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方法文章

多色 FlpOut 技术在研究胶质细胞高分辨率单细胞形态及细胞间相互作用中的应用 果蝇

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DOI：

10.3791/56177

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2017年10月20日

 ,  ,  , 
1Gene Center and Department of Biochemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich, 2Janelia Farm Research Campus, Howard Hughes Medical Institute

本文内容

摘要

细胞表现出不同的形态，并与其邻近细胞建立多种相互作用。本方案描述了如何利用成熟的Gal4/UAS表达系统揭示单个细胞的形态，并研究细胞间的相互作用。

摘要

细胞呈现出不同的形态以及复杂的解剖学关系。细胞如何与邻近细胞相互作用？这些相互作用在不同细胞类型之间，甚至在同一类型内部是否存在差异？它们遵循哪些空间规律？目前，由于缺乏对活体（in vivo）中单个细胞进行高分辨率标记的有效工具，上述基本问题的研究一直受到限制。本文提供了一种利用多色 FlpOut（MCFO）技术靶向标记单个细胞的详细实验方案。该方法基于三个带有不同标签（HA、FLAG 和 V5）的报告基因，这些基因受 UAS 调控，并被位于两个 FRT 位点之间的转录终止序列（FRT-stop-FRT）所沉默。通过短暂的热激处理，诱导热激启动子驱动的 Flp 重组酶表达，该酶可随机地在单个细胞中切除 FRT-stop-FRT 序列；而报告基因的表达仅发生在同时表达 GAL4 驱动子的细胞中。由此可在特定细胞类型中产生多种颜色标记的细胞阵列，从而实现对单个细胞形态的高分辨率可视化。例如，可将 MCFO 技术与特异性的胶质细胞 GAL4 驱动子结合，用于观察成年黑腹果蝇（Drosophila）大脑中不同胶质细胞亚型的形态结构。

引言

胶质细胞是神经系统（NS）中的非神经元细胞群体，长期以来被认为仅为神经元提供静态的结构支持，因此未被深入研究。然而，在人体中，胶质细胞构成了神经系统中绝大多数的细胞（约90%），并可分为多种不同类型，包括星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和施万细胞。在Drosophila中，胶质细胞约占神经系统细胞的10%。引人注目的是，它们的形态和功能与脊椎动物中的胶质细胞 remarkably 相似1,2。其形态包括形成血脑屏障（BBB）的上皮细胞、包裹性细胞以及类似星形胶质细胞的细胞。

果蝇（Drosophila）中枢神经系统（CNS）主要由以下结构组成：包含神经元胞体的皮层区域；含有突触连接的神经毡区域；连接不同神经毡的小型和大型轴突束；以及连接感觉器官和肌肉与中枢神经系统的外周神经（图1）。胶质细胞存在于所有这些解剖结构中：皮层胶质细胞（CG）位于皮层区域；星形胶质样胶质细胞（ALG）和包被胶质细胞（EG）位于神经毡区域；包被胶质细胞也分布于中枢轴突束和外周神经（EGN）；最后是两种片状胶质细胞——围神经胶质细胞（PG）和亚围神经胶质细胞（SPG），它们共同形成连续的层状结构，包裹整个神经系统（图2）。

先前的研究表明，胶质细胞在神经系统发育过程中发挥着重要作用：它们通过响应系统性循环的胰岛素样肽来监测神经元数量，为神经元提供营养支持（例如星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭），并通过吞噬作用清除凋亡的神经元3,4,5,6。在成熟的神经系统中，胶质细胞维持血脑屏障（BBB），摄取神经递质并维持离子稳态，作为神经系统中的主要免疫细胞（因为巨噬细胞无法穿越血脑屏障），同时调节突触活动和动物行为6,7,8,9,10,11。

