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方法文章

多光子延时成像实时可视化发育过程：斑马鱼胚胎中迁移性神经嵴细胞的可视化

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DOI：

10.3791/56214

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2017年8月9日

 , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Kellogg Eye Center, University of Michigan

本文内容

摘要

结合激光扫描显微镜的先进光学技术与长波长多光子荧光激发，对 Tg(sox10:EGFP) 和 Tg(foxd3:GFP) 斑马鱼胚胎中神经嵴迁移过程进行了高分辨率、三维、实时成像。

摘要

先天性眼部和颅面畸形反映了神经嵴的发育异常，神经嵴是一类短暂存在的迁移性干细胞群体，可分化为全身多种细胞类型。由于缺乏可进行遗传操作且便于研究的模型，神经嵴生物学的研究进展一直受到限制 体内 并且能够实时观察。斑马鱼是研究迁移性细胞群体（如神经嵴细胞）的一个重要发育模型。为了观察神经嵴细胞向发育中眼球的迁移过程，结合了激光扫描显微镜与长波长多光子荧光激发等先进光学技术，对转基因斑马鱼胚胎（即 Tg(sox10:EGFP）和 Tg（foxd3:GFP），作为 sox10 和 foxd3 已在多种动物模型中被证实可调控早期神经嵴分化，且可能作为神经嵴细胞的标志物。采用多光子延时成像技术，以解析参与早期眼发育的两类神经嵴细胞群体的行为特征与迁移模式。本方案以斑马鱼神经嵴细胞迁移过程中的延时视频制作为例，提供相关操作信息，亦可进一步应用于斑马鱼及其他模式生物多种结构早期发育过程的可视化研究。

引言

先天性眼病可导致儿童失明，通常源于颅神经嵴的异常。神经嵴细胞是一类短暂存在的干细胞，起源于神经管，可形成机体多种组织。1,2,3,4,5 来源于前脑和中脑的神经嵴细胞可发育为中面部和额部的骨骼与软骨，以及眼部前段的虹膜、角膜、小梁网和巩膜。4,6,7,8 来源于菱脑的神经嵴细胞则形成咽弓、下颌以及心脏流出道。1,3,4,9,10 研究已阐明神经嵴在眼及眼周组织发育中的重要作用，强调了这些细胞在脊椎动物眼球发育中的关键地位。事实上，神经嵴细胞的迁移和分化过程若受到干扰，可导致颅面及眼部异常，如Axenfeld-Rieger综合征和Peters Plus综合征中所见。11,12,13,14,15,16,17 因此，全面理解这些神经嵴细胞的迁移、增殖和分化过程，将有助于揭示先天性眼病背后的复杂机制。

斑马鱼是研究眼部发育的有力模式生物，因为斑马鱼眼睛的结构与哺乳动物相似，且许多基因在斑马鱼与哺乳动物之间具有进化上的保守性。18,19,20 此外，斑马鱼胚胎透明且为卵生，便于实时观察眼睛的发育过程。

在先前已发表研究的基础上6,7,20，利用多光子荧光延时成像技术，结合在SRY（性别决定区Y）-box 10（sox10）或Forkhead Box D3（foxd3）基因调控区域转录调控下表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因斑马鱼品系，描述了神经嵴细胞的迁移模式21,22,23,24。多光子荧光延时成像是一种强大的技术，它将激光扫描显微镜的先进光学技术与长波长多光子荧光激发相结合，能够对带有荧光标记物的样本进行高分辨率、三维图像的连续采集25,26,27。相比标准共聚焦显微镜，多光子激光具有明显优势，包括更强的组织穿透能力和更少的荧光分子漂白效应。

利用该方法，可区分出在迁移时间和迁移路径上均不相同的两类神经嵴细胞，即眼周间充质和发育中眼球内的 foxd3 阳性神经嵴细胞，以及颅面间充质中的 sox10 阳性神经嵴细胞。该方法提供了一种可视化斑马鱼眼部和颅面神经嵴细胞迁移的途径，便于在发育过程中实时观察受调控的神经嵴细胞迁移现象。

本方案以Tg(sox10:EGFP)和Tg(foxd3:GFP)转基因斑马鱼早期眼部发育为例，提供生成延时视频的相关信息。该方案还可进一步用于斑马鱼中源自神经嵴细胞的任何眼部及颅面结构早期发育过程的高分辨率、三维、实时可视化观察。此外，该方法也可拓展应用于斑马鱼及其他动物模型中其他组织和器官发育过程的可视化研究。

