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一种利用三维高频超声成像对小鼠早期妊娠进行表征的新方法

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DOI：

10.3791/56207

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2017年10月24日

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1Devision of Repreoductive Endocrinology and Infertility, Department of Obstetrics and Gynecology, Baylor College of Medicine, 2Mouse Phenotyping Core, Baylor College of Medicine, 3Reproductive and Developmental Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, 4Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

小鼠被广泛用于妊娠生物学的研究。然而，此类研究需要终止妊娠，从而无法进行纵向观察，并且需要使用大量动物。因此，我们描述了一种无创的高频超声成像技术，用于在妊娠小鼠中早期检测和监测着床后的事件。

摘要

高频超声成像（HFUS）是一种常见的无创方法，用于实时监测人类胎儿在子宫内的发育过程。in utero。小鼠通常被用作in vivo模型来研究胚胎着床及妊娠进展。然而，此类小鼠研究通常需要终止妊娠，才能进行后续的表型分析。为解决这一问题，我们采用高频超声成像数据的三维（3-D）重建技术，以实现对小鼠胚胎着床部位的早期检测及其个体发育进程的表征in utero。通过结合高频超声成像与三维重建及建模技术，我们能够准确量化胚胎着床部位的数量，并利用换能器对C57BL6J/129S妊娠小鼠从交配后5.5天（d.p.c.）至9.5 d.p.c.的发育进程进行连续监测。测量指标包括：着床部位的数量、位置和体积，以及着床部位之间的间距；胚胎存活情况通过心脏活动监测进行评估。在着床后的早期阶段（5.5至8.5 d.p.c.），以网格和实心覆盖形式对妊娠子宫进行三维重建，可直观呈现每个子宫角内正在发育的妊娠结构。随着基因工程小鼠被持续用于表征由子宫功能障碍引起的雌性生殖表型，该方法为在活体条件下检测、量化和表征早期着床事件提供了新途径in vivo。这种三维高频超声成像的新应用展示了在非侵入性条件下成功检测、可视化并表征小鼠早期妊娠中胚胎着床部位的能力。该技术相较于依赖终止妊娠以进行大体组织学和组织病理学分析的现有方法，具有显著改进。本文通过视频与文字形式，详细描述如何成功开展小鼠早期妊娠超声检查，以获得可靠且可重复的数据，并重建出子宫形态的网格状与实心三维图像。

引言

复发性早期妊娠丢失是受孕后最常见的并发症之一，影响约1%的备孕夫妇1,2。早期妊娠丢失的潜在机制多种多样：包括胚胎自身异常、母体合并症以及子宫内膜容受性缺陷等1,3,4。由于小鼠具有良好的遗传可操作性，已被广泛用于早期胚胎着床及妊娠过程的研究。此外，小鼠妊娠周期短，并可进行大规模实验，使其在解答人类生殖医学中的关键临床问题方面发挥着日益重要的作用5。然而，目前绝大多数小鼠实验设计仍需在妊娠的不同时间点连续处死大量雌鼠，以定量和分析妊娠期间着床部位的位置、数量、大小及分布模式6,7,8，因而无法在同一动物个体上开展纵向研究。

在临床中，超声是一种可靠且不可或缺的工具，可用于以无创方式监测人类胎儿的存活状况和发育情况9,10,11。近年来，高频超声（HFUS）开始在小鼠中获得有限应用，作为一种监测妊娠期间胎儿存活和生长的方法12,13,14。超声成像技术的最新进展使得三维（3-D）数据可用于动物器官的可视化重建，并进一步监测病理变化15,16,17。该先进成像技术的应用显著提高了检测微小体积变化的能力，减少了个体间差异，并有助于监测病理进程或治疗干预的效果17。尽管该技术的主要用途一直是监测肿瘤小鼠模型中的恶性肿瘤进展15,16，但三维HFUS成像直到最近才被用于定量并监测小鼠子宫内胚胎着床及胎儿发育的动态生长过程18。