不同胶质细胞亚型是否执行特化功能仍然是一个重要的未解问题。然而，由于缺乏适当的遗传操作工具，对胶质细胞（尤其是成体中的胶质细胞）进行系统性的全基因组分析一直受到阻碍。本文介绍了一种能够高效、简便地表征细胞形态以研究复杂细胞间相互作用的方法。该技术已应用于表征成年黑腹果蝇（Drosophila）大脑中不同胶质细胞亚型的形态，但根据所使用的特定GAL4驱动子，该方法也可被调整用于研究神经元12,13、各类混合分布的细胞，原则上还可用于任何发育阶段的任何组织。

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方案

1. 多色 FlpOut（MCFO）实验的果蝇准备

注意：MCFO 技术指的是所谓的 Flp 介导的终止盒切除（FlpOut）方法的一种改良版本。转基因 MCFO 果蝇携带一个热休克启动子（hsp）驱动的 Flp 重组酶以及在 UAS 控制下的不同报告基因。每个报告基因均由一个共同的骨架构成，即肉豆蔻酰化（myr）超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP），其中插入了 10 个拷贝的表位标签（例如，HA、FLAG 或 V5）。由此产生的非荧光蛋白被称为"spaghetti monster GFPs"（smGFPs）14，可通过针对不同表位标签的特异性抗体进行检测。

  1. 将带有 MCFO 盒式元件和 hsp-Flp（hsp-Flp；10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA、10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG、10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5）的果蝇与适当的胶质细胞 GAL4 驱动品系杂交（见材料表）。
    1. 由于 hsp 在 25 °C 时已有活性，可能导致少数细胞发生重组，从而引起非特异性标记，因此为避免系统渗漏，应在 18 °C 下设置杂交。在 18 °C 下等待约 20 天以获得 F1 代。热激后（见步骤 2），将果蝇维持在 25 °C（图 3）。

2. 热激

注意：根据插入位点的不同，hsp-Flp 的效率可能有所差异；因此，最适热激时间需要进行优化。本方案中使用了 hsp-Flp 插入 X 染色体的 MCFO 果蝇品系（见材料表）。

  1. 将步骤1.1中杂交所得子代（F1代果蝇，3-4日龄）转移至含有培养基的新试管中，并将试管置于37 °C水浴中进行热激处理。
    注意：年轻果蝇（1-2日龄）对热激非常敏感。为降低处理引起的死亡率，建议在果蝇出生后等待1至2天再进行热激。可保留部分F1代果蝇作为未热激的对照组。
  2. 热激过程中，将果蝇保留在含培养基的常规试管中，以减少应激导致的死亡。雌雄果蝇需分开放置在不同试管中。
  3. 确保整个试管完全浸入水中，以实现均匀的热激。对于使用多种GAL4驱动系实现胶质细胞稀疏标记的情况，可采用5-8分钟的热激时间作为合适的起始条件；但具体热激时长需根据不同的驱动系和实验进行优化（可能需要更短或更长的热激时间）。
  4. 热激结束后，将试管水平放置于实验台上数分钟，使果蝇有时间恢复。
    注意：无需更换试管。
  5. 将果蝇继续在25 °C条件下培养，并在热激后2天或更长时间进行解剖（见步骤3和4），以获得最佳的报告基因表达效果。

3. 解剖准备与溶液配制

  1. 解剖当天，将180 µL S2细胞培养基与20 µL 20%多聚甲醛（PFA）混合，于200 µL PCR管中配制新鲜固定液，得到2% PFA溶液。解剖前及解剖过程中，固定液需置于冰上保存。
    注意：PFA 具有毒性，必须小心操作。
    注意：在200 µL PCR管中，将160 µL S2细胞培养基与40 µL 20%多聚甲醛（PFA）混合，以制备4% PFA溶液，而非2%溶液。
  2. 每种基因型使用一个PCR管，每管最多放入8-10个脑组织，以获得最佳染色效果。
  3. 配制成年脑组织洗涤液：含0.5%牛血清白蛋白和0.5% Triton X-100的PBS溶液。
    注意：根据染色情况，可能需要使用含1% Triton X-100的溶液。提高Triton X-100的浓度可增强抗体向组织内部的渗透，对于染色位于组织深部的区域是必要的例如， 成年个体中的突触区域 果蝇 脑
  4. 配制封闭液：在 PBS 中加入 3% 正常山羊血清、3% 正常驴血清和 0.5% Triton X-100。
  5. 成年脑灌注液和封闭液可在 4 °C 下保存数周。
  6. 将深孔玻片置于冰上，然后向每个孔中加入以下溶液：一孔加入70%乙醇，一孔加入PBS，一孔加入S2细胞培养基。

