Method Article

多色 FlpOut 技术在果蝇中的应用研究胶质细胞的高分辨率单细胞形态学

DOI:

10.3791/56177

⸱

October 20th, 2017

 ,  ,  , 
1Gene Center and Department of Biochemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich, 2Janelia Farm Research Campus, Howard Hughes Medical Institute

In This Article

Summary

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细胞表现出不同的形态, 并与它们的邻居建立了各种相互作用。该协议描述了如何揭示单细胞的形态学, 并利用已建立的 Gal4/UAS 表达系统来研究细胞间的相互作用。

Abstract

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细胞表现出不同的形态和复杂的解剖关系。细胞如何与邻居互动？单元格类型之间的交互是否不同, 甚至在给定类型中也有所不同？他们遵循什么样的空间规则？到目前为止, 由于缺乏用于高分辨率单细胞标记的工具, 这些基本问题的答案在体内受到了阻碍。在这里, 提供了一个详细的协议目标单细胞与多色 FlpOut (MCFO) 技术。这种方法依赖于三不同标记的记者 (HA, 旗帜和 V5) 在无人控制, 保持沉默的转录终结者两侧的两个首次登记税网站 (首次登记-停止-首次登记税)。热休克脉冲诱发热休克诱导的 Flp 重组的表达, 它在单个单元格中随机删除了首次登记停用的卡带: 表达仅发生在同时表达 GAL4 驱动程序的单元格中。这将导致一个给定单元格类型的不同颜色的单元格数组, 它允许在高分辨率下可视化单个细胞形态。作为一个例子, MCFO 技术可以结合特定的胶质 GAL4 驱动, 以可视化的形态, 不同的胶质亚型在成年果蝇脑。

Introduction

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神经胶质是神经系统的神经细胞细胞, 长期以来被认为为神经元提供了一个静止的框架, 因此没有得到详细的研究。然而, 在人类中, 胶质细胞在 NS (约 90%) 中占绝大多数, 并分成几个不同的类别, 包括星状细胞、突、小胶质细胞和雪旺电池。在果蝇中, 胶质细胞在 NS 中占10% 左右。有趣的是, 它们的形态和功能与脊椎动物的1,2中发现的非常相似。它们的形态包括血脑屏障 (BBB) 形成上皮细胞、鞘层和星形星状胞。

果蝇中枢神经系统 (CNS) 包括以下主要结构: 包含神经元细胞体的皮层区域;neuropils 那海港突触连接;连接不同 neuropiles 的小的和大的轴突束;与中枢神经系统连接感觉器官和肌肉的外周神经 (图 1)。胶质细胞被发现与所有这些解剖结构相关: 皮质胶质细胞 (CG) 在皮层区, 星形胶质细胞和鞘胶质细胞 (如) 在 neuropile 区, 鞘胶质细胞也与中央轴突和周边神经 (地名), 最后, 两个片状胶质细胞, 膜胶质细胞 (PG) 和 subperineurial (), 其中一起形成一个连续的层覆盖整个 NS (图 2)。

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Protocol

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1. 为多色 FlpOut (MCFO) 实验准备苍蝇

注意: MCFO 技术指的是所谓的 Flp 介导的停止盒式切除 (FlpOut) 的修改版本。转基因 MCFO 蝇携带热休克启动子 (hsp)-Flp 重组和不同的记者在无人控制下。每个记者都由一个 myristoylated (myr) 超级文件夹绿色荧光蛋白 (sfGFP) 的共同骨干组成, 其中10个表位标签 ( e. g ., HA, 旗或 V5) 的副本已经插入。所产生的荧光蛋白的命名和 #34; 意大利面条怪兽协调和 #34; (smGFPs) 14 , 可以使用针对不同表位标记的特定抗体检测到.

  1. 与 MCFO 磁带和 hsp Flp (hsp-Flp; 10 xuas-首次登记税-停止-首次登记税-myr-smGFP-房委会, 10 xuas-首次登记税-停止-首次登记税-myr-smGFP-旗帜, 10 xuas-首次登记-停止-首次登记-myr-smGFP-V5) 到适当的神经胶质 GAL4 驱动程序线.
    1. 由于 hsp 在25和 #176 已处于活动状态; c 和少数细胞可能会进行重组, 导致不标记, 设置十字在18和 #176; c, 以避免系统泄漏。在18和 #176 等待大约20天; C 要获得 F1 生成。在热冲击以后 (参见步骤 2), ....

