生物样本的背景自发荧光常常使基于荧光的成像技术复杂化，尤其是在老年个体的终末分化组织中尤为明显。本方案描述了如何利用市售的发光二极管光源，在免疫染色前对样本进行光漂白，从而有效去除这些样本中的自发荧光。
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摘要
摘要
免疫荧光是一种常用的方法，用于观察亚细胞结构并确定特定蛋白质在组织样本中的定位。获得高质量免疫荧光图像的一个主要障碍是组织自身的内源性自发荧光，这种自发荧光可能由衰老相关色素（如脂褐素）引起，也可能源于常见的样本制备过程（例如醛类固定）。本方案描述了一种在使用荧光探针前，利用白色磷光体发光二极管（LED）阵列进行光漂白以显著降低背景荧光的方法。白色磷光体LED的宽谱发射特性可实现对多种发射峰范围内的荧光分子进行漂白。该光漂白装置可由市售组件以极低成本组装而成，为商业化的化学淬灭剂提供了一种经济且易于获取的替代方案。在组织样本进行光漂白预处理后再实施常规免疫荧光染色，可获得无背景自发荧光干扰的图像。与已有的化学淬灭剂（会同时降低探针信号和背景信号）相比，光漂白处理在有效减少背景荧光和脂褐素荧光的同时，对探针荧光强度无任何影响。尽管光漂白预处理所需时间较长，但可通过使用更高强度的LED阵列来缩短处理时间。这一简单方法有望应用于多种组织，特别是易于积累脂褐素的终末分化组织，如脑组织以及心肌或骨骼肌。
引言
利用靶向特定蛋白质的抗体进行荧光显微成像，是细胞培养和组织中可视化目标蛋白的常规方法。免疫荧光成像中获得清晰明确图像的主要障碍之一是自发荧光（autofluorescence），其可由哺乳动物组织内源性因素引起，例如衰老色素脂褐素（lipofuscin）以及弹性蛋白（elastin）和胶原蛋白（collagen）1,2。其他自发荧光来源可能来自样本制备过程中的步骤，例如醛类固定3。脂褐素颗粒主要由氧化修饰的蛋白质和脂质降解残基组成，会随着年龄增长而在长寿命细胞中逐渐积累2。这给终末分化组织（如脑组织以及心肌或骨骼肌）的成像带来困难，因为脂褐素的荧光发射光谱宽且多变，常与常用于标记的荧光染料的发射波长重叠4。这些因素使得晚发性神经退行性疾病（如额颞叶变性（frontotemporal lobar degeneration, FTLD））患者脑组织的人类样本成像尤为具有挑战性。
为了降低自发荧光，我们设计了一种技术，使用家用台灯中的白色发光二极管（LED）阵列照射载玻片上的组织切片5。这种简单的方法可替代使用化学淬灭剂（如醋酸铵中的CuSO4）或市售淬灭染料（如苏丹黑B和偶氮黑T）的技术6。此外，该方法相比多光谱LED灯的光漂白技术显著降低了成本，并避免了光谱解混等数字自发荧光去除方法所带来的复杂性和伪影7,8。白色磷光LED具有宽发射光谱、高亮度和低制造成本的优点，使其成为漂白多种发色团的理想现成组件5,9。
在本实验方案中，我们展示了如何使用易得的组件构建光漂白装置，并应用该装置对含有tau蛋白阳性包涵体的额颞叶变性组织（FTLD-T）进行光漂白处理，所用抗体特异性识别磷酸化tau蛋白。我们评估了光漂白对两种常用荧光染料Alexa 488和Texas Red标记的荧光抗体成像效果的影响。同时，定量比较了经光漂白处理的样本与未经处理样本或经商用化学淬灭剂处理样本之间的差异。这种光漂白预处理步骤可整合到任何标准的免疫荧光染色流程中，以去除生物样本中的自发荧光。
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方案
注意：本研究所进行的工作均符合公认的国际标准，包括国际人用药品注册技术协调会（ICH）、国际医学科学组织理事会（CIOMS）以及《赫尔辛基宣言》的原则。使用人体组织已获得大学健康网络研究伦理委员会的批准。人脑样本作为大西洋地区脑组织库的一部分进行收集。在样本采集时，已从所有患者处获得知情同意。
1. 光漂白装置的构建与溶液配制
- 配制储备液。
- 通过将8.77 g NaCl和6.06 g Tris碱溶解于800 mL去离子水（ddH2O）中，配制1 L的1×储存液Tris缓冲盐水（1× TBS）溶液（150 mM NaCl，50 mM Tris-Cl，pH 7.4），用HCl调节pH至7.4。定容至1 L后进行高压灭菌。
- 通过将1 g叠氮化钠溶解于10 mL去离子水（ddH2O）中，配制10%（200×储存液）的叠氮化钠溶液（10%，200×储存液）。
- 对于1–3张标准尺寸的载玻片，使用一个100 mm × 100 mm透明方形培养皿作为载片室。对于单个载片室，将0.25 mL的200×叠氮化钠储存液加入50 mL的1× TBS中，配制成含0.05%叠氮化钠的TBS溶液（azide-TBS）。若需处理更多载玻片，可将2–3个载片室垂直堆叠。每个载片室额外准备50 mL azide-TBS溶液。
