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精确、高通量的细菌生长分析

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DOI：

10.3791/56197

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2017年9月19日

 , 
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Institute of Biology and Information Science, East China Normal University

本文内容

摘要

对细菌生长进行定量评估对于从系统层面理解微生物生理学至关重要。本文介绍了一种实验操作方案和分析方法，可实现对细菌生长的精确、高通量分析，这是系统生物学研究中的一个关键课题。

摘要

细菌生长是现代微生物生理学发展以及系统水平上细胞动态研究的核心概念。近期研究报道了细菌生长与全基因组事件（如基因组缩减和转录组重排）之间的相关性。准确分析细菌生长对于理解基因功能与细胞组分在生长依赖性上的协调至关重要。因此，需要以高通量方式对细菌生长进行精确的定量评估。新兴技术的发展提供了新的实验工具，使得研究细菌生长的方法得以更新。本文介绍的实验方案采用酶标仪并结合高度优化的实验流程，可实现对细菌生长的可重复且精确的定量评估。该方案已被用于评估多种先前报道的菌株的生长情况 大肠杆菌 菌株。本方案的主要步骤如下：在小瓶中制备大量细胞储备液，以用于重复实验并获得可重复的结果；使用96孔板进行高通量生长评估；以及手动计算两个主要参数（即、最大生长速率和种群密度）以表征生长动态。与传统的菌落形成单位（CFU）测定法相比，该方法更为高效，可提供更详细的生长变化时间记录；CFU方法通过在琼脂平板上对玻璃试管中随时间培养的细胞进行计数来评估生长情况，但本方法在低种群密度下的检测限更为严格。综上所述，所述方法适用于细菌生长的精确且可重复的高通量分析，可用于得出概念性结论或进行理论推断。

引言

微生物学研究通常始于细菌细胞的培养以及细菌生长曲线的测定，这些是细菌生理学的基本现象1,2,3。由于细菌培养是一种基础性实验方法，相关的基本培养原理在已发表的研究文献和教科书中均有广泛记载。在实验操作层面，长期以来人们主要关注培养基和培养条件的优化，而对生长速率的控制——这可能更深入地揭示微生物生理特性——却研究较少4。对于指数生长期的细菌而言，细胞状态的一个关键参数是生长速率，已有研究报道该参数与基因组、转录组和蛋白质组之间存在协调关系5,6,7,8。因此，对细菌生长进行定量评估对于理解微生物生理学至关重要。

为了评估细菌生长，用于估算生物量的实验方法已得到充分建立9,10，其原理基于检测生化、物理或生物学参数，例如光学浊度。此外，用于捕捉生长变化动态特性的分析方法通常基于已确立的非线性模型11,12,13，例如逻辑斯蒂方程。生长动态通常通过定时取样培养物中的细胞生长来获得，方法包括测量光学浊度或进行菌落形成单位（CFU）测定。这些培养与检测方法的局限性在于，所得数据点并不能真实反映种群动态，因为测量间隔通常以小时计，且在取样时培养条件（e.g.，温度和通气的变化）受到干扰。培养与分析技术必须结合技术进步和认知发展进行更新。微孔板读数仪的最新进展使得能够实时观察细菌生长，并显著降低人工成本。利用这些先进设备，近期关于细菌生长的研究已报道了适用于高通量测量的分析方法14,15。

本实验方案旨在以高通量的方式评估细菌生长的精确动态，这对于最终解答“生长速率如何确定”以及“哪些因素影响生长速率”等定量研究问题具有重要价值。该方案涵盖了可重复且精确量化细菌生长时所需考虑的全部因素。实验方法与分析过程在正文中有详细描述。本方法能够以高通量的方式对细菌生长进行精确且可重复的分析。微生物学研究人员可利用本方案从其实验证据中获得更多的定量结果。该方案也可用于系统生物学研究，以推导出概念性结论或实现对生长过程的理论性整体认识。

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方案

1. 准备培养基

注意：最小培养基 M63 的化学成分为：62 mM K2HPO4、39 mM KH2PO4、15 mM (NH4)2SO4、1.8 µM FeSO4、15 µM 硫胺素盐酸盐（thiamine-HCl）、0.2 mM MgSO4 和 22 mM 葡萄糖。M63 培养基通过混合三种储备液配制而成：5 倍浓缩液（Five X solution）、20% 葡萄糖溶液以及 MgSO4 与硫胺素溶液。所有溶液均应保存于 4 °C。

