简单去除福尔马林固定人脑组织中背景荧光以进行免疫荧光显微镜检测

摘要

生物样本的背景自发荧光常常使基于荧光的成像技术复杂化，尤其是在老年个体的终末分化组织中尤为明显。本方案描述了如何利用市售的发光二极管光源，在免疫染色前对样本进行光漂白，从而有效去除这些样本中的自发荧光。

摘要

免疫荧光是一种常用的方法，用于观察亚细胞结构并确定特定蛋白质在组织样本中的定位。获得高质量免疫荧光图像的一个主要障碍是组织自身的内源性自发荧光，这种自发荧光可能由衰老相关色素（如脂褐素）引起，也可能源于常见的样本制备过程（例如醛类固定）。本方案描述了一种在使用荧光探针前，利用白色磷光体发光二极管（LED）阵列进行光漂白以显著降低背景荧光的方法。白色磷光体LED的宽谱发射特性可实现对多种发射峰范围内的荧光分子进行漂白。该光漂白装置可由市售组件以极低成本组装而成，为商业化的化学淬灭剂提供了一种经济且易于获取的替代方案。在组织样本进行光漂白预处理后再实施常规免疫荧光染色，可获得无背景自发荧光干扰的图像。与已有的化学淬灭剂（会同时降低探针信号和背景信号）相比，光漂白处理在有效减少背景荧光和脂褐素荧光的同时，对探针荧光强度无任何影响。尽管光漂白预处理所需时间较长，但可通过使用更高强度的LED阵列来缩短处理时间。这一简单方法有望应用于多种组织，特别是易于积累脂褐素的终末分化组织，如脑组织以及心肌或骨骼肌。

引言

利用靶向特定蛋白质的抗体进行荧光显微成像，是细胞培养和组织中可视化目标蛋白的常规方法。免疫荧光成像中获得清晰明确图像的主要障碍之一是自发荧光（autofluorescence），其可由哺乳动物组织内源性因素引起，例如衰老色素脂褐素（lipofuscin）以及弹性蛋白（elastin）和胶原蛋白（collagen）^1,2。其他自发荧光来源可能来自样本制备过程中的步骤，例如醛类固定³。脂褐素颗粒主要由氧化修饰的蛋白质和脂质降解残基组成，会随着年龄增长而在长寿命细胞中逐渐积累²。这给终末分化组织（如脑组织以及心肌或骨骼肌）的成像带来困难，因为脂褐素的荧光发射光谱宽且多变，常与常用于标记的荧光染料的发射波长重叠⁴。这些因素使得晚发性神经退行性疾病（如额颞叶变性（frontotemporal lobar degeneration, FTLD））患者脑组织的人类样本成像尤为具有挑战性。

为了降低自发荧光，我们设计了一种技术，使用家用台灯中的白色发光二极管（LED）阵列照射载玻片上的组织切片⁵。这种简单的方法可替代使用化学淬灭剂（如醋酸铵中的CuSO₄）或市售淬灭....

方案

注意：本研究所进行的工作均符合公认的国际标准，包括国际人用药品注册技术协调会（ICH）、国际医学科学组织理事会（CIOMS）以及《赫尔辛基宣言》的原则。使用人体组织已获得大学健康网络研究伦理委员会的批准。人脑样本作为大西洋地区脑组织库的一部分进行收集。在样本采集时，已从所有患者处获得知情同意。

1. 光漂白装置的构建与溶液配制

1. 配制储备液。
   1. 通过将8.77 g NaCl和6.06 g Tris碱溶解于800 mL去离子水（ddH₂O）中，配制1 L的1×储存液Tris缓冲盐水（1× TBS）溶液（150 mM NaCl，50 mM Tris-Cl，pH 7.4），用HCl调节pH至7.4。定容至1 L后进行高压灭菌。
   2. 通过将1 g叠氮化钠溶解于10 mL去离子水（ddH₂O）中，配制10%（200×储存液）的叠氮化钠溶液（10%，200×储存液）。
2. 对于1–3张标准尺寸的载玻片，使用一个100 mm × 100 mm透明方形培养皿作为载片室。对于单个载片室，将0.25 mL的200×叠氮化钠储存液加入50 mL的1× TBS中，配制成含0.05%叠氮化钠的TBS溶液（azide-TBS）。若需处理更多载玻片，可将2–3个载片室垂直堆叠。每个载片室额外准备50 mL azide-TBS溶液。
3. 制作支....