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方案

本文所述方案遵循密歇根大学动物使用与护理委员会（UCUCA）制定的实验动物人道处理指南进行。

1. 用于延时成像的胚胎收集

  1. 在下午3点至9点之间，将雄性和雌性成年Tg(sox10:EGFP)或Tg(foxd3:GFP)转基因斑马鱼配对放入分隔式繁殖缸中进行交配。
    注意：Tg(sox10:EGFP)和Tg(foxd3:GFP)斑马鱼分别为Thomas Schilling和Mary Halloran惠赠，已回交至Casper（roy -/-, nacre -/-）背景品系，以减少自发荧光和色素干扰。
    1. 组装繁殖缸（带槽内缸 + 实壁外缸），并用反渗透（RO）系统水注满。
    2. 将最多3条雌鱼和3条雄鱼分别放入由隔板分隔的两侧；单个繁殖缸最多可同时进行6条鱼的配对繁殖。
    3. 次日清晨，在动物房灯光开启后不久移除隔板。
      注意：本研究中，光照周期为14小时光照（上午9点开灯）和10小时黑暗（晚上11点关灯）。
    4. 让鱼安静交配20分钟，或直至产生足够数量的胚胎；胚胎将沉于繁殖缸底部。一旦观察到卵子，立即连同亲鱼一起提起带槽内缸，并迅速将其（亲鱼和内缸）转移至一个装有RO水的洁净实壁外缸中。
  2. 制备标准1X胚胎培养基：每1升RO水中加入以下成分：0.287 g（4.9 mM）NaCl、0.127 g（0.17 mM）KCl、0.048 g（0.33 mM）CaCl2·2H2O、0.04 g（0.33 mM）MgSO4（无水）。搅拌至盐类完全溶解。
    1. 加入100 µL 0.1%亚甲蓝作为杀菌剂。加入0.25 g碳酸氢钠以调节pH至7.75。将培养基于室温保存。
  3. 使用集卵筛从外缸中收集卵子，并将卵子转移至含有30 mL 1X胚胎培养基的培养皿中（每皿约50个胚胎）。将收集的卵子在28.5 °C下孵育。
  4. 胚胎准备
    1. Tg(sox10:EGFP)胚胎。
      1. 对于Tg(sox10:EGFP)胚胎，在受精后12小时（hpf），去除死亡卵子并评估胚胎发育阶段。使用配备标准460–490 nm带通激发滤光片的解剖荧光体视显微镜筛选GFP阳性胚胎。用镊子去除3–4个表达GFP的胚胎的卵膜，并将这些胚胎转移至另一含有30 mL新鲜1X胚胎培养基的培养皿中。
    2. Tg(foxd3:GFP)胚胎。
      1. 对于Tg(foxd3:GFP)胚胎，在受精后22–24 hpf时，去除死亡卵子并评估胚胎发育阶段。使用配备标准460–490 nm带通激发滤光片的解剖荧光体视显微镜筛选阳性胚胎。用镊子去除3–4个表达GFP的胚胎的卵膜。
      2. 通过将0.75 g（3%）苯硫脲（PTU）溶解于25 mL二甲基亚砜（DMSO）中，制备1000倍浓缩PTU储存液。分装后于4 °C保存。取30 µL 1000倍浓缩PTU（3%）储存液加入30 mL 1X胚胎培养基中，配制成0.003% PTU溶液。
      3. 将筛选后去膜的GFP阳性胚胎置于0.003% PTU溶液中以抑制色素形成。在20 hpf之前不得开始PTU处理，因为过早处理（在<20 hpf）可能对神经嵴和神经上皮发育产生不利影响。28
    3. 在进行延时成像实验前，应通过标准体视显微镜对胚胎进行活体成像监测，以同龄对照组每12–24小时观察一次，用于控制温度漂移的影响。