  1. 配制五倍X溶液
    1. 为了制备 FeSO4 溶液，使用电动移液器和一次性刻度移液管加入ddH2O至50 mL离心管中。使用P-200加样器加入0.06 mL HCl以配制0.01 M HCl。加入36 mg FeSO₄4-7H2O 并充分混匀。
    2. 量取 160 mL ddH₂O2量筒中的 O，将其加入 500 mL 烧杯中。按以下顺序加入：10.72 g K2HPO4，5.24 g KH2PO4，2.0 g (NH4)2SO4，以及 0.5 mL FeSO4 溶液（按步骤 1.1.1 配制）
    3. 使用精密pH计，通过加入2 M KOH将pH值调节至7.0。将溶液倒入量筒中，并加入ddH₂O2O，定容至200 mL。使用250 mL滤器（PVDF， 0.22 µM).
  2. 配制20%葡萄糖溶液
    1. 量取 200 mL ddH₂O2在量筒中加入水，并转移至500 mL烧杯中。使用磁力搅拌器搅拌的同时，加入50 g葡萄糖。用量筒加水定容至总体积250 mL。按照步骤1.1.3所述方法对溶液进行灭菌。
  3. 准备 MgSO₄4 硫胺素溶液
    1. 加入150 mL ddH₂O2O 至500 mL烧杯中。在磁力搅拌下，加入1.0 g盐酸硫胺素和10 g MgSO₄4-7H2O. 在量筒中将溶液稀释至总体积为 200 mL。按照步骤 1.1.3 所述方法对溶液进行灭菌。
  4. 制备最低限度培养基 M63
    1. 将 Five X 溶液、20% 葡萄糖溶液、MgSO₄ 溶液、1 M IPTG 和 100 mg/mL 氨苄青霉素分别置于冰上预冷。4 硫胺素溶液、电子移液器、P-200 移液器和 200-µL 洁净台上的移液器吸头。
    2. 量取 155.8 mL ddH₂O2在量筒中加入O，并倒入500 mL烧杯中。
    3. 使用电子移液器和一次性血清移液管，向已量取的 ddH₂O 中加入 40 mL 5× 溶液和 4 mL 20% 葡萄糖溶液。2O。然后，加入0.2 mL MgSO₄4 使用P-200将硫胺素溶液移取。按照步骤1.1.3所述方法对溶液进行灭菌。