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Results

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本节说明了在成人果蝇脑中使用 MCFO 技术可以获得的结果的示例。 图 3显示了该方法的示意图。三不同的膜标记的记者 (myr-smGFP-HA, myr-smGFP-旗和 myr-smGFP-V5) 在无人控制系统下, 由两个首次登记税网站 (首次登记-停止-首次登记税) 两侧的转录终结者保持沉默。热休克脉冲诱导 Flp 重组的表达, 它在单个单元格中随机删除了首次登记停用的卡带。这将导致给定单元格类型的不同颜色的单元格数组, 由所使用的 GAL4 驱动程序指定。

总的来说, 七种颜色是可能的。图 4和图 5分别显示了果蝇触角叶 (AL) 中的 EG 和细胞的单一形态。随着热休克时间的增加, 标记细胞的数.......

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Discussion

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该协议描述了一个简单和有效的方法来研究在高分辨率的兴趣组织内的不同细胞类型的形态学。采用 MCFO 技术, 多种不同表位标记的记者组合使用, 用于多色随机标记 (图 2)。与其他方法类似, 如 Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO 通过标记共增加了标签的多样性, 从而使细胞边界的可视化成为细胞间相互作用的研究。例如, 有三记者, 七潜在的标记组合是可能的。与以前的标记方法相比, MCFO 技术显示了一个更精确和易于控制的细胞标记密度17: Flybow 1.0 苍蝇表达一个默认的标记, 使单细胞标签更困难;Flybow 2.0 苍蝇需要两个不同的 Flp recombinases 的表达, 使系统更加复杂。

根据所使用的特定 GAL4 驱动程序, MCFO 技术可以适应.......

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Disclosures

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没有一个作者有竞争或相互冲突的利益。

Acknowledgements

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作者感谢 Arnim Jenett, Aljoscha 海滨, 和鲁宾实验室的其他成员的建议和共享的未发表的试剂和 Janelia 飞光项目组产生共焦图像。作者还感谢高卢实验室的成员对手稿的评论。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
水浴GrantGD100
PCR 管Sarstedt72.737.002
镊子Dumont11251-20
解剖皿 30 mm x 12 mmm电子显微镜科学70543-30玻璃解剖皿
Pyrex 3 凹陷玻璃点板Corning7223-34玻璃解剖板
Sylgard BlackSYLGARD， Sigma-Aldrich805998自制木炭
ExpressFive S2 细胞培养基Invitrogen10486-025
20% PFA电子显微镜科学15713
Triton X-100Roth3051.3
正常山羊血清Jackson Laboratories005-000-121
正常驴血清Jackson Laboratories017-000-121
牛血清白蛋白SigmaA9647
兔 HA 标签细胞信号传导C29F4一抗，稀释度 1：500
大鼠 FLAG 标签Novus BiologicalsNBP1-06712一抗，稀释度 1：100
小鼠 V5 标签：DyLight 549AdSerotec0411偶联抗体，稀释度 1：200
抗兔 AlexaFluor 488InvitrogenA11034二抗，稀释度 1：250
抗大鼠 DyLight 647Jackson Laboratories712-605-153二抗，稀释度 1：100
Vecta ShieldVector LaboratoriesH-1000
SlowFate GoldInvitrogenS36937
安全密封垫片Grace Biolabs联系公司订购
显微镜盖玻片 22 X 60 毫米Marienfeld101152
显微镜盖玻片 22 x 22 毫米RothH874
体视显微镜，徕卡 MZ6徕卡
共聚焦激光扫描显微镜 LSM710蔡司
Immersol蔡司518 F用于荧光显微镜的浸油，无卤素
ImmersolZeissW 2010用于水浸物镜的浸没液，无卤素
R56F03-GAL4 （EG）布卢明顿库存中心39157GAL4 驱动器
R86E01-GAL4 （ALG）布卢明顿库存中心45914GAL4 驱动器
hspFlpPestOpt;UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA， UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG， UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5布卢明顿股票中心64085UAS reporter （https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php）
斐济 （Image J）图像分析软件
自动扫描的Multitime MacroZeiss
用于 软件

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Freeman, M. R., Doherty, J. Glial cell biology in Drosophila and vertebrates. Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).
  2. Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. Analysis of glial cell development and function in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (20....

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MultiColor FlpOut TechniqueSingle Cell MorphologiesGlial Cell InteractionsDrosophila BrainHeat Shock InductionFLP RecombinaseUAS Control SystemGAL4 DriversEpitope Tag ReportersImmunofluorescence Staining

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