本文展示了如何进行高频超声（HFUS）成像，以获取二维和三维数据，进而重建早期妊娠小鼠子宫的结构。我们证实了该新方法在检测早期胚胎着床事件中的实用性，且无需终止妊娠，使研究人员能够以非侵入性的方式收集数据。

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方案

这些研究均按照美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）发布的《实验动物护理与使用指南》进行，并经贝勒医学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，批准协议编号为 AN-4203。

1. 超声检查前对妊娠小鼠的准备

  1. 定时交配
    1. 将雌鼠与已知具有生育能力的雄鼠在1700之后过夜合笼。无论是否发现阴道栓，均应在次日0700前将雌鼠与雄鼠分离，以确保妊娠日期的准确判定。
      注：交配后的次日早晨记为受孕后0.5天（d.p.c.）。
  2. 超声检查前准备
    1. 将怀孕小鼠放入密封的麻醉诱导容器中。
    2. 使用异氟烷（2%）吸入麻醉剂和氧气（1 L/min）进行镇静，直至动物失去翻正反射（根据小鼠体型，约需1-2分钟），且除呼吸外无其他自发性活动。
    3. 将镇静后的小鼠仰卧置于鼻罩中，持续给予异氟烷（2%）吸入麻醉剂和氧气（1 L/min）。在动物眼睛上涂抹眼用软膏。
    4. 用棉签将脱毛膏均匀涂抹于整个腹部，范围从胸骨至阴道，并延伸至体侧。
    5. 脱毛膏停留时间不超过3分钟，随后用纸巾清除脱毛膏及毛发。务必确保所有毛发均被清除，因残留毛发会降低图像质量。

2. 超声装置的准备

  1. 打开换能器。
  2. 将三维电机平台连接到换能器。
    1. 通过将三维电机电缆连接到后侧面板上的三维电机连接器，将其接入三维电机。使用顶部的快速释放杆将三维电机系统连接至成像站的安装系统，并使用底部的快速释放底座固定换能器夹具。
  3. 将探头连接至换能器夹具。

3. 开始对怀孕小鼠进行成像

  1. 将小鼠仰卧位放置于监测平台上。通过鼻罩持续给予异氟烷麻醉剂（1.5–2.5%）和氧气（1 L/min）。用胶带轻轻将四肢固定在平台的心率监测垫上。
    1. 在腹部涂抹1–2 mL超声传导凝胶。
  2. 使用手动电机载物台，将超声探头置于下腹部。
    1. 找到膀胱，其应表现为位于阴道开口头侧的充满液体的暗色圆形结构。
    2. 确定膀胱位置后，将探头缓慢向头侧移动，以观察妊娠子宫，其表现为圆柱形结构，并在妊娠部位呈现圆形区域，外观类似串珠。
    3. 确认妊娠子宫后，开始进行二维成像。

4. 二维超声成像（图1）

  1. 确定妊娠子宫后，从靠近膀胱的妊娠部位开始，缓慢有序地向头侧移动，以确定妊娠部位的数量和位置。
  2. 若观察到肾脏、脾脏或肝脏，则需将探头向尾侧（更靠近膀胱方向）调整，表明当前扫描已过度向头侧偏移。
  3. 以相同方式对侧子宫角进行成像。
  4. 当超声图像位于着床/妊娠部位中心时，冻结图像以便后续分析和测量。
    注意：图像冻结并保存至后续分析的过程耗时不足一秒。
  5. 使用高回声蜕膜化反应作为标记，测量着床间距。首先手动点击"测量"工具，然后点击某一着床部位的位置；接着将光标拖动至下一个着床部位并点击，绘制一条线段，计算机将自动报告其距离。软件随后会显示该手动测量结果。此步骤非自动化，依赖操作者通过在蜕膜化部位之间绘制线段来标记间距，程序将提供相应的测量数值。
  6. 测量着床大小、孕囊大小以及胎芽大小。

5. 胎心率

注意：在胚胎发育第9.5天，应能清晰观察到胎心搏动。

  1. 保持探头完全静止，开启脉冲波多普勒，并将其置于可见的心跳位置上。
  2. 记录心脏搏动的脉冲信号。
    注意：除心脏外，本操作还可记录脐带内的搏动信号。