2. 准备甘油菌种保存液

  1. 细胞培养
    注意：细菌菌株（例如，W3110 及其基因组简化菌株）可从菌种保藏机构获得。这些菌株通常以琼脂平板上的菌落形式提供。
    1. 将五根带硅胶塞的灭菌玻璃管、一支电子移液器、P-1,000、1,000-µL 移液器吸头，P-200，200-µL 移液器吸头以及洁净工作台上的目标菌株（平板上的菌落）。
    2. 在打开硅胶橡胶塞之前，先将玻璃管口置于本生灯火焰上灼烧。打开试管后，将硅胶橡胶塞过火灭菌，然后轻轻盖回玻璃管口。
    3. 使用电子移液器和一次性血清移液管，向其中一支玻璃试管中加入 5 mL M63 培养基，向其余四支试管中各加入 4.5 mL M63 培养基。
    4. 使用P-200枪头挑取单菌落，接种于含有5 mL M63的玻璃试管中。
    5. 涡旋振荡试管以制成悬液。然后，取0.5 mL该溶液转移至含有4.5 mL M63的四支试管之一，进行10倍稀释。
    6. 重复步骤 2.1.5 中所述过程，处理其余试管。此时已准备好包含五种不同浓度（稀释倍数分别为 1、10、10、100、1,000 和 10,000）的稀释系列。
    7. 按照步骤2.1.2所述方法对玻璃试管管口和硅胶塞进行灭菌。用硅胶塞盖紧试管，注意避免折叠或皱褶硅胶塞，以防污染。
    8. 将五个试管放入预热的摇床培养箱中 37 °C 并在200 rpm条件下振荡。培养过夜或10至30小时。
  2. 甘油菌种保藏的培养物选择
    1. 将预热至室温的 M63 培养基、P-1,000、1,000-µL 移液器吸头和一次性比色皿置于洁净工作台。
    2. 添加 1000 µL 将M63加入一次性比色皿中，使用P-1,000移液器。将一次性比色皿放入分光光度计中，在600 nm固定波长下启动程序，测定空白值。
    3. 将五支玻璃试管从摇床培养箱转移到超净工作台。
    4. 弃去一次性比色皿中的 M63，并加入 1,000 µL 将培养物用P-1,000加至同一一次性比色皿中。测定细胞培养物的光浊度（OD）600如步骤 2.2.2 所述。
      注意：为避免污染并实现精确测量，应按照所述方法将玻璃试管和塞子暴露于火焰中，并在取样前涡旋混匀培养物。为确保结果可靠，建议进行重复测量，尤其是在细胞密度较低时。
    5. 在五种细胞培养物中，选择一种处于对数生长期初期的培养物（OD600= 0.01 - 0.05）用于甘油菌种保存液。
      注意：如果多个培养物的密度均处于最佳范围内，通常选择密度最接近0.05的培养物。
  3. 制备甘油菌种保存液以用于重复实验。
    注意：此处描述的是制备十份储备液的方法。可根据实验需求制备更大或更小的量。
    1. 将灭菌的60%甘油溶液、10个灭菌的1.5 mL微量离心管、P-1,000和P-200移液器、1,000-和200-µL 移液器吸头和微型离心管架置于洁净工作台。
    2. 添加 250 µL 灭菌的60%甘油溶液和 750 µL 将选定的细胞培养物转移至1.5 mL离心管中，用移液器吹打混匀。
      注意：储存体积可变，但始终维持60%甘油与细胞培养物1:3的比例；这将得到15%的终浓度甘油。
    3. 将剩余的九个微量离心管放入微量离心管架中，并分装 100 µL 将步骤 2.3.2 中制备的混合物加入每支试管中。现在共有十份相同的甘油菌种，可供将来使用。
    4. 将储备液存放在 -80 °C 超低温冰箱中80 °C.

3. 获取生长曲线

  1. 设置酶标仪。
    注意：引号中显示的术语表示此处所用酶标仪上的具体表述（参见材料表）。
    1. 打开软件。在“任务管理器”（Task Manager）中打开“程序”（Protocols），选择“创建新程序”（Create New），然后选择“标准程序”（Standard Protocol）。
    2. 打开“步骤”（Procedure）并调整设置。打开“设置温度”（Set Temperature），选择“孵育器开启”（Incubator On）。将“温度”（Temperature）设为 37 °C，“梯度”（Gradient）设为 0 °C。在进入下一步之前勾选“预热”（Preheat）。打开“启动动力学”（Start Kinetic），将“运行时间”（Run time）设为 24:00:00 或 48:00:00，“间隔”（Interval）设为 00:30:00 或 01:00:00。
      注意：读取整块 96 孔板大约需要 1 分钟。
    3. 打开“振荡”（Shake），将“振荡模式”（Shake Mode）设为“线性”（Linear）。勾选“混合振荡”（Constitution Shake），并将“频率”（Frequency）设为 567 cpm。打开“读数”（Read），勾选“吸光度”（Absorbance）、“终点/动力学”（Endpoint/Kinetic）和“单色器”（Monochromators）。将“波长”（Wavelength）设为 600。
    4. 点击“验证”（Validate）以确认步骤正确。点击“保存”（Save）将该程序保存为新程序，以便将来使用。
  2. 生长过程的实时记录
    1. 绘制一个 96 孔板示意图（8 × 12 表格），标明接种培养物样本在 96 孔板上的位置。打印该表格，并在实验中作为参考。
      注意：由于边缘孔容易发生蒸发，微孔板边缘的孔中应仅加入空白培养基。
    2. 在超净工作台上放置一个带盖的灭菌 96 孔平底微孔板、P-1000 移液器、1000-µL 移液器吸头、P-200 移液器、200-µL 移液器吸头、若干 1.5-mL 微量离心管、8 道多通道移液器、灭菌试剂储液槽、室温 M63 培养基以及甘油菌种（按步骤 2.3 制备）。
    3. 向试剂储液槽中加入约 25 mL M63 培养基。此储液用于后续所有步骤。
    4. 向微量离心管中加入 900 µL M63 培养基，用于制备系列稀释液。
    5. 将甘油菌种在室温下解冻。向解冻后的甘油菌种中加入 900 µL M63 培养基并涡旋混匀。此操作得到原始甘油菌种的 10 倍稀释液。
    6. 取 100 µL 10 倍稀释液转移至另一含有 900 µL M63 培养基的微量离心管中，并涡旋混匀。此操作得到 100 倍稀释液。
    7. 重复步骤 3.2.6，直至达到所需的稀释倍数。
    8. 使用 8 道移液器（P-200）向微孔板边缘的孔中加入 200 µL M63 培养基。
      注意：这些孔可作为空白对照。
    9. 根据参考表格（步骤 3.2.1），将步骤 3.2.4 至 3.2.7 制备的各稀释样品各取 200 µL 加入微孔板相应孔中。加样前涡旋混匀稀释样品，并将同一样品在板上不同位置的多个孔中重复加入。
    10. 将 96 孔微孔板放置于酶标仪中。
    11. 在“任务管理器”（Task Manager）中打开“立即读取”（Read Now），选择程序（第 3.1 节）。点击“确定”（OK）开始测量。将记录保存为新的实验文件，用于后续数据分析（第 4 节）。

