方法文章

荧光显微镜下福尔马林固定人脑组织背景荧光的简单消除

DOI：

10.3791/56188

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2017年9月3日

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1Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 2Department of Biochemistry, University of Toronto

本文内容

摘要

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生物样品的背景自发荧光常常使荧光成像技术复杂化, 特别是在老年人类 postmitotic 组织中。本协议描述了如何有效地去除这些样品的自体荧光, 利用商业上可用的发光二极管光源在免疫之前 photobleach 样品。

摘要

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免疫荧光法是一种常见的方法, 用于可视化亚细胞室和确定特定的蛋白质在组织样本的定位。高品质免疫荧光图像获取的一个很大的障碍是由衰老色素引起的组织内源性自发荧光, 如褐或普通的样品制备过程, 如醛固定。该协议描述了如何通过使用荧光探针处理前的白光发光二极管 (LED) 阵列, 大大降低背景荧光的漂白。白色荧光粉发光二极管的 broad-spectrum 排放允许在一系列的发射峰上漂白荧光。漂白设备可以从现成的组件, 以非常低的成本, 并提供了一个可供选择的商业可用的化学剂。漂白前处理的组织和常规免疫荧光染色产生的图像没有背景自发荧光。与已建立的化学剂相比, 降低探针和背景信号, 漂白处理对探针荧光强度没有影响, 有效降低了背景和褐荧光。虽然漂白需要更多的时间进行预处理, 但更高强度的 LED 阵列可以用来减少漂白时间。这种简单的方法可能适用于各种组织, 特别是 postmitotic 组织, 积累褐, 如大脑和心脏或骨骼肌肉。

引言

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荧光显微镜使用的抗体靶向特定的蛋白质是常规用于可视化蛋白的兴趣在细胞培养和组织。一个主要的并发症, 以获取清晰和明确的图像在免疫荧光是自发荧光, 这可以导致内哺乳动物组织的年龄色素褐和蛋白质, 如弹性蛋白和胶原蛋白1, 2。其他来源的自发荧光可以通过样品制备步骤, 如醛固定3。褐颗粒, 主要由氧化修饰蛋白和脂质降解残留物组成, 在运行细胞中积累, 年龄增加了2。这会导致成像 postmitotic 组织如大脑和心脏或骨骼肌肉的困难, 因为褐的荧光发射谱是广泛的和可变的, 往往与共同荧光的发射波长, 用于标记4。这些因素使人类脑组织的成像从晚发性神经退行性疾病, 如颞肺叶变性 (FTLD), 特别是挑战。

为了减少自发荧光, 我们设计了一种技术, 我们使用一盏家用台灯5, 用白色发光二极管 (LED) 阵列对滑动安装的组织切片进行照射。这种简单的技术提供了一种替代技术, 使用化学剂, 如丘索4在醋酸铵, 或商业可用的淬火染料, 如苏丹黑 B 和铬黑 T6。它还具有显著的成本节约多光谱 LED 灯漂白技术,....

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方案

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注意: 所介绍的工作是按照公认的国际标准执行的, 包括国际协调会议 (理事会)、国际医学组织理事会和《赫尔辛基宣言》的原则。人体组织的使用是由大学卫生网络研究伦理委员会批准的。人脑标本被收集为海洋脑组织库的一部分。在收集时, 所有患者均获得了知情同意.

1. 漂白设备和解决方案的构造

  1. 准备库存解决方案。
    1. 准备 1 L 1x 库存三缓冲盐水 (1x tb) 溶液 (150 毫米氯化钠, 50 毫米三氯, ph 7.4) 溶解8.77 克氯化钠和6.06 克的三基在800毫升的 ddH 2 O, 并调整 ph 值为7.4 使用 HCl. 把音量调到1升和高压釜。李 >
    2. 准备 10% (200x 股) 叠氮化钠, 在10毫升 ddH 2 O (10%, 200x 库存) 溶解1克叠氮化钠.
  2. 对于1-3 标准大小的幻灯片, 使用单个 100 mm x 100 mm 透明的方形培养皿作为滑动腔。对于一个单一的滑动室, 增加0.25 毫升的200x 钠叠氮化物到50毫升的 1x tbs, 使0.05% 叠氮化-tbs 解决方案。堆叠2-3 幻灯片室垂直处理其他幻灯片。为每个腔室准备另外50毫升的叠氮化-TBS 溶液.
  3. 创建一个脚手架, 以提高幻灯片室 (s), 使灯头可以容纳在下面。

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结果

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在抗原检索和免疫 (图 1A) 之前, 漂白预处理步骤可以添加到标准免疫荧光协议中。漂白设备的组装也可以使用各种廉价的现成组件 (图 1B) 进行。白色荧光粉发光二极管的发射光谱涵盖了宽范围的波长, 使它们适合广泛的漂白, 同意以前的报告 (图 1C)5,11。在 48 h 漂白, autofluorescent 斑点的强度类似褐以及一般背景荧光在两个发射波长大大减少了不部分 FTLD t (图 1D)。为了证明漂白的功效, 我们用两种不同的二次抗体对 hyperphosphorylated 头进行染色, 以显示病变的头夹杂物 FTLD。不同形状的 tau 夹杂和使用两个团的标签也使我们能够自信地区分 autofluor.......