4. 成年小鼠脑组织解剖

  1. 将一个直径为 3 cm 的解剖皿置于体视显微镜载物台上，并加入冷的 S2 细胞培养基。所有解剖操作均需在此培养基中进行，以确保组织在解剖过程中保持健康。
    注意：使用内衬数毫米厚黑色硅胶的解剖皿可提供良好的背景对比度（在图像中），并在解剖过程中妥善保存镊子。
  2. 用 CO2 麻醉所需基因型的果蝇。
  3. 用镊子夹住果蝇的翅膀，先在冷的 70% 乙醇中清洗 30 秒，再在冷的 PBS 中清洗 30 秒。
  4. 将果蝇转移至盛有 S2 细胞培养基的深孔解剖皿中。
  5. 对同基因型的所有果蝇重复上述步骤，并将其保留在冷的 S2 细胞培养基中直至解剖，以维持组织活性。
    注意：仅麻醉约 30 分钟内可完成解剖的果蝇数量。在 S2 细胞培养基中长时间孵育可能损伤组织。
  6. 用镊子夹住果蝇，在体视显微镜下将其浸入 S2 细胞培养基中。
  7. 将头部与身体分离。弃去身体部分，保留头部浸没在 S2 细胞培养基中。在整个解剖过程中必须始终用镊子夹住头部。若头部开始上浮，则在不损伤组织的情况下重新捕获将变得困难。
  8. 开始解剖时，始终至少用一把镊子固定头部，然后拉出一只眼睛。确保镊子尖端刚好位于视网膜下方，以避免损伤下方组织。拉出另一只眼睛后，继续去除头壳，直至脑组织暴露。
  9. 彻底清除脑组织周围的气管组织和头壳，直至组织外观干净。为获得最佳染色效果，务必清除脑组织周围所有气管组织；此时组织已准备好进行固定和染色。
  10. 在将所有已解剖的脑组织转移至 PFA 溶液前，先将其保留在冷的 S2 细胞培养基中，以便精确控制固定步骤的时间。

