 将一管 HFF-1 冻存细胞（1 mL）放入 37 °C 水浴中解冻。
  2. 将解冻后的细胞悬液加入预热的含 10% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，使细胞稀释至 1:10。
  3. 将稀释后的细胞悬液（10 mL）接种至 T75 培养瓶中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养。
  4. 次日更换培养基以去除残留的二甲基亚砜（DMSO）。吸去旧培养基，加入 10 mL 预热的含 10% FBS 的 DMEM。
  5. 继续培养 HFF 细胞，每 48 小时更换一次培养基，直至细胞达到汇合状态。此过程可能需要约 7 至 10 天。
  6. 配制灭活溶液：将丝裂霉素 C 溶于含 10% FBS 的 DMEM 中，使其终浓度为 10 µg/mL。将细胞与灭活溶液在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 3 小时。
  7. 移除灭活溶液，用 2 mL 汉克斯平衡盐溶液（HBSS）洗涤细胞三次，以去除残留的丝裂霉素 C。
  8. 加入 1 mL 预热的胰蛋白酶-EDTA 溶液，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 5 分钟，使灭活细胞脱落。
  9. 在倒置显微镜下观察细胞是否已脱落（使用数值孔径为 0.3 或 NA 的 10 倍物镜）。若未完全脱落，则继续在 37 °C、5% CO2 条件下孵育数分钟，并再次在倒置显微镜下检查细胞状态。
  10. 使用巴斯德吸管轻轻吹打溶液，以分散细胞团块。
  11. 加入 4 mL 含 10% FBS 的 DMEM 以中和酶活性，并重悬细胞。
  12. 取部分细胞悬液，用 HBSS 进行 1:100 稀释。为确定细胞数量，取 10 µL 稀释液加入血球计数板（Neubauer 计数室），在倒置显微镜下计数计数室中一个大方格内的细胞数（使用数值孔径为 0.45 的 20 倍物镜）。
    1. 重复计数共四个大方格。总细胞数（N）按以下公式计算：N = 平均细胞数 × 总体积 × 稀释倍数 × 104。
  13. 将剩余细胞悬液在 200 × g 条件下离心 5 分钟，弃上清，用冻存液重悬细胞沉淀，调整细胞浓度为每毫升含 106 个细胞。
  14. 将细胞悬液分装至冻存管中，每管含 106 个细胞（1 mL）。将冻存管放入程序降温盒中，于 -80 °C 冷冻保存。
  15. 次日，将冻存管转移至液氮中长期保存。

2. 饲养层细胞培养

  1. 在开始诱导过程前一至四天，将含有 1 × 106 个灭活 HFF-1 细胞的冻存管于 37 °C 水浴中解冻。
  2. 将解冻后的 HFF-1 细胞用预热的含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基按 1:6 比例稀释，并保持温度为 37 °C。
  3. 向 4 孔板的每个孔中加入 500 µL 预热的 0.2% 猪皮明胶溶液，并将培养板置于 37 °C 环境中孵育 10 分钟。
  4. 吸除各孔中的 500 µL 明胶溶液，加入 500 µL HFF-1 细胞稀释液。轻轻摇动培养板，使 HFF-1 细胞在孔底均匀分布。避免做环形晃动，否则细胞会聚集于孔中央。
  5. 将培养板在 37 °C、5% CO2 条件下孵育至少 24 小时，以获得每个孔中均形成灭活 HFF-1 细胞单层。
  6. 次日，在倒置显微镜（10X 物镜，数值孔径 0.3）下观察细胞，确认细胞已贴壁且分布均匀。更换培养基以去除残留的 DMSO：吸除旧培养基，每孔加入 500 µL 预热的含 10% FBS 的 DMEM 培养基。