2. 胚胎活体成像的固定

  1. 延时胚胎培养基的制备
    1. 通过将 0.004 g 三卡因加入 100 mL 反渗透水（RO 水）中，配制标准的 0.4% 三卡因储备液。将储备液分装（约 1 mL）至新的 1.5 mL 离心管中，并于 -20 °C 保存。
    2. 通过将 2 mL 的 0.4% 三卡因溶液加入 48 mL 的 1X 胚胎培养基中，配制延时胚胎培养基（50 mL 的 1X 胚胎培养基，含 0.016% 三卡因）。若使用大于 >22 hpf 的胚胎，则还需向胚胎培养基中加入 50 µL 的 3% PTU 储备液（终浓度为 0.003% PTU）。
  2. 2% 低熔点琼脂糖的制备
    1. 将 0.4 g 低熔点琼脂糖粉末加入 20 mL 的 1X 胚胎培养基中，加热 1–2 分钟，或直至溶液澄清且所有颗粒完全溶解。
      注意：提高琼脂糖凝胶的浓度会降低基质的孔隙率，可能物理性阻碍胚胎的生长与发育。因此，可将琼脂糖浓度降至 1.5% 以尽量减少此类影响。然而，在激光扫描显微镜中，当激发光束保持静止时，局部加热效应会更显著，并随时间呈对数级快速上升。在本方案中，荧光团吸收引起的加热高度局限于焦点区域。因此，在感兴趣区域，温度可能升高至足够高（≥ 30 °C），导致浓度低于 1.5% 的琼脂糖溶液熔化，从而直接暴露胚胎于激光下，或造成胚胎漂离焦平面。因此，不建议使用浓度低于 1.5% 的琼脂糖溶液。
    2. 将琼脂糖溶液分装（约 1 mL）至新的 1.5 mL 离心管中保存。多余的琼脂糖溶液可保持液态，置于加热块（60–70 °C）上保存 2–3 周。
  3. 胚胎的固定
    1. 为搭建开放式浴槽腔室，先在开放式浴槽腔室底部涂抹少量高真空润滑脂。将圆形玻璃盖玻片置于底部，再将浴槽上部旋紧到底座上（图 1A，B）。
    2. 用移液器将（约 500–700 µL）2% 琼脂糖溶液（60–70 °C）加入开放式浴槽腔室中，直至腔室底部约填充至 3/4（图 1C）。注意：一旦琼脂糖溶液被置于实验台上的开放式浴槽腔室中，其温度大约以每秒 1 °C 的速度下降。
    3. 静置 30 秒，使琼脂糖略微冷却（约 30–40 °C），但尚未完全凝固，随后将单个胚胎转移至腔室底部中央（图 1D，E）。
    4. 在荧光体视显微镜下，使用 1–10 µL 微量移液枪头调整胚胎位置，确保胚胎靠近琼脂糖底部，因为若胚胎过于接近琼脂糖表面，在加入胚胎培养基后可能漂浮移位。
      注意：在所提供的视频（视频 1–3）中，胚胎为侧向放置，但根据研究区域的不同，也可将胚胎腹侧或背侧朝下放置。
    5. 持续观察并调整胚胎位置，直至琼脂糖完全凝固。琼脂糖凝固后，使用移液管将组装好的开放式腔室完全充满延时胚胎培养基（图 1F）。
    6. 将开放式浴槽腔室置于快速交换平台上，该平台可安装在载物台适配器上（图 1G）。将整个装置（胚胎、开放式浴槽腔室、快速交换平台及载物台适配器）立即放置于显微镜载物台上，位于聚光镜正上方（图 1H）。