4. 数据分析

  1. 将实时生长速率数据（第3.2节）的结果导出为文本文件至U盘。
    注意：96孔板格式的结果（曲线）将在酶标仪上实时显示。每小时记录（OD值）可导出为表格形式，其中行和列对应孔位编号例如，A1，B1）和测量时间（例如，分别为 00:00:59。
  2. 使用电子表格软件打开文本文件。
  3. 复制每小时的 OD600 将96孔微孔板的读数导入新工作表以进行进一步分析。
  4. 从每个样本孔的每小时读数中减去零时间点的背景读数。
    注意：为方便起见，可将含有 M63 的空白孔的平均值（步骤 3.2.8）用作背景值。
  5. 计算连续五次 OD 的平均值600 通过读数来估算最大种群密度。
    注意：五个连续 OD 值中的最大平均值600 读数定义为最大OD值600 相应生长曲线的
  6. 计算生长速率， µ (h-1），通过将以下公式应用于所有连续的OD值对600:
    figure-protocol-1
    注意：在此方程中，Ci 和 Ci+1 代表 OD600 任意两个连续时间点（ti 和 ti+1，分别）。LN 表示自然对数。
  7. 根据每小时的OD计算随时间变化的生长速率变化600 根据步骤4.6读取数据。计算连续五个生长速率的平均值和标准差，以估算最大生长速率。
    注：最大均值与最小标准差定义为相应生长曲线的最大生长速率。

5. 确认96孔读数的全局偏差（可选）

注意：酶标仪和耗材96孔板均可能导致测量偏差。为获得高精度且可重复的定量结果，强烈建议确认96孔板的全局偏差。

  1. 按照第 3.2.2 节所述，为偏倚测试准备 96 孔板和酶标仪。
  2. 向一个灭菌的 50 mL 离心管中加入 20 mL M63 培养基，将甘油菌种加入同一离心管中并涡旋混匀。将悬浮液转移至一个灭菌的试剂储液槽中。
  3. 使用 8 通道移液器将 200 µL 悬浮液转移至 96 孔板中。
  4. 将 96 孔板放入酶标仪中并开始测量。
  5. 记录每小时的 OD600 读数，并按照第 4 节所述进行分析。比较各孔计算得到的最大生长速率和种群密度，以确定 96 孔板读数的位置偏倚。

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结果

本方法通过使用96孔板读数仪，以连续、高通量的方式在多个时间点（从数分钟到数小时乃至数天）进行多次光密度测定，从而实现对细菌动态生长过程的监测。在一个实验中即可精确获取表达不同基因组的多种大肠杆菌（E. coli）菌株的生长曲线（图1A）。与本方法相比，传统方法（菌落形成单位测定法，CFU法）通常需要更长的取样时间间隔（图1B），且当需处理多个培养样本时工作量较大。此外，CFU法在每个时间点取样时均需消耗少量细胞培养物，无法进行重复测量。同时，由于检测时间点数量有限，可能遗漏用于准确计算生长速率和最大OD600所需的关键采样点。然而，CFU法具有更低的检测下限（103 - 104 个细胞/mL），其灵敏度至少比光密度浊度法高出两个数量级（OD600= 0.001，检测下限约为105 - 106 个细胞/mL...