结果

在抗原修复和免疫染色之前，可将光漂白预处理步骤加入标准的免疫荧光实验流程（图1A）。光漂白装置的组装也可使用多种价格低廉、市售可得的组件完成（图1B）。白色磷光LED的发射光谱覆盖了较宽的波长范围，因此适用于广谱光漂白，这与先前报道的结果一致（图1C）^5,11。在对FTLD-T未染色切片进行48小时光漂白后，模拟脂褐素的自发荧光颗粒以及整体背景荧光在两个发射波长下的强度均显著降低（图1D）。为验证光漂白的效果，我们采用两种不同的二抗对FTLD-T病例中的病理性tau蛋白包涵体进行高磷酸化tau染色。tau包涵体的明确形态以及两种发色团的联合标记有助于我们可靠地区分自发荧光特征与目标信号，从而验证该技术的有效性。

.......

讨论

本文所述的组织光漂白预处理方法可利用现成组件有效消除自发荧光。该方案描述了使用偶联Alexa 488和Texas Red的二抗，以及DAPI作为细胞核复染剂，对福尔马林固定的人脑组织中磷酸化tau蛋白聚集体进行免疫荧光成像。若将该方法应用于其他组织，我们建议以48小时的光漂白预处理作为起始条件。光漂白后，按照制造商推荐的抗体稀释比例，对目标结构执行标准的免疫荧光染色流程。如果背景荧光仍然存在，则需要调整光漂白时间或抗体染色步骤。光漂白的持续时间将根据所选光源装置及样品中自发荧光的水平而有所不同，每种独特的光源装置均需确定其最佳漂白时间。可通过将未染色、封片并置于TBS-叠氮化钠中的组织切片进行光漂白，并在荧光显微镜下每隔12小时测量切片的内源性荧光来实现优化。在以往的研究中，我们通过颗粒分析和指数衰减函数拟合来监测脂褐素的光漂白过程⁵，但为简便起见，定期肉眼观察切片也可有效判断大部分荧光被淬灭所需的时间。以富含大量脂褐素色素的老化脑组织为例，使用800 lux光源照射48小时已足够充分。若光漂白后特异性信号仍较弱，可考虑在染色过程中提高一抗和二抗的浓度。同时，进行仅使用二抗的对照实验至关重.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Trizma 碱	Sigma-Aldrich	T6066
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653
盐酸	Caledon 实验室化学品公司	1506656
叠氮化钠	BioShop 加拿大公司	SAZ001
100 mm × 100 mm × 20 mm 培养皿	Sarstedt	82.9923.422	光漂白装置的所有组件可根据可获得性进行替换
6 W 可调光 LED 台灯	DBPower	DS501	光漂白装置的所有组件可根据可获得性进行替换
柠檬酸	Sigma-Aldrich	C-2404
乙二胺四乙酸 (EDTA)	BioShop 加拿大公司	EDT001
Tween 20	Sigma-Aldrich	P-7949
氢氧化钠	BioShop 加拿大公司	SHY700.1
水浴锅	Haake Fisons	K15
载玻片架	FisherScientific	12-587-17B
染色缸	FisherScientific	E94
旋转摇床	Bellco 玻璃公司	7744-08115
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T7878
牛血清白蛋白	FisherScientific	BP1600-1
正常山羊血清	Aurion	905.002
疏水笔	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
磷酸化 Tau 蛋白单克隆抗体（Ser202, Thr205）(AT8)	ThermoFisher	MN1020
山羊抗小鼠二抗，Texas Red-X	ThermoFisher	T862
山羊抗小鼠二抗，Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-11029
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
封片剂	ThermoScientific	28-600-42
玻璃盖玻片
共聚焦显微镜	Zeiss	LSM710
成像软件 ZEN 2012 黑色版 11.0	Zeiss	LSM710	软件随共聚焦显微镜提供
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
RGB 配置文件工具宏	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt
商用化学淬灭剂	Biotum	23007