- 制作支架，用于抬高载片室，以便灯头可置于其下方。
- 对于100 mm × 100 mm的载片室，裁剪一个100 mm × 100 mm × 30 mm塑料食品盒的底部和侧面，形成开口，并将该盒倒置。确保侧面开口足够大以容纳LED光源，底部开口足够大，使光源发出的光可无障碍地照射到样品室。
- 在支架表面缠绕电工胶带，以增加支架与载片室或实验台之间的摩擦力。可使用其他替代材料构建支架，只要能稳固抬高载片室且不阻碍光线照射样品即可。
- 移除台灯上可能阻碍LED光直接照射样品的扩散器或不透明塑料（如可行），并将LED阵列朝上放置。将支架及载片室置于LED阵列上方。建议使用带有柔性灯颈的台灯，以便于调节位置。
- 通过用铝箔包裹一个足够覆盖载片室和支架的盒子内壁，为装置制作一个反光穹顶盖。单个载片室可使用1 mL移液器吸头盒，多个垂直堆叠的载片室则使用150 mm × 150 mm × 150 mm的纸板箱。
2. 组织切片的光漂白预处理
注意：组织切片的制备可能因组织来源以及所使用的固定和包埋方法不同而有所差异。本实验中，额颞叶变性-T（FTLD-T）病例的脑组织（眶额回）经福尔马林固定约2天，随后进行蔗糖梯度脱水，OCT包埋，并使用冷冻切片机切成10 µm厚的切片。
- 在4 ºC的冷室、冷柜或冰箱中，将灯置于支架下方，并将样品室放置在支架上。向样品室中加入50 mL叠氮化物-TBS溶液。
- 使用洁净的镊子将固定在标准玻璃显微镜载玻片上的组织切片浸入含有叠氮化物-TBS的切片盒中。若处理多个载玻片，需确保载玻片在盒内呈单层放置。
- 用反射罩盖住装置，打开LED灯，并在4 ºC下孵育48小时。
3. 免疫荧光
- 使用 DAPI 复染以及 Alexa 488 和 Texas Red 标记的二抗对组织进行磷酸化 tau 蛋白染色时，首先配制抗原修复、通透、封闭和一抗结合所需的溶液。
- 通过将 0.92 g 柠檬酸和 0.37 g 乙二胺四乙酸（EDTA）溶解于 500 mL 去离子水（ddH2O）中，配制 500 mL 抗原修复缓冲液（10 mM 柠檬酸，2 mM 乙二胺四乙酸，0.05% Tween 20；pH 6.2）。用 NaOH 调节 pH 至 6.2，并加入 0.25 mL Tween 20。
- 向 500 mL 1× TBS 中加入 0.125 mL Triton X-100，配制 500 mL 含 0.025% Triton X-100 的 TBS 溶液（TBS-Triton）。
- 将 0.1 g 牛血清白蛋白（BSA）溶解于 10 mL TBS 中，配制 1% 牛血清白蛋白（BSA）的 TBS 溶液（BSA-TBS 缓冲液）。
- 向 1.8 mL 1% BSA/TBS 溶液中加入 0.2 mL 正常山羊血清，配制封闭液。
- 对于每张切片，通过移液枪吸取 1.5 µL 抗磷酸化 PHF-tau pSer202 + Thr205（AT8）抗体加入 148.5 µL 1% BSA-TBS 缓冲液中，配制 150 µL 一抗溶液（1:100 稀释），置于冰上备用。
- 进行抗原修复时，将光漂白后的切片垂直浸入含有 25 mL 抗原修复缓冲液的切片架中。用胶带或绳子固定切片架，防止其落入水浴锅中。将切片架置于 90 ºC 水浴中加热 30 分钟，随后在室温下冷却 30 分钟后再取出切片。切勿立即取出切片，以免组织切片干燥。
- 将切片从抗原修复切片架转移至装有 30 mL TBS-Triton 的染色缸中，在旋转摇床上以轻柔振荡方式洗涤 5 分钟。更换新鲜 TBS-Triton 后重复洗涤一次。用无绒纸巾吸去多余缓冲液，并用疏水笔圈出组织区域。注意避免切片干燥。
- 对于每张切片，向组织上滴加 200 µL 封闭液进行封闭，然后将切片放入湿盒中。通过将切片架置于含有湿润纸巾的移液枪头盒内构建湿盒。在水平台面上室温孵育 2 小时。确保封闭液完全覆盖组织。
- 用抽吸法去除封闭液，向组织上滴加 100–150 µL 一抗溶液。确保抗体体积充足，并将切片置于水平面上，以避免抗体溶液向一侧聚集。在湿盒中 4 ºC 过夜孵育。
- 配制二抗混合液和 DAPI 核复染液。
- 对于每张切片，向 147 µL BSA-TBS 中加入 1.5 µL 山羊抗小鼠 Alexa 488 和 1.5 µL 山羊抗小鼠 Texas Red，配制 150 µL 二抗混合液（1:100 稀释），置于冰上备用。