3. 用于延时成像的显微镜设置

  1. 确定激光参数设置
    1. 确定所用激光波长。使用波长为所关注荧光染料激发波长两倍的激光。例如 880 至 940 nm 的波长（适用于 GFP）。
      注意：在本研究中，GFP 的波长设置范围为 880 至 940 nm。波长越高，激光的输出功率越低。
    2. 确定激光透射率。较高的激光透射率会杀死胚胎，应使用最低的透射率（推荐做法）。对于本文所述的24至48小时的延时研究，透射率应保持在5%以下。
    3. 确定显微镜检测系统，并确保为荧光染料配备了正确的滤光片。
      注意：对于多光子显微镜，存在多种具有不同荧光发射敏感度的检测系统。通常情况下，内置检测系统的灵敏度低于外置检测系统。对于绿色荧光蛋白（GFP）表达水平较高的转基因品系，使用内置检测系统已足够。而对于GFP表达水平较低的转基因品系或其他荧光染料例如， 红色荧光蛋白），可能需要使用外部检测系统以将激光透射率维持在合理水平。无论使用何种检测系统，都必须配备适用于该荧光染料的正确滤光片。
  2. 调节多光子显微镜的软件设置
    1. 使用5倍物镜定位胚胎。手动将载物台升至最高位置，并使用细调焦旋钮将胚胎置于显微镜视野的中央。
    2. 手动降低载物台，将5倍物镜更换为25倍水浸物镜（数值孔径NA，0.95）。小心升高载物台，使胚胎重新进入焦点。
    3. 在软件中，单击 "xyzt" 在x-y平面内以时间间隔（t）获取多幅图像的模式，覆盖一定深度范围 "z"使用落射荧光或明场观察来确定感兴趣区域的焦平面深度，以界定Z轴扫描范围。
      1. 在软件中，单击 "开始" 按钮；在这些实验中，眼睛的侧缘是Z轴扫描的起始位置。点击 "结束" 按钮；胚胎的中线即为Z轴扫描的终点。
        注意：步长为 0.3–0.6 µm，共约 200 步，z 轴堆栈范围为 60 至 120 µm。
    4. 单击菜单以调整采集时间和成像频率。对于当前系统，每个 z 层扫描采集约需 5 分钟，对应约 200 步。为确保荧光探针充分恢复及胚胎存活，z 层扫描采集（激光开启）与恢复时间（激光关闭）之比应至少达到 1:3。
      注意：例如，每20分钟获取一次z层扫描图像，其中z层扫描采集耗时5分钟，恢复时间为15分钟。在本实验方案中，可获取更大的z层扫描图像，但会相应延长两次z层扫描之间的间隔时间，导致延时成像过程中获得的图像数量减少。
      1. 在适当的时间进行胚胎回收，在指定窗口中设置z轴层间的时间间隔。在相应窗口中设置实验的总时长。
    5. 最终的软件、激光和胚胎调整。
      1. 打开实时成像设置，对激光参数进行最后调整。在软件中调节激光透射率（参见3.1.2）、增益和偏移滑块，以优化荧光图像。根据实验时长、胚胎预期生长情况等，必要时调整胚胎的方位。确保在实验过程中，目标区域始终位于成像视野范围内。
      2. 关闭落射荧光光源，因为在延时成像过程中不再需要该光源。用激光安全箱罩住载物台 图1I）。使用内置检测系统时，激光安全箱足以防止背景光干扰。按下 "开始".
        注意：然而，使用更灵敏的外部检测系统时，激光安全箱不足以阻挡背景光，需要额外的遮盖物以防止图像采集受到干扰。

4. 时间序列采集期间

  1. 在延时成像过程中，通过激光安全箱的滑动门每8-12小时（每天至少两次）重新填充开放浴室中的延时胚胎培养基（图1I）。
  2. 在打开激光安全箱门之前，务必确认显微镜未处于主动成像状态。
    注意：对于持续24至48小时的延时成像实验，无需使用加热装置或循环培养基系统。实际上，载物台和管路加热器的温度较难精确控制，而在成像期间，胚胎在25-28 °C的温度范围内仍能保持良好的发育速率。此外，循环培养基系统容易发生溢出，可能损坏设备。因此，所有胚胎通常在成像结束后进行常规的发育阶段鉴定。

5. 采集后处理

  1. 在软件中，点击 "file" 菜单并选择 "save"。
  2. 在图像处理软件中打开文件（参见材料表）。选中正确的图像序列。在软件中选择 "Process" 菜单。点击 3D Deconvolution 并选择 "Apply"，以对每个 z-stack 进行去卷积处理。
    注意：文件较大，因此此步骤可能需要数小时。
  3. 在软件中，于 "Process" 菜单下，点击 "maximum projection"。点击 "Apply" 以启动最大投影，为每个 z-stack 生成一幅图像。将每个最大投影后的文件（每个 z-stack 一幅图像）导出为 tiff 格式。
  4. 将单个 tiff 文件导入视频处理软件。选中所有 tiff 文件并将其拖入视频编辑器中。调整视频中每幅图像的持续时间为 0.1 秒。将视频导出为 mov 或 mp4 格式文件。

