Method Article

多光子时间推移成像实时可视化发展: 迁移神经嵴细胞在斑马鱼胚胎中的可视化

DOI:

10.3791/56214

⸱

August 9th, 2017

 , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Kellogg Eye Center, University of Michigan

In This Article

Summary

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激光扫描与波长多光子荧光显微镜的先进光学技术组合的实施是为了捕获高分辨率的、 三维的、 实时成像中甘油三酯 (sox10:EGFP) 和甘油三酯 (foxd3:GFP) 斑马鱼胚胎神经嵴迁移。

Abstract

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先天性眼和颅颌面畸形反映神经嵴，流动人口的洄游的干细胞，导致整个身体的许多细胞类型的中断。了解神经嵴的生物学已经有限，反映出缺乏可以研究体内的转基因听话模型和实时。斑马鱼是特别重要的发展模式，为研究洄游的细胞群，如神经嵴。若要检查神经嵴迁移到眼睛发育，实施的结合激光扫描显微镜与长波长多光子荧光激发的先进光学技术是拍摄高分辨率的、 三维的、 实时的转基因斑马鱼胚胎，即甘油三酯 (sox10:EGFP) 和甘油三酯 (foxd3:GFP)，在眼睛发育如sox10和foxd3已经在众多的动物模型，以调节早期神经嵴分化，他们可能代表神经嵴细胞的标记所示。多光子延时成像用来辨别的行为和早期眼发展作出贡献的两个神经嵴细胞群的迁徙模式。本议定书提供关于作为一个例子，斑马鱼神经嵴在迁移期间，生成的视频信息，并可进一步用于可视化斑马鱼和其他模式生物的很多建筑的早期发展。

Introduction

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先天性眼疾导致儿童失明，往往是由于异常的颅神经嵴。神经嵴细胞是瞬态的干细胞，起身从神经管形成许多机体全身。1,2,3,4,5前脑的两侧和中脑，神经嵴细胞，引起的骨和软骨的中部和额叶区和虹膜、 角膜、 小梁网和前段眼睛的巩膜。4,6,7,8神经嵴细胞从蛤蚧形式咽弓、 下巴和心脏流出道。1,3,4,9,10研究强调了贡献于眼部神经嵴和眼周发展，强调这些细胞在脊椎动物眼睛发育的重要性。事实上，中断的神经嵴细胞迁移和分化导致颅面部、 眼部异常....

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Protocol

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此处描述的方案是根据密歇根大学动物使用和护理委员会 （UCUCA） 制定的实验动物人道待遇指南执行的。

1. 用于延时成像的胚胎采集

  1. 下午 3 点到 9 点之间，将雄性和雌性成年 Tg（sox10：EGFP） 或 Tg（foxd3：GFP） 转基因斑马鱼放在一个分开的繁殖池中，进行成对交配><。 注意：Tg（sox10：EGFP） 和 Tg（foxd3：GFP） 鱼分别是 Thomas Schilling 和 Mary Halloran 的善意礼物，被杂交到 Casper（roy -/-，nacre -/-）背景中，以减少自发荧光和对色素沉着的干扰。
    1. 组装养殖罐（开槽内罐 + 实心外罐）并注入反渗透 （RO） 系统水。
    2. 将最多 3 只雌鱼和 3 只雄鱼转移到鱼缸的相对两侧，由隔板隔开;在一个繁殖鱼缸中最多可以成对繁殖 6 条鱼。
    3. 第二天早上，在饲养箱的灯亮起后不久，请拆除隔板。
      注意：在本研究中，灯是 14 小时灯（上午 9 点亮）和 10 小时暗灯（晚上 11 点关闭）周期。
    4. 让不受干扰的交配 20 分钟或直到产生足够数量的胚胎;胚胎将位于繁殖箱的底部。观察到鱼卵后，将开槽的内水箱与鱼一起提起，并迅速将它们（鱼和内水箱）放入装满 RO 水....

