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多光子延时成像实时可视化发育过程：斑马鱼胚胎中迁移性神经嵴细胞的可视化

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DOI：

10.3791/56214

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2017年8月9日

 , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Kellogg Eye Center, University of Michigan

本文内容

摘要

结合激光扫描显微镜的先进光学技术与长波长多光子荧光激发，对 Tg(sox10:EGFP) 和 Tg(foxd3:GFP) 斑马鱼胚胎中神经嵴迁移过程进行了高分辨率、三维、实时成像。

摘要

先天性眼部和颅面畸形反映了神经嵴的发育异常，神经嵴是一类短暂存在的迁移性干细胞群体，可分化为全身多种细胞类型。由于缺乏可进行遗传操作且便于研究的模型，神经嵴生物学的研究进展一直受到限制 体内 并且能够实时观察。斑马鱼是研究迁移性细胞群体（如神经嵴细胞）的一个重要发育模型。为了观察神经嵴细胞向发育中眼球的迁移过程，结合了激光扫描显微镜与长波长多光子荧光激发等先进光学技术，对转基因斑马鱼胚胎（即 Tg(sox10:EGFP）和 Tg（foxd3:GFP），作为 sox10 和 foxd3 已在多种动物模型中被证实可调控早期神经嵴分化，且可能作为神经嵴细胞的标志物。采用多光子延时成像技术，以解析参与早期眼发育的两类神经嵴细胞群体的行为特征与迁移模式。本方案以斑马鱼神经嵴细胞迁移过程中的延时视频制作为例，提供相关操作信息，亦可进一步应用于斑马鱼及其他模式生物多种结构早期发育过程的可视化研究。

引言

先天性眼病可导致儿童失明，通常源于颅神经嵴的异常。神经嵴细胞是一类短暂存在的干细胞，起源于神经管，可形成机体多种组织。1,2,3,4,5 来源于前脑和中脑的神经嵴细胞可发育为中面部和额部的骨骼与软骨，以及眼部前段的虹膜、角膜、小梁网和巩膜。4,6,7,8 来源于菱脑的神经嵴细胞则形成咽弓、下颌以及心脏流出道。1,3,4,9,10 研究已阐明神经嵴在眼及眼周组织发育中的重要作用，强调了这些细胞在脊椎动物眼球发育中的关键地位。事实上，神经....

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方案

本文所述方案遵循密歇根大学动物使用与护理委员会（UCUCA）制定的实验动物人道处理指南进行。

1. 用于延时成像的胚胎收集

  1. 在下午3点至9点之间，将雄性和雌性成年Tg(sox10:EGFP)或Tg(foxd3:GFP)转基因斑马鱼配对放入分隔式繁殖缸中进行交配。
    注意：Tg(sox10:EGFP)和Tg(foxd3:GFP)斑马鱼分别为Thomas Schilling和Mary Halloran惠赠，已回交至Casper（roy -/-, nacre -/-）背景品系，以减少自发荧光和色素干扰。
    1. 组装繁殖缸（带槽内缸 + 实壁外缸），并用反渗透（RO）系统水注满。
    2. 将最多3条雌鱼和3条雄鱼分别放入由隔板分隔的两侧；单个繁殖缸最多可同时进行6条鱼的配对繁殖。
    3. 次日清晨，在动物房灯光开启后不久移除隔板。
      注意：本研究中，光照周期为14小时光照（上午9点开灯）和10小时黑暗（晚上11点关灯）。
    4. 让鱼安静交配20分钟，或直至产生足够数量的胚胎；胚胎将沉于繁殖缸底部。一旦观察到卵子，立即连同亲鱼一起提起带槽内缸，并迅速将其（亲鱼和内缸）转移至一个装有RO水的洁净实壁外缸中。
  2. 制备标准1X胚胎....