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结果

多光子荧光延时成像生成了一系列视频，揭示了Tg(sox10:EGFP) 和 Tg(foxd3:GFP斑马鱼品系。例如， sox10-12至30小时受精后，位于神经管边缘的神经嵴细胞向颅面部区域迁移视频 1， 图2). 前脑和中脑的细胞迁移至发育中眼球的背侧和腹侧，以形成眼周间充质组织。此外，这些 sox10-阳性细胞形成额鼻突。来自菱脑的神经嵴细胞向腹侧迁移，形成咽弓。延时成像的 foxd3在30至60 hpf之间呈阳性的神经嵴细胞显示，这些细胞在视杯与表面外胚层之间迁移，并通过视裂进入眼部。 (视频 2, 图3). 这些 foxd3阳性细胞在晶状...

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讨论

多光子时间序列成像能够实现 体内 追踪短暂存在和迁移的细胞群体。这一强大技术可用于实时研究胚胎发育过程，在本研究中，该方法的结果加深了目前对神经嵴细胞迁移与发育的认识。以往的延时成像研究通常采用共聚焦激光扫描显微镜。29,30,31,32 在此，我们介绍一种多光子技术，该技术相较于传统的共聚焦显微镜具有诸多优势。多光子显微镜的基本原理是利用两个较长波长的红外光子激发荧光分子。因此，光散射更少，背景信号降低，从而实现更深的组织穿透，可在生物组织中达到超过1 mm的成像深度，并且检测效率高于共聚焦显微镜。这些特性还可降低光毒性，对于需要反复和频繁成像的实验而言，这一点尤为重要。25,26,27

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披露

本工作获得了美国国立卫生研究院国家眼科研究所（K08EY022912-01）和视力研究核心（P30 EY007003）基金的资助。

致谢

作者感谢 Thomas Schilling 惠赠 Tg(sox10:eGFP) 鱼系，以及 Mary Halloran 惠赠 Tg(foxd3:GFP) 鱼系。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
带分隔板的繁殖缸AquaneeringZHCT100交配缸套装（1.0升）透明聚碳酸酯，带盖和插入件
M205 FA Combi-ScopeLeica Microsystems CMS GmbH立体荧光显微镜 - FusionOptics 和 TripleBeam
氯化钠Millipore (EMD)7760-5KG双层聚乙烯袋。CAS 号 7647-14-5，EC 编号 231-598-3
氯化钾Millipore (EMD)1049380500氯化钾 99.999 Suprapur。CAS 号 7447-40-7，EC 编号 231-211-8。
二水合氯化钙Fisher ScientificC79-500聚乙烯瓶；500 g。CAS 号 10035-04-8
硫酸镁（无水）Millipore (EMD)MX0075-1聚乙烯瓶；500 g。CAS 号 7487-88-9，EC 编号 231-298-2
亚甲蓝Millipore (EMD)284-12玻璃瓶；25 g。粉末，认证生物染色剂
碳酸氢钠Millipore (EMD)SX0320-1聚乙烯瓶；500 g。粉末，GR ACS 级。CAS 号 144-55-8，EC 编号 205-633-8
N-苯基硫脲SigmaP7629-25G>98%。CAS 编号 103-85-5，EC 编号 203-151-2
二甲基亚砜SigmaD8418-500ML分子生物学级。CAS 编号 67-68-5，EC 编号 200-664-3
三卡因甲磺酸盐Western Chemical Inc.MS222Tricaine-S
低熔点琼脂糖ISC BioexpressE-3112-25GeneMate Sieve GQA 低熔点琼脂糖，25 g
开放式浴槽室Warner InstrumentsRC-40HP高轮廓型
玻璃盖玻片Fisher Scientific12-545-102圆形盖玻片，直径 25 mm
高真空润滑脂Fisher Scientific14-635-5C2.0 磅管装。DOW CORNING CORPORATION
1658832
快速交换平台Warner InstrumentsQE-135 mm
载物台适配器Warner InstrumentsSA-20LZ-AL16.5 x 10 cm
TC SP5 MP 多光子显微镜Leica Microsystems CMS GmbH
Mai Tai DeepSee 钛蓝宝石激光器SpectraPhysics
激光安全箱Leica Microsystems CMS GmbH
Leica Application Suite X (LAS X)  软件Leica Microsystems CMS GmbH
Photoshop CS 6 版本 13.0 x64 软件Adobe
iMovie 版本 10.1.4 软件Apple

参考文献

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