3. 胚胎收集与培养

  1. 在胚胎采集前4天，对6至12周龄的雌性小鼠进行腹腔注射，给予5 IU的孕马血清促性腺激素。
    注意：我们使用了129S2或B6CFAF1品系的雌性小鼠，但也可使用其他小鼠品系的雌性个体。然而，在使用非许可品系的雌性小鼠时（例如 CBA）时，培养基应补充2i，具体如步骤4.2所述。
  2. 48小时后，通过腹腔注射给予5 IU人绒毛膜促性腺激素，并将雌性小鼠与至少8周龄的雄性小鼠以1:1的比例合笼交配。次日将雌性与雄性小鼠分笼饲养。
  3. 胚胎采集前一天，准备一个35 mm细胞培养皿，在其中加入数滴每滴40 µL的KSOMaa培养基，培养基中添加4 mg/mL牛血清白蛋白（BSA），然后加入矿物油覆盖所有液滴。将培养皿置于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 平衡培养基。
  4. 准备胚胎操作移液管时，使用本生灯加热长尖玻璃巴斯德移液管的较细部分。待其变软后，将其移离火焰，并将两端拉开。折断至所需长度，移液管尖端的内径应为100–150 µm。
  5. 通过颈椎脱位法处死雌性小鼠，时间在45-48 h 交配后 (体外)
  6. 用弯头锋利剪刀剪开皮肤，用直头锋利剪刀剪开腹膜，解剖小鼠以暴露腹腔。用镊子夹住一侧子宫，用直头锋利剪刀剪下输卵管，置于HEPES缓冲的CZB培养基（HCZB）中13 在37 °C下。重复该步骤以移除另一侧输卵管。
  7. 使用装有HCZB的1 mL注射器，借助钟表匠镊子固定，冲洗输卵管以收集2细胞胚胎。
    注意：制备灌注针时，取一支30 G的皮下注射针，剪断针尖，并在磨石上磨成钝端。
  8. 使用口吸管装置吸取胚胎，用HCZB洗涤后，将其移至预先准备好的胚胎培养皿中，在37 °C、5% CO₂条件下进行培养2 直至囊胚阶段。每个40 µL液滴中最多可培养50枚胚胎。每隔24小时在体视显微镜下观察胚胎发育情况。
    注意：或者，可在囊胚阶段收集胚胎，以缩短 体外 胚胎培养。在此情况下，于交配后3.5至4.5天处死雌性小鼠，解剖子宫，并用HCZB冲洗。

4. 干细胞的分离

  1. 衍生板的制备
    1. 在胚胎接种当天，通过在DMEM培养基中添加100 µM 2-β-巯基乙醇、1x 非必需氨基酸、20% 血清替代物和103 U/mL 白血病抑制因子（LIF），配制衍生培养基。
    2. 如需要，还可加入1 µM MEK抑制剂PD0325901和3 µM GSK3抑制剂CHIR99021，以获得2i培养基。
    3. 从培养箱中取出含有失活人胎儿成纤维细胞（HFF）单层的4孔板（步骤2.6）。吸除培养基，每孔加入800 µL预热的衍生培养基，然后将培养板放回培养箱。
  2. 透明带去除与胚胎接种
    1. 准备一个35 mm细胞培养培养皿，其中放置三滴30 µL的酸性Tyrode溶液14和三滴30 µL的衍生培养基。用矿物油覆盖各液滴，并将培养皿保持在37 °C。
    2. 从培养箱中取出胚胎培养皿。使用胚胎操作移液管，将囊胚逐个从培养液滴转移至酸性Tyrode溶液液滴中。如有可能，应仅选择扩张囊胚以启动衍生过程。
    3. 在体视显微镜下监测透明带的消化情况。一旦透明带消失，立即将囊胚转移至衍生培养基液滴中，以洗去酸性Tyrode溶液。
    4. 从培养箱中取出4孔衍生板，将每个无透明带的囊胚接种到各孔的饲养层细胞上。
    5. 将4孔衍生板放回培养箱，在37 °C和5% CO2条件下继续培养。
  3. 干细胞生长监测与换液
    1. 每隔24小时在倒置显微镜下（20X物镜，数值孔径0.45）观察培养情况。需特别注意是否存在干细胞分化迹象，例如在克隆周围出现肿胀、折光性强的细胞，甚至将饲养层细胞推开的现象。
    2. 每隔一天更换一次培养基。从培养箱中取出4孔板，吸除各孔中的旧培养基，每孔加入800 µL预热的衍生培养基（如使用，需补充LIF和2i）。持续培养直至观察到细胞克隆生长（约6–8天）。