6. 三维超声采集

  1. 在二维成像中观察到妊娠子宫后，将探头置于预期三维图像的大致中点位置。例如，若对苹果进行三维成像，探头初始应放置在预测苹果果核所在的位置（即物体的中心）。
  2. 当探头位于目标图像的中间位置时，进行三维数据采集。三维电机装置将分步或逐帧跨越子宫移动此距离，以完整捕获研究者希望观察的全部结构。
  3. 在完成实时超声检查前，确认目标结构已完全包含在三维扫描范围内。保存此三维数据以供后续后处理分析。由经验丰富的操作者完成二维和三维超声采集的总时间约为10至20分钟。

7. 三维重建后处理（图2）

  1. 加载用于三维图像处理的所需数据。
  2. 选择 "平行法与旋转法"，这会将所有3D图像帧加载到一个3-D中 "盒子" 用户将逐帧追踪目标物体。选择步长为 0.08 mL。从图像块的一端开始，逐层滚动浏览，以熟悉该空间内已采集的图像。
    1. 从图像的一端开始，手动描出物体的轮廓。
    2. 滚动至下一个二维图像切片或 "帧" 手动描摹物体的轮廓。
    3. 继续此过程，直至用户完成对所有帧的手动标注/描记。
    4. 点击 "完成" 以获取三维图像和总体积计算结果。
  3. 在左上角选择网格或实心覆盖层，该选项显示为一个箭头。
  4. 根据清晰度需要选择保留或去除超声图像周围的附加信息。每次三维重建可能需要10至20分钟。

8. 术后护理

  1. 超声检查完成后，关闭麻醉气体，将小鼠从平台上取下，并轻轻擦拭和清洗掉动物身上的任何超声耦合剂。
  2. 将小鼠放回笼中，俯卧于铺有软垫的区域。监测直至动物清醒并能自主活动。

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结果

如所示 图1高频超声可在妊娠5.5天（d.p.c.）时即检测到着床部位的发育。在6.5 d.p.c.时，利用回声较强的蜕膜化子宫内膜作为着床部位的标志，可对着床部位的数量及其分布间距进行定量分析。随着妊娠进展至7.5 d.p.c.，低回声的孕囊和胎芽亦可清晰识别。

如图2所示，可对小鼠子宫三维重建的完整后处理结果进行可视化观察。在6.5 d.p.c.时，可通过网格和实体叠加两种形式的三维高频超声图像组合提供直观的视觉呈现。另一个示例为7.5 d.p.c.时的图像，展示了另一例子宫的最终复合图像，包含网格与实体叠加模式。

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讨论

这种三维高频超声（3-D HFUS）成像的新应用展示了在小鼠早期妊娠期间以非侵入性方式成功检测、可视化和表征胚胎着床部位的能力。该技术相较于现有方法具有显著优势，现有方法依赖于终止妊娠以进行大体组织学和组织病理学分析。然而需要指出的是，当需要在更高倍数和更细的细胞水平上进行表征，或需要进行基因和蛋白质分析时，组织学方法仍被认为是更优选择。随着越来越多的新小鼠模型表现出着床缺陷和早期妊娠丢失19,20,21,22，这种先进超声技术能够从妊娠5.5天（d.p.c.）起检测早期妊娠，明显优于早期仅能在妊娠中期进行检测的超声方法12,13。此外，该方法可在心脏开始跳动的8.5至9.5 d.p.c.期间即检测到心脏运动23

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们非常感谢 Rong Zhao、Jie Li 和 Yan Ying 的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
VisualSonics Vevo 2100 超声成像平台/设备VisualSonics, inc.VS-11945
Vevo 成像工作站VisualSonics, inc.SA-11982
Aquasonic 100 超声传导凝胶Parker#SKU PLI 01-08
异氟烷（IsoThesia）100 mL 瓶装Henry Shein#29404
PuraLuben 动物眼科软膏Dechra#12920060

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