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结果

多光子荧光延时成像生成了一系列视频，揭示了Tg(sox10:EGFP) 和 Tg(foxd3:GFP斑马鱼品系。例如， sox10-在12至30 hpf期间，神经嵴细胞从神经管边缘迁移至颅面部区域（视频 1， 图2). 前脑和中脑的细胞迁移至发育中眼睛的背侧和腹侧，以形成眼周间充质组织。此外，这些 sox10-阳性细胞形成额鼻突。来自菱脑的神经嵴细胞向腹侧迁移，形成咽弓。延时成像的 foxd3在30至60 hpf之间呈阳性的神经嵴细胞显示，这些细胞在视杯与表面外胚层之间迁移，并通过视裂进入眼球内部。 (视频 2, 图3). 这些 foxd3阳性细胞.......

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讨论

多光子时间序列成像能够实现 体内 追踪短暂存在和迁移的细胞群体。这一强大技术可用于实时研究胚胎发育过程，在本研究中，该方法的结果加深了目前对神经嵴细胞迁移与发育的认识。以往的延时成像研究通常采用共聚焦激光扫描显微镜。29,30,31,32 在此，我们介绍一种多光子技术，该技术相较于传统的共聚焦显微镜具有诸多优势。多光子显微镜的基本原理是利用两个较长波长的红外光子激发荧光分子。因此，光散射更少，背景信号降低，从而实现更深的组织穿透，可在生物组织中达到超过1 mm的成像深度，并且检测效率高于共聚焦显微镜。这些特性还可降低光毒性，对于需要反复和频繁成像的实验而言，这一点尤为重要。25,26,27

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披露

本工作获得了美国国立卫生研究院国家眼科研究所（K08EY022912-01）和视力研究核心（P30 EY007003）基金的资助。

致谢

作者感谢 Thomas Schilling 惠赠 Tg(sox10:eGFP) 鱼系，以及 Mary Halloran 惠赠 Tg(foxd3:GFP) 鱼系。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
带分隔板的繁殖缸AquaneeringZHCT100交配缸套装（1.0升）透明聚碳酸酯，带盖和插入件
M205 FA Combi-ScopeLeica Microsystems CMS GmbH立体荧光显微镜 - FusionOptics 和 TripleBeam
氯化钠Millipore (EMD)7760-5KG双层聚乙烯袋。CAS 号 7647-14-5，EC 编号 231-598-3
氯化钾Millipore (EMD)1049380500氯化钾 99.999 Suprapur。CAS 号 7447-40-7，EC 编号 231-211-8。
二水合氯化钙Fisher ScientificC79-500聚乙烯瓶；500 g。CAS 号 10035-04-8
硫酸镁（无水）Millipore (EMD)MX0075-1聚乙烯瓶；500 g。CAS 号 7487-88-9，EC 编号 231-298-2
亚甲蓝Millipore (EMD)284-12玻璃瓶；25 g。粉末，认证生物染色剂
碳酸氢钠Millipore (EMD)SX0320-1聚乙烯瓶；500 g。粉末，GR ACS 级。CAS 号 144-55-8，EC 编号 205-633-8
N-苯基硫脲SigmaP7629-25G>98%。CAS 编号 103-85-5，EC 编号 203-151-2
二甲基亚砜SigmaD8418-500ML分子生物学级。CAS 编号 67-68-5，EC 编号 200-664-3
三卡因甲磺酸盐Western Chemical Inc.MS222Tricaine-S
低熔点琼脂糖ISC BioexpressE-3112-25GeneMate Sieve GQA 低熔点琼脂糖，25 g
开放式浴槽室Warner InstrumentsRC-40HP高轮廓型
玻璃盖玻片Fisher Scientific12-545-102圆形盖玻片，直径 25 mm
高真空润滑脂Fisher Scientific14-635-5C2.0 磅管装。DOW CORNING CORPORATION
1658832
快速交换平台Warner InstrumentsQE-135 mm
载物台适配器Warner InstrumentsSA-20LZ-AL16.5 x 10 cm
TC SP5 MP 多光子显微镜Leica Microsystems CMS GmbH
Mai Tai DeepSee 钛蓝宝石激光器SpectraPhysics
激光安全箱Leica Microsystems CMS GmbH
Leica Application Suite X (LAS X)  软件Leica Microsystems CMS GmbH
Photoshop CS 6 版本 13.0 x64 软件Adobe
iMovie 版本 10.1.4 软件Apple

参考文献

  1. Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
  2. Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-....

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Sox10 EGFP Foxd3 GFP Z

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