5. 干细胞培养与维持

  1. 制备Kolle样操作钩和干细胞操作移液管。按照步骤3.4制备尖端内径为250–300 µm的干细胞操作移液管。使用拉制后的巴斯德移液管的另一部分制备Kolle样操作钩，加热并塑形至形成钩状。
  2. 将4孔培养板从培养箱中取出，在体视显微镜下定位克隆 outgrowth。使用操作钩推除围绕outgrowth的分化细胞及饲养层细胞。
    注意：为避免outgrowth进一步分化，必须清除其边缘的所有已分化细胞。
  3. 用干细胞操作移液管吸取outgrowth，并将其转移至新培养皿中含50 µL胰蛋白酶-EDTA的液滴中。
  4. 使用手术刀将outgrowth切成多个小块，以实现机械与酶联双重解离。
  5. 立即把outgrowth碎片转移至一滴新鲜的分化培养基中，以中和胰蛋白酶的消化作用。
  6. 将outgrowth碎片转移至铺有饲养层细胞的新的4孔板中。每孔最多转移10个碎片，并在37 °C、5% CO2条件下，使用分化培养基进行培养。
  7. 在确认小鼠胚胎干细胞（mESC）系建立之前，需至少维持类干细胞样培养物六周。每隔一天更换一次培养基，每周传代一次。

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结果

按照本方案，培养第一周后应有超过95%的组织块形成细胞集落（图1A）。小鼠胚胎干细胞系在连续传代六次后的建立效率在不同实验重复间存在差异，平均成功率为60–80%。在使用允许性小鼠品系（如129S2背景）时，添加2i对结果无显著改善作用，但在非允许性品系中则是必需的。

小鼠ESC集落未经处理培养时应呈现规则形态，具有扁平形状和清晰的边缘图1B- C）或使用2i培养（图1D）。应弃去呈现边缘分化迹象的菌落（图1E- F）。如果获得的诱导效率低于预期值，需控制小鼠胚胎干细胞（mESC）集落的生长，并更频繁地传代，以避免过度生长，因为过度生长可能导致细胞死...

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讨论

尽管小鼠胚胎干细胞（mESC）系的建立是一种在许多实验室中常规使用且广为人知的技术，但由于多种因素可能干扰多能性的维持，其建系效率并不总能达到预期水平。本文将逐步介绍如何采用一种简单且可靠的方案高效建立mESC细胞系，所获得的效率与文献报道的结果相当。

为了确保最佳效率，应每天或每隔一天对细胞进行一次观察和控制，因为所提示的时间点仅具有参考性。必须避免克隆过度生长，因为这会促进细胞死亡和分化。在传代过程中，还应尽可能减少克隆对胰蛋白酶-EDTA的暴露时间，因为这同样可能降低细胞活力。

