精确、高通量的细菌生长分析

摘要

对细菌生长进行定量评估对于从系统层面理解微生物生理学至关重要。本文介绍了一种实验操作方案和分析方法，可实现对细菌生长的精确、高通量分析，这是系统生物学研究中的一个关键课题。

摘要

细菌生长是现代微生物生理学发展以及系统水平上细胞动态研究的核心概念。近期研究报道了细菌生长与全基因组事件（如基因组缩减和转录组重排）之间的相关性。准确分析细菌生长对于理解基因功能与细胞组分在生长依赖性上的协调至关重要。因此，需要以高通量方式对细菌生长进行精确的定量评估。新兴技术的发展提供了新的实验工具，使得研究细菌生长的方法得以更新。本文介绍的实验方案采用酶标仪并结合高度优化的实验流程，可实现对细菌生长的可重复且精确的定量评估。该方案已被用于评估多种先前报道的菌株的生长情况 大肠杆菌 菌株。本方案的主要步骤如下：在小瓶中制备大量细胞储备液，以用于重复实验并获得可重复的结果；使用96孔板进行高通量生长评估；以及手动计算两个主要参数（即、最大生长速率和种群密度）以表征生长动态。与传统的菌落形成单位（CFU）测定法相比，该方法更为高效，可提供更详细的生长变化时间记录；CFU方法通过在琼脂平板上对玻璃试管中随时间培养的细胞进行计数来评估生长情况，但本方法在低种群密度下的检测限更为严格。综上所述，所述方法适用于细菌生长的精确且可重复的高通量分析，可用于得出概念性结论或进行理论推断。

引言

微生物学研究通常始于细菌细胞的培养以及细菌生长曲线的测定，这些是细菌生理学的基本现象^1,2,3。由于细菌培养是一种基础性实验方法，相关的基本培养原理在已发表的研究文献和教科书中均有广泛记载。在实验操作层面，长期以来人们主要关注培养基和培养条件的优化，而对生长速率的控制——这可能更深入地揭示微生物生理特性——却研究较少⁴。对于指数生长期的细菌而言，细胞状态的一个关键参数是生长速率，已有研究报道该参数与基因组、转录组和蛋白质组之间存在协调关系^5,6,7,8。因此，对细菌生长进行定量评估对于理解微生物生理学至关重要。

为了评估细菌生长，用于估算生物量的实验方法已得到充分建立^9,10，其原理基于检测生化、物理或生物学参数，例如光学浊度。此外，用于捕捉生长变化动态特性的分析方法通常基于....

方案

1. 准备培养基

注意：最小培养基 M63 的化学成分为：62 mM K₂HPO₄、39 mM KH₂PO₄、15 mM (NH₄)₂SO₄、1.8 µM FeSO₄、15 µM 硫胺素盐酸盐（thiamine-HCl）、0.2 mM MgSO₄ 和 22 mM 葡萄糖。M63 通过混合三种储备液配制而成：5 倍浓缩液（Five X solution）、20% 葡萄糖溶液以及 MgSO₄ 与硫胺素溶液。所有溶液均应保存于 4 °C。

1. 配制五倍浓缩溶液
   1. 配制 FeSO₄ 溶液时，使用电动移液器和一次性刻度移液管将 ddH₂O 加入一个 50 mL 离心管中。使用 P-200 移液器加入 0.06 mL HCl，配制成 0.01 M HCl。加入 36 mg FeSO₄-7H₂O，并充分混匀。
   2. 用量筒量取 160 mL ddH₂O，倒入 500 mL 烧杯中。按以下顺序依次加入：10.72 g K₂HPO₄、5.24 g KH₂

结果

本方法通过使用96孔板读数仪，以连续、高通量的方式记录细菌动态生长过程，可在不同时间间隔（从数分钟到数小时乃至数天）进行多次光密度测定。在一个实验中即可精确获取表达不同基因组的多种大肠杆菌（E. coli）菌株的生长曲线（图1A）。与本方法相比，传统方法（菌落形成单位测定法，CFU法）通常需要更长的取样时间间隔（图1B），且当需处理多个培养样本时工作量较大。此外，CFU法在每个时间点取样时需消耗少量细胞培养液，无法用于重复测量。同时，由于检测时间点数量有限，可能遗漏用于准确计算生长速率和最大OD₆₀₀所需的关键采样点。然而，CFU法的检测下限较低，为10³ - 10⁴ 个细胞/mL，比光学浊度法（OD₆₀₀ = 0.001，检测下限约为10⁵ - 10⁶ 个细胞/mL）至少敏感两个数量级。本方法为在系统水平.......

