许多威胁视力的眼部疾病与视网膜微血管功能障碍相关。因此，测量视网膜小动脉反应对于研究其潜在的病理生理机制具有重要意义。本文介绍了一种详细的小鼠视网膜小动脉分离与制备方案，用于评估血管活性物质对血管直径的影响。
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摘要
摘要
血管功能不全及视网膜正常灌注的改变是多种致盲性眼病（如糖尿病性视网膜病变、高血压性视网膜病变以及可能的青光眼）发病机制中的主要因素之一。因此，视网膜微血管标本是生理学和药理学研究中的关键工具，可用于阐明潜在的病理生理机制，并为相关疾病的治疗方案设计提供依据。尽管小鼠模型在眼科研究中被广泛应用，但针对该物种视网膜血管反应性的研究仍十分有限。造成这一差距的主要原因在于其视网膜血管尺寸微小，管腔直径约为 ≤ 30 µm，导致分离操作极具挑战性。为克服直接分离视网膜微血管以进行功能研究的技术难题，我们建立了一种分离与制备技术，可在接近生理条件下实现小鼠视网膜血管活性的离体（ex vivo）研究。虽然本实验方案将具体以小鼠视网膜小动脉为例进行描述，但该方法亦可直接应用于大鼠的微血管研究。
引言
视网膜灌注异常已被认为参与多种眼病的发病过程，例如糖尿病性视网膜病变、高血压性视网膜病变和青光眼1,2,3。因此，旨在测量视网膜血管反应性的研究对于理解这些疾病的病理生理机制以及开发新的治疗方法具有重要意义。
由于小鼠基因组具有基因操作的可能性，小鼠已成为心血管系统研究中广泛使用的动物模型4然而，由于视网膜血管直径较小（≤ 30 µm），测量小鼠视网膜血管反应性具有较大挑战性。例如，体视显微镜技术用于 体内 测量的光学分辨率有限，因此只有在配备共聚焦显微镜结合荧光染料或自适应光学扫描激光检眼镜等复杂附加设备时，才能精确检测直径小于或等于30 µm的小血管的管径或血流变化5,6此外，对 体内 旨在鉴定视网膜血管局部信号机制的测量可能受到麻醉剂、全身血压变化以及球后血管影响的干扰。
因此，我们开发了一种具有高光学分辨率的小鼠视网膜血管反应检测方法 离体本文所述技术可实现视网膜小动脉的可视化 通过 透射光显微镜技术。该方法亦可用于大鼠，为眼血管研究中基因靶向技术的应用提供了便利。
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方案
本研究的实验程序已获得德国莱茵兰-普法尔茨州动物护理委员会的批准。动物护理遵循机构指南以及视力与眼科研究协会（ARVO）关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明。动物处理遵循欧盟关于动物实验的指令 2010/63/EU。实验使用 3 至 4 个月大的雄性 C57BL/6J 小鼠（美国缅因州巴港杰克逊实验室）。动物饲养于标准条件下（温度 23 ± 2 °C，湿度范围 55 ± 10%，12 小时光照/黑暗循环），并可自由获取标准小鼠饲料和水ad libitum。
1. 小鼠视网膜的分离
- 将解剖器械放置在准备台上，检查所有器械是否齐全，以确保能够快速完成准备工作。
- 通过吸入 CO2 处死小鼠。
- 使用钢制剪刀将小鼠断头，用同一把剪刀沿矢状面将颅骨切成两半，并用眼科剪去除皮肤和脑组织（图1）。
- 使用眼科剪剪除颅骨，仅保留眶骨。
- 将眼眶组织转移至含有冰冻 Krebs-Henseleit 缓冲液的解剖皿中。
- 将解剖皿置于冰上，或每10分钟更换一次缓冲液。
- 使用眼科剪剪开眶骨，用4号精密镊子和学生型 Vannas 弹簧剪小心地将眼球连同眶周组织一起取出（图2）。
- 使用5号精密镊子和 Vannas 囊膜剪小心去除哈德氏腺、结缔组织和眼外肌，注意避免损伤眼动脉主干。
- 使用10-0尼龙缝线结扎眼动脉的眶支，必要时结扎眼动脉主干的近端（图3）。
- 用4号精密镊子将眼球转移至含有70%乙醇的培养皿中浸泡10秒，随后将眼球放回解剖皿中，并更换为新鲜的Krebs溶液。乙醇处理后角膜会呈现白色。
- 用30号针头穿刺周边角膜，使用 Vannas 囊膜剪解剖角膜。小心剪除虹膜组织，将 Vannas 囊膜剪的一个尖端插入脉络膜与视网膜之间，剪除脉络膜和巩膜，视神经周围保留部分巩膜组织（图4）。
2. 在灌流室中安装视网膜
注意：视网膜小动脉实验所用灌流室为自制装置，由一个带进出流管的透明储液槽组成（图5）。将一段硅胶管一端用组织胶粘在灌流室底部，另一端连接三通阀。将装有新鲜克雷布斯缓冲液的注射器连接至三通阀，并用缓冲液充满管道。