5. 成年大脑染色

  1. 使用 P10 移液器将分离的脑组织转移至室温（RT）的 PFA 溶液中。为避免组织损伤，在解剖后切勿使用镊子转移脑组织。所有步骤均在 200 µL PCR 管中进行，并置于摇床上操作。
  2. 所有步骤中，在使用 P200 移液器弃去旧溶液前，需先让脑组织沉降至管底。尽量移除上清液，避免吸入组织。操作过程中需避免组织暴露于光线下。
  3. 用含 2% PFA 的 S2 细胞培养基 200 µL 固定脑组织 1 小时，或用 4% PFA 固定 30 分钟。为提高实验可重复性，各样本间的固定时间应保持一致。
  4. 在 200 µL 成年果蝇脑清洗液中清洗 3 次（每次 15 分钟）后，加入 200 µL 封闭液封闭组织 30 分钟。封闭时间可适当延长。
  5. 将脑组织与用成年果蝇脑清洗液稀释的一抗在 4 °C 下于总体积 200 µL 中孵育过夜。
    注意：孵育时间可能因所用一抗类型不同而有所调整。某些情况下可能需要更长的孵育时间。
    1. 若需标记三种 MCFO 标记物，请使用抗 HA 抗体（1:500）、抗 FLAG 抗体（DYKDDDDK 表位，1:100）和抗 V5 一抗进行孵育。
    2. 可选用直接偶联荧光染料的一抗替代常规的一抗+二抗组合（例如，抗 V5:DyLight 549，1:200）。此时应将直接偶联抗体视为二抗处理。
      注意：对每种基因型，应保留部分脑组织作为对照，以验证染色的特异性。跳过一抗孵育步骤，直接进入下一步。
  6. 用 200 µL 成年果蝇脑清洗液清洗组织 3 次，每次 1 小时（步骤 3.3），随后在 200 µL 总体积中加入用成年果蝇脑清洗液稀释的荧光标记二抗或直接偶联的一抗，在 4 °C 下孵育过夜，或在室温下孵育 4 小时。
    注意：合适的抗体示例包括：AlexaFluor 488（1:250）、抗 V5:DyLight 549（1:200）以及 DyLight 647 偶联抗体（1:100）。
  7. 用 200 µL 成年果蝇脑清洗液清洗脑组织 3 次，每次 1 小时，随后在 4 °C 下用 200 µL PBS 进行最终清洗（过夜），或在室温下清洗 1–2 小时。PBS 的最终清洗步骤可彻底去除 Triton X-100 残留，对获得最佳染色效果至关重要。将脑组织置于含抗荧光淬灭剂的封片剂中，加盖玻片封片。

6. 用于成像的脑组织切片装片

  1. 使用剪刀将成像垫片修剪至合适尺寸。进行高分辨率显微镜观察时，将样本和成像垫片夹在两张玻璃盖玻片之间。
    注意：成像垫片是一种薄型（厚度0.12 mm）粘性垫片，可剥离并粘贴于玻璃盖玻片或载玻片表面，使样本在无压缩状态下固定。
  2. 用镊子去除一侧粘性保护膜，将垫片粘性面向下贴附于一张玻璃盖玻片（22 mm × 60 mm）表面。在另一张新的玻璃盖玻片上加入10 µL封片剂。
  3. 使用P10移液器将脑组织从200 µL离心管转移至盖玻片上，置于封片剂液滴旁。转移组织时需同时带入少量PBS，以保持脑组织处于溶液环境中。
  4. 用P10移液器将脑组织从PBS中转移至封片剂液滴中，尽量减少PBS的带入量。将样本置于含成像垫片的盖玻片上的封片剂中，使用足量封片剂完全覆盖样本。
  5. 去除垫片上侧的另一层粘性保护膜，在样本上方加盖一张玻璃盖玻片。用镊子尖端在粘合区域轻轻施压，确保密封。立即进行成像，或将载玻片储存于-20 °C环境中以备后续分析。

7. 图像采集

  1. 使用共聚焦显微镜配备40倍（数值孔径NA = 1.2，水浸）或63倍（数值孔径NA = 1.4，油浸）物镜获取共聚焦荧光图像的Z轴层扫图像序列（xy平面像素尺寸为1,024 × 1,024；相邻共聚焦切片间距为0.5 µm）。调节每个通道的探测器增益和偏移，确保图像中无饱和像素且无零值像素；这可避免信息丢失，并充分利用探测器的全动态范围。
    注意：由于三维成像耗时较长，可通过在不同位置并行扫描多个样品实现测量自动化。使用水浸物镜时，为防止蒸发，应采用折射率n = 1.33的专用油浸介质。
  2. 使用任何标准图像分析软件对共聚焦图像序列进行最大密度投影处理，并调整通道色调、亮度和对比度（参见材料表）。

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结果

本部分展示了利用 MCFO 技术在成年个体中可获得的结果示例 果蝇 脑 图3 展示了该方法的示意图。在UAS调控下，三种带有不同膜标记的报告基因（myr-smGFP-HA、myr-smGFP-FLAG和myr-smGFP-V5）被两侧带有FRT位点的转录终止序列（FRT-stop-FRT）所抑制而保持沉默。通过热激诱导Flp重组酶的表达，可随机地在单个细胞中切除FRT-stop-FRT片段，从而导致由所使用的GAL4驱动子特异性标记的某一细胞类型中出现多种不同标记的细胞。

总体而言，可以实现七种颜色。 图4 和 图5 显示EG和ALG细胞的单细胞形态 果蝇 触角叶（AL）。延长热激时间可增加标记细胞的数量，...