- 通过系列稀释配制 0.1 µg/mL DAPI 复染液。充分混匀储备液，取 1 µL 5 mg/mL DAPI 储备液加入 999 µL TBS 中，配制成 1 mL 5 µg/mL 溶液。对于每张切片，取 3 µL 5 µg/mL 溶液与 147 µL TBS 混合，终浓度为 0.1 µg/mL。
注意：DAPI 为已知诱变剂，操作时应谨慎。
- 用抽吸法去除一抗，将切片浸入装有 30 mL TBS-Triton 的玻璃染色缸中，在旋转摇床上以轻柔振荡方式洗涤 5 分钟。更换新鲜 TBS-Triton 后重复洗涤一次。吸去多余 TBS-Triton，向每张切片滴加 100 至 150 µL 二抗混合液。
- 确保组织被抗体混合液完全覆盖。在湿盒中避光、室温孵育 2 小时。
- 用抽吸法去除二抗混合液，将切片转移至装有 30 mL TBS（不含 Triton）的玻璃染色缸中，在旋转摇床上以轻柔振荡方式洗涤 5 分钟。更换新鲜 TBS 后重复洗涤一次。向每张切片滴加 100 至 150 µL 0.1 µg/mL DAPI 复染液，避光、室温孵育 10 分钟。
- 将切片转移至装有 TBS 的玻璃染色缸中，每次用新鲜 TBS 洗涤 5 分钟，共洗涤 3 次，每次均轻柔振荡。吸去多余缓冲液。
- 向组织上滴加 3 滴水溶性封片剂。用镊子夹取洁净的玻璃盖玻片，从一侧边缘开始，缓慢放下另一侧，以避免产生气泡。若需立即成像，请注意勿移动盖玻片。否则，应在暗处 4 ºC 保存前让封片剂自然干燥。
4. 荧光显微镜
- 打开荧光灯、显微镜和计算机，让灯预热15分钟。将染色的组织切片放置在荧光显微镜载物台上。使用明场图像在10倍放大倍数下定位组织。
- 在盖玻片表面滴加一滴ddH2O，使用20倍水浸物镜（NA=1.0）。选择四线平均平面扫描模式。将针孔大小设置为1个艾里单位，以获得约3微米的光学切片。为每种荧光染料在独立的通道中选择相应的激光激发和发射波长，以获得最佳信号。
注意：Alexa 488：λex = 488 nm（氩离子激光器），λem = 493–570 nm；Texas Red：λex = 561 nm（DPSS 561 nm激光器），λem = 601–635 nm；DAPI：λex = 405 nm（二极管405 nm激光器），λem = 410–507 nm。- 调节激光功率和增益设置，以优化每个通道的信号强度。采集复合图像并保存。使用相同的激光设置来比较不同切片中的荧光强度。
- 为了可视化各通道中的荧光强度，请为ImageJ安装RGB轮廓工具宏10。将网页上的宏保存为文本文件（https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt）。在ImageJ菜单中，选择插件 -> 宏 -> 安装；选择该文本文件以安装RGB轮廓工具。
- 在ImageJ中打开共聚焦图像文件，并通过以下步骤将来自三个图层的复合图像转换为RGB格式：图像 -> 颜色 -> 通道工具。从下拉菜单中选择"复合图像"，并勾选所有三个通道。然后选择图像 -> 类型 -> RGB颜色。
- 选择RGB轮廓工具图标，在图像中需要分析的区域上画一条线。将强度数据保存为电子表格以便作图。
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结果
在抗原修复和免疫染色之前，可将光漂白预处理步骤加入标准的免疫荧光实验流程（图1A）。光漂白装置的组装也可使用多种价格低廉、市售可得的组件完成（图1B）。白色磷光LED的发射光谱覆盖了较宽的波长范围，因此适用于广谱光漂白，这与先前报道的结果一致（图1C）5,11。在对FTLD-T未染色切片进行48小时光漂白后，模拟脂褐素的自发荧光颗粒以及整体背景荧光在两个发射波长下的强度均显著降低（图1D）。为验证光漂白的效果，我们采用两种不同的二抗对FTLD-T病例中的病理性tau蛋白包涵体进行高磷酸化tau染色。tau包涵体的明确形态以及两种发色团的联合标记有助于我们可靠地区分自发荧光特征与目标信号，从而验证该技术的有效性。
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讨论