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讨论

该实验方案的关键步骤包括制备共同的对数生长期细胞储备液，以及在微孔板的不同位置设置多个孔进行相同样品的重复实验。以往，微生物学家通常从过夜预培养物开始培养。尽管这种方法可能缩短细菌生长的滞后期，但难以获得可重复的生长曲线。如图2所示，使用共同甘油储备液进行的独立测量得到了几乎完全一致的生长曲线，从而提供了可重复且精确的结果。如图3所示，位于不同位置的孔所测得的读数略有差异，这被视为测量的全局背景值。在对细菌生长进行定量评估时，应考虑这一背景值。为消除全局偏差的影响，强烈建议在微孔板的不同位置接种多个重复孔以进行实验重复。

除了处理误差外，还应考虑由实验设备和耗材引起的修改及故障排除问题。目前市面上有多种先进的酶标仪，它们在特性上存在广泛差异，例如光波长调节方式、加热或冷却模式，以及振荡的方式和频率。根据我们的经验，在高通量研究中应重视蒸发问题，因为液体体积的变化会显著影响OD600的读数。蒸发主要由酶标仪所采用的加热方式以及微孔板的结构引起。...

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披露

感谢土屋浩平提供CFU实验示例。本研究部分得到了日本文部科学省科学研究费补助金（C）项目编号26506003（授予BWY）的资助。

致谢

作者无任何利益冲突需要披露。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
K2HPO4Wako164-04295
KH2PO4Wako166-04255
(NH4)2SO4Wako019-03435
MgSO4-7H2OWako138-00415
硫胺素盐酸盐（Thiamine-HCl）Wako201-00852
葡萄糖（glucose）Wako049-31165
盐酸（HCl）Wako080-01066
七水合硫酸亚铁（FeSO4-7H2O）Wako094-01082
氢氧化钾（KOH）Wako168-21815
甘油（Glycerol）Wako075-00611
离心管（50 mL，已灭菌）WATSON1342-050S
移液器吸头，200 µLWATSON110-705Y
移液器吸头，1,000 µLWATSON110-8040
微量离心管（1.5 mL）WATSON131-715C
8通道移液器WATSONNT-8200
PASORINA 搅拌器AS ONE2-4990-02
玻璃量筒（200 mL）AS ONE1-8562-07
精密pH计AS ONEAS800 / 1-054-01
Pipetman P-200GILSON1-6855-05
Pipetman P-1000GILSON1-6855-06
一次性血清移液管（10 mL）SANPLATECSAN27014
一次性血清移液管（25 mL）SANPLATECSAN27015
微量离心管架BM Bio801-02Y
涡旋振荡器（Vortex）BM BioBM-V1
Corning Costar 96孔微孔板（平底，透明），带盖Sigma-AldrichCorning, 3370
Corning Costar 试剂储液槽（50 mL）Sigma-AldrichCorning, 4870
Stericup GV PVDF 滤器（250 mL，0.22 µm）Merck MilliporeSCGVU02RE
Pipet-Aid XPDRUMMOND4-000-101
生物摇床（Bioshaker，BR-23UM MR）TAITEC0053778-000
废弃细胞收集管（1.5 mL）Kartell1938 / 2-478-02
DU 730 生命科学紫外/可见分光光度计Beckman CoulterA23616
EPOCH2BioTek2014-EP2-002 / EPOCH2T
烧杯（500 mL）IWAKI82-0008
生物洁净工作台PanasonicMCV-B131F
玻璃试管NICHIDEN RIKA GLASSP-10M~P-30 /101019
硅橡胶塞ShinEtsu PolymerT-19
细菌菌株菌种保藏机构；日本国家生物资源项目（NBRP）

参考文献

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OD600 M63 96

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