- 用持针器夹住玻璃微量移液管，将其推入灌流室底部的管端。然后使用4号剪刀剪断微量移液管的尖端，以获得直径为100 µm的开口。
- 聚焦于微量移液器的尖端并冲洗它 通过 连接在管路上的注射器。注意毛细管不要被碎屑堵塞。若发生堵塞，应将其移除，冲洗管路，然后插入另一支微移液管。
- 将冰冷的Krebs缓冲液注入灌流室，并将灌流室置于体视显微镜下。
- 将一个透明塑料平台放入灌流室中。该平台有一个宽度为1.8 mm的凹槽，用于容纳视神经和眼动脉，并放置在两根直径为1.6 mm的钢丝上。然后，将一个内径为2.8 mm、外径为4.0 mm的不锈钢环置于该平台上。
- 使用勺子将带有视神经和附着的眼动脉的视网膜从解剖室极其小心地转移至灌流室。此步骤至关重要，需防止组织受到牵拉，以免对实验造成不利影响。
- 切断眼动脉近端的结扎部分，将两个预先制备好的10-0尼龙缝线环套在微移液管上，用微移液管插管眼动脉，并将动脉结扎固定于微移液管上（图6）并使用尖头镊子将视网膜放置在透明平台上。
- 用两把精细尖头镊子轻轻撕开晶状体前囊膜，取出晶状体，再用显微剪将整个晶状体囊膜剪除。
- 随后，从视网膜的睫状体平坦部至视神经距离的一半处，向视网膜做四个放射状切口，并将一个不锈钢环置于视网膜上，以将其固定于底部。此时视网膜已准备就绪，可用于实验。图7).
3. 实验用视网膜小动脉的制备
- 将灌流室置于光学显微镜下，物镜为100倍水浸物镜。
- 将进出流管路连接至蠕动泵，使用95% O₂混合气氧合的Krebs缓冲液循环灌注腔室2 并用5% CO₂饱和2 在37 °C下进行。流速控制在100至120 mL/min之间。
- 将连接至微移液管的硅胶管与储液硅胶管相连 通过 三通旋塞。然后，向储液器中加入Krebs缓冲液，液面高度对应50 mm Hg 不要打开三通旋塞阀。
- 通过显微镜的物镜观察视网膜表面，聚焦并寻找血管或红细胞。血管可能已完全塌陷，因此有时仅能观察到少量红细胞。
- 当发现血管时，应聚焦于该血管并打开三通阀。血管直径应立即增大，若为小动脉，则红细胞向外周（离心方向）移动；若为小静脉，则红细胞向中心（向心方向）移动。相同级别的小动脉直径较之小静脉更小。
- 一旦发现管壁清晰可见的血管，即可在经过30分钟的平衡期后用于实验。图8在平衡期间，微动脉仅产生微弱的内在张力，导致管腔直径减少不足10%。
4. 实验操作
- 通过向浴液中加入血栓素模拟物9,11-二去氧-9α,11α-亚甲基环氧前列腺素F2α (U46619)来检测血管的活性。该试剂在浓度≥ 10-6 M时可使小鼠视网膜小动脉收缩约50%（相对于静息状态下的管径）。
- 确认血管具有活性后，启动循环泵冲洗浴槽，去除激动剂，并向浴槽中供给新鲜的Krebs缓冲液。
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结果
U-46619 在 C57Bl/6J 背景的野生型小鼠视网膜小动脉中引起浓度依赖性的血管收缩反应。在 10-6 M 浓度下，管腔直径从静息直径减少了约 50%。图 9A 显示了一条视网膜小动脉的代表性浓度-反应曲线。在预先用 U46619 收缩的小动脉中，累积给予乙酰胆碱可引起管腔直径呈浓度依赖性扩张，在 10-5 M 时达到预收缩直径的约 25%，表明血管内皮功能完整（图 9B）。
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讨论
由于视网膜血管尺寸微小，测量小鼠视网膜血管反应具有挑战性。本技术通过透射光显微镜观察视网膜小动脉，因离体视网膜具有半透明特性，故可实现清晰成像。该技术的优势在于具有高光学分辨率，计算所得空间分辨率为11像素/µm。然而，由于受到阿贝衍射极限的限制，该白光光学系统的实际分辨率为200至300 nm。由于小鼠视网膜小动脉第一级分支的内径为20至30 µm，因此该系统可检测到约1%的直径变化。本方法无需依赖其他研究中报道的额外技术设备或荧光染料即可实现对细小视网膜小动脉的可视化5,6,7。该技术的缺点是制备时间较长，经培训的研究人员操作亦需90至120分钟。若制备时间超过180分钟，内皮功能将开始减弱。
该技术中有几个关键的步骤。首先，必须彻底结扎所有眶后动脉分支。如果结扎不完全，由于存在渗漏，视网膜小动脉将无法加压。其次，在打开眼球之前将其浸入乙醇10秒至关重要，这一步可使眼动脉的平滑肌反应性失活。我...
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披露
作者无竞争性财务利益。
致谢