讨论

该实验方案的关键步骤包括制备共同的对数生长期细胞储备液，以及在微孔板的不同位置设置多个孔进行相同样品的重复实验。以往，微生物学家通常从过夜预培养物开始培养。尽管这种方法可能缩短细菌生长的滞后期，但难以获得可重复的生长曲线。如图2所示，使用共同甘油储备液进行的独立测量得到了几乎完全一致的生长曲线，从而提供了可重复且精确的结果。如图3所示，位于不同位置的孔所测得的读数略有差异，这被视为测量的全局背景值。在对细菌生长进行定量评估时，应考虑这一背景值。为消除全局偏差的影响，强烈建议在微孔板的不同位置接种多个重复孔以进行实验重复。

除了处理误差外，还应考虑由实验设备和耗材引起的修改及故障排除问题。目前市面上有多种先进的酶标仪，它们在特性上存在广泛差异，例如光波长调节方式、加热或冷却模式，以及振荡的方式和频率。根据我们的经验，在高通量研究中应重视蒸发问题，因为液体体积的变化会显著影响OD₆₀₀的读数。蒸发主要由酶标仪所采用的加热方式以及微孔板的结构引起。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
K2HPO4	Wako	164-04295
KH2PO4	Wako	166-04255
(NH4)2SO4	Wako	019-03435
MgSO4-7H2O	Wako	138-00415
硫胺素盐酸盐（Thiamine-HCl）	Wako	201-00852
葡萄糖（glucose）	Wako	049-31165
盐酸（HCl）	Wako	080-01066
七水合硫酸亚铁（FeSO4-7H2O）	Wako	094-01082
氢氧化钾（KOH）	Wako	168-21815
甘油（Glycerol）	Wako	075-00611
离心管（50 mL，已灭菌）	WATSON	1342-050S
移液器吸头，200 µL	WATSON	110-705Y
移液器吸头，1,000 µL	WATSON	110-8040
微量离心管（1.5 mL）	WATSON	131-715C
8通道移液器	WATSON	NT-8200
PASORINA 搅拌器	AS ONE	2-4990-02
玻璃量筒（200 mL）	AS ONE	1-8562-07
精密pH计	AS ONE	AS800 / 1-054-01
Pipetman P-200	GILSON	1-6855-05
Pipetman P-1000	GILSON	1-6855-06
一次性血清移液管（10 mL）	SANPLATEC	SAN27014
一次性血清移液管（25 mL）	SANPLATEC	SAN27015
微量离心管架	BM Bio	801-02Y
涡旋振荡器（Vortex）	BM Bio	BM-V1
Corning Costar 96孔微孔板（平底，透明），带盖	Sigma-Aldrich	Corning, 3370
Corning Costar 试剂储液槽（50 mL）	Sigma-Aldrich	Corning, 4870
Stericup GV PVDF 滤器（250 mL，0.22 µm）	Merck Millipore	SCGVU02RE
Pipet-Aid XP	DRUMMOND	4-000-101
生物摇床（Bioshaker，BR-23UM MR）	TAITEC	0053778-000
废弃细胞收集管（1.5 mL）	Kartell	1938 / 2-478-02
DU 730 生命科学紫外/可见分光光度计	Beckman Coulter	A23616
EPOCH2	BioTek	2014-EP2-002 / EPOCH2T
烧杯（500 mL）	IWAKI	82-0008
生物洁净工作台	Panasonic	MCV-B131F
玻璃试管	NICHIDEN RIKA GLASS	P-10M~P-30 /101019
硅橡胶塞	ShinEtsu Polymer	T-19
细菌菌株	菌种保藏机构；日本国家生物资源项目（NBRP）