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讨论

本方案描述了一种在高分辨率下研究目标组织内不同类型细胞形态的简便高效方法。通过MCFO技术，联合使用带有不同表位标签的多种报告基因进行多色随机标记（图2）。与Brainbow/Flybow15,16,17等其他方法类似，MCFO通过标记物的共表达增加标记多样性，从而实现细胞边界的可视化，便于开展细胞间相互作用的研究。例如，使用三种报告基因时，可产生七种可能的标记组合。与以往的标记方法相比，MCFO技术对细胞标记密度的控制更为精确且操作简便17：Flybow 1.0果蝇表达一种默认标记，使单细胞标记更加困难；Flybow 2.0果蝇需要表达两种不同的Flp重组酶，导致系统更为复杂。

根据所使用的特定GAL4驱动子，MCFO技术可被调整用于研究任何发育阶段的任何组织。在此，该技术已被应用于高分辨...

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披露

所有作者均无竞争或利益冲突。

致谢

作者感谢Arnim Jenett、Aljoscha Nern以及Rubin实验室的其他成员提供的建议和未发表试剂的共享，感谢Janelia Fly Light项目团队提供了共聚焦图像。作者还感谢Gaul实验室成员对稿件提出的修改意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
水浴锅GrantGD100
PCR管Sarstedt72.737.002
镊子Dumont11251-20
解剖皿 30 mm × 12 mmElectron Microscopy Sciences70543-30玻璃解剖皿
Pyrex 3孔玻璃点滴板Corning7223-34玻璃解剖板
Sylgard 黑色SYLGARD, Sigma-Aldrich805998自制，含木炭
ExpressFive S2细胞培养基Invitrogen10486-025
20% PFAElectron Microscopy Sciences15713
Triton X-100Roth3051.3
正常山羊血清Jackson Laboratories005-000-121
正常驴血清Jackson Laboratories017-000-121
牛血清白蛋白SigmaA9647
兔抗HA标签抗体Cell SignalingC29F4一抗，稀释比例1:500
大鼠抗FLAG标签抗体Novus BiologicalsNBP1-06712一抗，稀释比例1:100
小鼠抗V5标签:DyLight 549AdSerotec0411偶联抗体，稀释比例1:200
驴抗兔AlexaFluor 488InvitrogenA11034二抗，稀释比例1:250
驴抗大鼠DyLight 647Jackson Laboratories712-605-153二抗，稀释比例1:100
Vecta ShieldVector LaboratoriesH-1000
SlowFate GoldInvitrogenS36937
Secure Seal间隔垫片Grace Biolabs联系公司订购
显微镜盖玻片 22 × 60 mmMarienfeld101152
显微镜盖玻片 22 × 22 mmRothH874
立体显微镜，Leica MZ6Leica
共聚焦激光扫描显微镜 LSM710Zeiss
ImmersolZeiss518 F荧光显微镜用浸油，无卤素
ImmersolZeissW 2010水浸物镜用浸液，无卤素
R56F03-GAL4 (EG)Bloomington Stock Center39157GAL4驱动系
R86E01-GAL4 (ALG)Bloomington Stock Center45914GAL4驱动系
hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5Bloomington Stock Center64085UAS报告基因系（https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php）
Fiji (Image J)图像分析软件
Multi Time MacroZeiss自动扫描软件

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