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讨论

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本手稿中所描述的组织的漂白预处理可以有效地消除使用现成组件的荧光。该协议描述了在福尔马林固定的人脑组织中磷酸化 tau 集料的免疫荧光成像, 使用继发性抗体共轭于 Alexa 488 和得克萨斯州红, DAPI 作为核 counterstain。为了将该方法应用于其他组织, 我们建议对样品进行48漂白前处理, 作为出发点。漂白后, 执行标准的免疫荧光染色协议的特点, 使用抗体稀释根据制造商的建议。如果背景荧光仍然存在, 漂白持续时间和/或抗体染色步骤需要修改。漂白的持续时间将根据所选择的灯具结构和样品中的自发荧光水平而变化。必须确定每个独特灯具的最佳漂白时间。这可以通过漂白一个不, coverslipped 组织切片安装在 TBS-叠氮化物和测量的内源荧光的幻灯片12小时间隔使用荧光显微镜。在以前的报告中, 我们监测褐漂白的粒子分析和曲线拟合指数衰减函数5, 但为了简单起见, 对各节定期进行目视观察可以同样有效地判断大部分荧光猝灭的持续时间。在我们的情况下, 老年脑组织含有大量的褐色素, 48 h 孵化与800勒克斯灯是足够的。如果与漂白后的背景相比, 特定信号仍然较弱, 考虑在染色过程中.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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这项研究得到了加拿大神经和老龄协会 (CCNA)、加拿大卫生研究所 (研究院)、加拿大 als 协会 (加拿大) 和加拿大阿尔茨海默氏症协会 (ASC) 的全部或部分支持。作者想感谢来自海洋脑组织的苏丹 Darvesh 和安德鲁 Reid 提供 FTLD 的脑组织, 米兰 Ganguly 从时空目标和放大辐射响应 (STTARR) 计划及其附属用于组织植入和切片服务的供资机构, 以及提供显微仪器的先进光学显微镜设备 (AOMF)。凯文. 哈德利对手稿的评论非常感谢。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Trizma BaseSigma-AldrichT6066
氯化钠Sigma-AldrichS7653
盐酸Caledon 实验室化学品1506656
氮化钠BioShop 加拿大SAZ001
100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri 培养皿Sarstedt82.9923.422光漂白器的所有组件都可以根据可用性进行替换
6 W LED可调光台灯DBPowerDS501光漂白器的所有组件都可以根据可用性进行替换
柠檬酸Sigma-AldrichC-2404
乙二胺四乙酸 （EDTA）BioShop CanadaEDT001
吐温 20Sigma-AldrichP-7949
氢氧化钠BioShop CanadaSHY700.1
水浴Haake FisonsK15
载玻片收集器FisherScientific12-587-17B
染色罐FisherScientificE94
轨道摇床Bellco 玻璃 7744-08115
Triton X-100Sigma-AldrichT7878
牛血清白蛋白FisherScientific BP1600-1
正常山羊血清Aurion905.002
疏水笔Sigma-AldrichZ672548-1EA
磷酸化 Tau （Ser202， Thr205） 单克隆抗体 （AT8）ThermoFisherMN1020
山羊抗小鼠二抗，Texas Red-XThermoFisherT862
山羊抗小鼠二抗，Alexa Fluor 488ThermoFisherA-11029
DAPISigma-AldrichD9542
封固剂ThermoScientific28-600-42
玻璃滑片
共聚焦显微镜蔡司LSM710
成像软件 ZEN 2012 黑色版 11.0蔡司LSM710软件 共聚焦显微镜
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
RGB 轮廓工具 宏NIHhttps://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt
商用化学淬灭仪Biotum23007
叠 系列

参考文献

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  1. Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).
  2. Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin . Int J Biochem Cell Biol. 36 (8), 1400-1404 (2004).....

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PhotobleachingLED Desk LampAutofluorescence ReductionFormalin Fixed TissueFluorescence MicroscopyAntigen RetrievalLipofuscin Quenching

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