本文所述的组织光漂白预处理方法可利用现成组件有效消除自发荧光。该方案描述了使用偶联Alexa 488和Texas Red的二抗，以及DAPI作为细胞核复染剂，对福尔马林固定的人脑组织中磷酸化tau蛋白聚集体进行免疫荧光成像。若将该方法应用于其他组织，我们建议以48小时的光漂白预处理作为起始条件。光漂白后，按照制造商推荐的抗体稀释比例，对目标结构执行标准的免疫荧光染色流程。如果背景荧光仍然存在，则需要调整光漂白时间或抗体染色步骤。光漂白的持续时间将根据所选光源装置及样品中自发荧光的水平而有所不同，每种独特的光源装置均需确定其最佳漂白时间。可通过将未染色、封片并置于TBS-叠氮化钠中的组织切片进行光漂白，并在荧光显微镜下每隔12小时测量切片的内源性荧光来实现优化。在以往的研究中，我们通过颗粒分析和指数衰减函数拟合来监测脂褐素的光漂白过程5，但为简便起见，定期肉眼观察切片也可有效判断大部分荧光被淬灭所需的时间。以富含大量脂褐素色素的老化脑组织为例，使用800 lux光源照射48小时已足够充分。若光漂白后特异性信号仍较弱，可考虑在染色过程中提高一抗和二抗的浓度。同时，进行仅使用二抗的对照实验至关重...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由加拿大神经退行性疾病与老龄化联盟（CCNA）、加拿大卫生研究院（CIHR）、加拿大肌萎缩侧索硬化症协会（ALS Canada）以及加拿大阿尔茨海默病协会（ASC）全部或部分资助。作者谨此感谢来自大西洋地区脑组织库的 Sultan Darvesh 和 Andrew Reid 提供 FTLD 脑组织样本，感谢来自时空靶向与辐射反应放大（STTARR）项目及其相关资助机构的 Milan Ganguly 提供组织包埋与切片服务，并感谢先进光学显微镜设施（AOMF）提供显微镜设备。同时感谢 Kevin Hadley 对稿件的审阅与宝贵意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Trizma 碱 | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| 盐酸 | Caledon 实验室化学品公司 | 1506656 | |
| 叠氮化钠 | BioShop 加拿大公司 | SAZ001 | |
| 100 mm × 100 mm × 20 mm 培养皿 | Sarstedt | 82.9923.422 | 光漂白装置的所有组件可根据可获得性进行替换 |
| 6 W 可调光 LED 台灯 | DBPower | DS501 | 光漂白装置的所有组件可根据可获得性进行替换 |
| 柠檬酸 | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| 乙二胺四乙酸 (EDTA) | BioShop 加拿大公司 | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| 氢氧化钠 | BioShop 加拿大公司 | SHY700.1 | |
| 水浴锅 | Haake Fisons | K15 | |
| 载玻片架 | FisherScientific | 12-587-17B | |
| 染色缸 | FisherScientific | E94 | |
| 旋转摇床 | Bellco 玻璃公司 | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| 牛血清白蛋白 | FisherScientific | BP1600-1 | |
| 正常山羊血清 | Aurion | 905.002 | |
| 疏水笔 | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| 磷酸化 Tau 蛋白单克隆抗体（Ser202, Thr205）(AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| 山羊抗小鼠二抗，Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| 山羊抗小鼠二抗，Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 封片剂 | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| 玻璃盖玻片 | |||
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM710 | |
| 成像软件 ZEN 2012 黑色版 11.0 | Zeiss | LSM710 | 软件随共聚焦显微镜提供 |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB 配置文件工具宏 | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| 商用化学淬灭剂 | Biotum | 23007 |
参考文献
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