本工作获得了恩斯特与贝尔塔·格林克基金会（Ernst und Berta Grimmke Stiftung）和德国眼科学会（Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft, DOG）资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 钢制剪刀 | 卡尔·罗斯有限公司 | 3576.1 | 1×140 毫米 |
| 眼科剪 | Geuder | G-19390 | 1x 直形，10.5 cm |
| 精密镊子，直头，尖端精细 | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x 4型 |
| 精密镊子，直头，超细尖端 | 卡尔·罗斯有限责任公司 | LH53.1 | 2x 5型 |
| 范纳斯晶状体囊膜剪 | Geuder | 19760 | 1x 直型，77 毫米 |
| 学生用瓦纳斯弹簧剪 | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x 弯曲的， |
| 巴雷克 持针器 | Geuder | G-17500 | 1根弯头，120 mm |
| 针 | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| 玻璃毛细管（用于制备微吸管） | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x（1.2 x 0.8 毫米；外径/内径） |
| 尼龙缝合线 | 爱尔康 | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon 细胞培养皿 | 赛默飞世尔科技 | 153066 | 1个35 mm直径 |
| Nunclon 细胞培养皿 | 赛默飞世尔科技 | 172931 | 1× 100 毫米直径 |
| Discofix C | 布劳恩 | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl 粘合剂 | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>仪器设备 | |||
| 周细胞泵 （CYCLO II） | 卡尔罗斯特有限责任公司 | EP76.1 | 1x |
| 垂直式移液器拉制仪 700C 型 | David Kopf Instruments | 1x | |
| 显微镜（Vanox-T AH-2） | Olympus | 1x | |
| 水浸物镜 LUMPlanFL，1.0 数值孔径 | 奥林巴斯 | 1x | |
| 数码相机（TK-C1381） | JVC | 1x | |
| 灌流室 | 自制 | 1x | |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>药物与溶液 | |||
| 乙醇 | 卡尔·罗斯特有限责任公司 | K928.4 | |
| 二水合氯化钙（CaCl₂）2) | 卡尔·罗斯特有限责任公司 | 5239.1 | |
| 氯化钾（KCl） | 卡尔·罗斯有限责任公司 | 6781.1 | |
| 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4) | 卡尔罗斯特有限责任公司 | 3904.2 | |
| 硫酸镁（MgSO₄）4) | 卡尔·罗斯有限责任公司 | 261.2 | |
| 氯化钠（NaCl） | 卡尔·罗斯有限公司 | 9265.2 | |
| 碳酸氢钠（NaHCO₃）3) | 卡尔·罗斯有限责任公司 | 0965.3 | |
| αD-(+)-葡萄糖一水合物 | 卡尔罗斯特有限公司 | 6780.1 | |
| 9,11-二脱氧-9α,11α-甲烷环氧前列腺素F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| 乙酰胆碱氯化物 | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
参考文献
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- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
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