另一个关键因素是饲养层细胞的来源及其培养条件。多项研究表明，人包皮成纤维细胞（HFF）、小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和小鼠STO成纤维细胞在支持胚胎干细胞（ESC）的分离和培养方面具有同等效果15。然而，HFF在培养中的存活时间比MEF和STO长一倍，从而为小鼠胚胎干细胞（mESC）的生长提供了更长的时间16。因此，使用HFF可避免额外的mESC传代培...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Jonatan Lucas 在饲养细胞培养方面的技术支持，感谢 UAB 动物饲养中心（Servei Estabulari de la UAB）提供的动物护理，以及 Domènec Martín 的视频录制工作。本研究得到了西班牙经济与竞争力部（Ministerio de Economia y Competitividad）项目 AGL2014-52408-R 和加泰罗尼亚政府（Generalitat de Catalunya）项目 2014 SGR-524 的资助。MVC 获得了 UAB PIF 奖学金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 注射器BD 309628
2-β-巯基乙醇Life Technologies31350-010
4 孔板Thermo Scientific Nunc176740
酸性 Tyrode 溶液 自制配方参见 Nagy 等，2003。短期储存（最长 1 个月）请置于 4ºC。如需长期储存，则置于 -20ºC。若溶液效率下降，可加入一滴 1M HCl 进行酸化处理。 
BSASigmaA3311
鸡抗小鼠 IgG，Alexa Fluor 488Molecular Probes - InvitrogenA-212001:500 稀释。用于 Oct4、Tuj1、αSMA 和 AFP 小鼠抗体的二抗。 
CHIR990212Axon Medchem 1386每毫克粉末用 2.15 ml DMSO 重悬，配制成 1 mM 储存液。按所需体积分装后置于 -20ºC 保存。避免反复冻融。 
CryoTubeThermo Scientific Nunc3754518
DMSOSigma41640
DMEMBioWestL0107
FBSBioWestS1810使用前于 56ºC 加热 30 分钟以灭活。分装后置于 -20ºC 保存
冲洗针头BD 304000剪断针头末端，并在磨石上打磨成钝端
猪皮明胶Fluka48724以蒸馏水稀释至 0.2%，高压灭菌。每次稀释后可使用一个月。
山羊抗兔 IgG，Alexa Fluor 594Molecular Probes - InvitrogenA-110371:500 稀释。用于 Sox2 兔抗体的二抗。 
HBSSBioWestL0611
HEPES 缓冲 CZB 自制成分参见 Chatot 等，1989
人绒毛膜促性腺激素Divasa-FarmavicVeterin-Corion 3000 UI用 0.9% NaCl 稀释至 50 IU/ml。分装为 1 ml 每管，置于 -20ºC 保存，最长两个月。解冻后请勿再次冷冻。 
人包皮成纤维细胞ATCCATCCSCRC-1041建议长期储存于液氮中。
KnockOut 血清替代物Life Technologies 10828-028避光。建议分装为 10 ml 等小体积，置于 -20ºC 保存（注意查看有效期）。避免反复冻融。   
KSOMaag EvolveZenith BiotechZEKS-050添加 4 mg/ml BSA。使用前一天于 37ºC 和 5% CO2 条件下平衡。
白血病抑制因子Merk MilliporeESG1106
小鼠 Charles River/Harlan建议使用易于分离 mESC 的品系（如 129S2 或 C57BL）。然而，近交系产生胚胎的效率较低。因此，建议使用杂交品系，如 129S2 × C57BL 或 B6CBAF1，以利用杂种优势。 
矿物油SigmaM8410经胚胎测试。避光。 
丝裂霉素 CServa2980501用 MilliQ 水将粉末重悬至 0.5 mg/ml。避光置于 4ºC 保存。注意：有害，疑似致癌物。 
小鼠抗微管蛋白 β III (Tuj1)BiolegendMMS-435P1:500 稀释
小鼠单克隆抗-αSMASigmaA52281:200 稀释
小鼠单克隆抗 AFPR&D SystemsMAB13681:50 稀释
小鼠单克隆抗 Oct3/4 Santa CruzSc-52791:50 稀释
非必需氨基酸Life Technologies11140-035
PD0325901Axon Medchem 1408每毫克粉末用 2.08 ml DMSO 重悬，配制成 1 mM 储存液。按所需体积分装后置于 -20ºC 保存。避免反复冻融。
培养皿 (35 mm)Thermo Scientific Nunc153066
培养皿 (60 mm)Thermo Scientific Nunc150288
孕马血清促性腺激素FoligonFoligon-1000 UI用 0.9% NaCl 稀释至 50 IU/ml。分装为 1 ml 每管，置于 -20ºC 保存，最长两个月。解冻后请勿再次冷冻。 
兔多克隆抗 Sox2Merck MilliporeAB56031:200 稀释
T75 方瓶Thermo Scientific130190
胰蛋白酶-EDTA 10 倍浓缩液BioWestX0930用 HBSS 1:10 稀释，得到 1 倍工作液

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