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Results

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多光子荧光延时成像产生一系列的视频显示斑马鱼线到眼前段中的甘油三酯 (sox10:EGFP) 和甘油三酯 (foxd3:GFP) 与颅面结构引起的颅神经嵴细胞的迁移模式。作为一个例子， sox10-12 和 30 hpf 之间的积极的神经嵴细胞迁移从神经管的边缘到颅面地区 (视频 1， 图 2)。来自前脑的两侧和中脑细胞迁移的背、 腹面的发展中国家的眼睛来填充眼周间质。此外，这些sox10阳性细胞形成鼻过程。蛤蚧神经嵴细胞迁移腹侧和引起咽拱门。延时成像的foxd3-30-60 之间的积极的神经嵴细胞 hpf 表明这些细胞迁移视杯和表面外胚层之间，通过眼裂（视频 2、图 3）。

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Discussion

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多光子延时成像使体内追踪的瞬态和洄游的细胞群体。这个强大的技术可用于研究胚胎过程在真正的时间，并在本研究中，这种方法的结果加强的神经嵴细胞迁移和发展的当前知识。以前的延时成像研究通常利用共聚焦激光扫描显微镜。29,30,31,32在这里，我们目前使用的多光子技术，相比传统的共焦显微镜有着许多优点。多光子显微镜的基础是两个较长的红外波长的光子用于激发荧光。因此，有较少的散射和因而降低的背景下，启用更深层次的组织渗透，实现成像深度超过 1 毫米更有效率比共聚焦显微镜检测生物组织中。这些属性也会减小光毒性的检测，是重要的考虑因素与重复和频繁的图像采集。25,26,27从这些属性，双光子显.......

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Disclosures

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这项工作提供了通过视觉研究的核心 (P30 EY007003) 与美国国立卫生研究院 (K08EY022912-01) 国家眼科研究所的赠款资助。

Acknowledgements

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作者感谢托马斯 · 席林请送礼的甘油三酯 (sox10:eGFP) 鱼和玛丽哈洛伦的慈祥礼物甘油三酯(foxd3:GFP)鱼。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
带隔板的饲养罐AquaneeringZHCT100Crossing Tank Set （1.0 L） 带盖和插件的透明聚碳酸酯
M205 FA 组合望远镜Leica Microsystems CMS GmbH立体荧光显微镜 - FusionOptics 和 TripleBeam
Sodium chlorideMillipore （EMD）7760-5KG双 PE 袋。CAS 编号 7647-14-5，EC 编号 231-598-3
氯化钾Millipore （EMD）1049380500氯化钾 99.999 Suprapur。CAS 号 7447-40-7，EC 号 231-211-8。
水氯化钙Fisher ScientificC79-500聚乙烯瓶;500 克 CAS 编号 10035-04-8
硫酸镁（无水）米利波尔 （EMD）MX0075-1聚合物瓶;500 克 CAS 编号 7487-88-9，EC 编号 231-298-2
亚甲蓝米利波尔 （EMD）284-12玻璃瓶;25 克粉末，经认证的生物染色
氢钠米利波尔 （EMD）SX0320-1聚乙烯瓶;500 克粉末，GR ACS。CAS 编号 144-55-8，EC 编号 205-633-8
N-苯硫脲SigmaP7629-25G>98%。CAS 号 103-85-5，EC 号 203-151-2
二甲基亚砜SigmaD8418-500ML分子生物学级。CAS 号 67-68-5，EC 号 200-664-3
Tricaine MethanesulfonateWestern Chemical Inc.MS222三卡因-S
低熔点琼脂糖ISC BioexpressE-3112-25GeneMate 筛 GQA 低熔点琼脂糖，25 g
开浴室Warner InstrumentsRC-40HP高型
玻璃盖玻片Fisher Scientific12-545-102圆形盖玻片。25 mm 直径
高真空润滑脂Fisher Scientific14-635-5C2.0 磅管。道康宁公司
1658832
快速交换平台华纳仪器QE-135 毫米
载物台适配器华纳仪器SA-20LZ-AL16.5 x 10 厘米
TC SP5 MP 多光子显微镜徕卡显微系统 CMS GmbH
Mai Tai DeepSee 钛蓝宝石激光光谱物理
激光安全箱徕卡显微系统 CMS GmbH
徕卡应用程序套件 X （LAS X） 软件Leica Microsystems CMS GmbH
Photoshop CS 6 版本 13.0 x64 软件Adobe
iMovie 版本 10.1.4 软件Apple
二剂碳酸

References

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  1. Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
  2. Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-....

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