多光子时间推移成像实时可视化发展: 迁移神经嵴细胞在斑马鱼胚胎中的可视化

摘要

激光扫描与波长多光子荧光显微镜的先进光学技术组合的实施是为了捕获高分辨率的、 三维的、 实时成像中甘油三酯 (sox10:EGFP) 和甘油三酯 (foxd3:GFP) 斑马鱼胚胎神经嵴迁移。

摘要

先天性眼和颅颌面畸形反映神经嵴，流动人口的洄游的干细胞，导致整个身体的许多细胞类型的中断。了解神经嵴的生物学已经有限，反映出缺乏可以研究体内的转基因听话模型和实时。斑马鱼是特别重要的发展模式，为研究洄游的细胞群，如神经嵴。若要检查神经嵴迁移到眼睛发育，实施的结合激光扫描显微镜与长波长多光子荧光激发的先进光学技术是拍摄高分辨率的、 三维的、 实时的转基因斑马鱼胚胎，即甘油三酯 (sox10:EGFP) 和甘油三酯 (foxd3:GFP)，在眼睛发育如sox10和foxd3已经在众多的动物模型，以调节早期神经嵴分化，他们可能代表神经嵴细胞的标记所示。多光子延时成像用来辨别的行为和早期眼发展作出贡献的两个神经嵴细胞群的迁徙模式。本议定书提供关于作为一个例子，斑马鱼神经嵴在迁移期间，生成的视频信息，并可进一步用于可视化斑马鱼和其他模式生物的很多建筑的早期发展。

引言

先天性眼疾导致儿童失明，往往是由于异常的颅神经嵴。神经嵴细胞是瞬态的干细胞，起身从神经管形成许多机体全身。^1,2,3,4,5前脑的两侧和中脑，神经嵴细胞，引起的骨和软骨的中部和额叶区和虹膜、 角膜、 小梁网和前段眼睛的巩膜。^4,6,7,8神经嵴细胞从蛤蚧形式咽弓、 下巴和心脏流出道。^1,3,4,9,10研究强调了贡献于眼部神经嵴和眼周发展，强调这些细胞在脊椎动物眼睛发育的重要性。事实上，中断的神经嵴细胞迁移和分化导致颅面部、 眼部异常如在阿克森费尔德丽格综合征和彼得斯加综合征。^{11,12,13,14,15,16,17}因此，全面了解迁移、 增殖和分化的这些神经嵴细胞将提供洞察潜在先天性眼疾的复杂性。

斑马鱼是强大的模式生物研究眼发展，斑马鱼眼的结构类似于哺乳动物同行，以及许多基因进化保守斑马鱼和哺乳动物之间。^18,19,20此外，斑马鱼胚胎是透明和卵生，促进眼发育的实时可视化。

扩大以前发表的作品，^6，，720神经嵴细胞的迁移模式描述了使用多光子荧光延时成像上带有 SRY （性别决定区 Y） 的转录控制下的绿色荧光蛋白 (GFP) 的转基因斑马鱼线-框 10 (sox10) 或叉头框 D3 (foxd3) 基因调控区域。^21,22,23,24.多光子荧光延时成像是一项强大的技术，结合先进的光学技术的激光扫描显微镜与长波长多光子荧光激发来捕获的标本，用荧光标记的高分辨率的三维图像。^25,26,27多光子激光的使用已经超过标准的共焦显微镜，包括增加的组织的渗透和减少的荧光漂白明显的优势。

使用此方法，两个不同种群的神经嵴细胞迁移和洄游通道的时间变了可区分，即 foxd3 阳性神经嵴细胞在眼周间质和眼睛发育和颅面间质 sox10 阳性神经嵴细胞。使用此方法，介绍了可视化的斑马鱼的眼部和面部神经嵴迁移迁移方法，使其易于观察发展过程中实时调节的神经嵴迁移。

此协议提供信息以便在早期眼发育的甘油三酯 (sox10:EGFP) 和甘油三酯 (foxd3:GFP) 转基因斑马鱼作为示例生成定时视频。此协议可进一步用于任何来自神经嵴细胞在斑马鱼的眼部和面部结构的早期发展的高分辨率的、 三维的、 实时可视化。此外，这种方法进一步可以用于发展的其它组织和器官在斑马鱼和其他动物的模型可视化。

方案

此处描述的方案是根据密歇根大学动物使用和护理委员会 （UCUCA） 制定的实验动物人道待遇指南执行的。

1. 用于延时成像的胚胎采集

1. 下午 3 点到 9 点之间，将雄性和雌性成年 Tg（sox10：EGFP） 或 Tg（foxd3：GFP） 转基因斑马鱼放在一个分开的繁殖池中，进行成对交配><。 注意：Tg（sox10：EGFP） 和 Tg（foxd3：GFP） 鱼分别是 Thomas Schilling 和 Mary Halloran 的善意礼物，被杂交到 Casper（roy -/-，nacre -/-）背景中，以减少自发荧光和对色素沉着的干扰。
   1. 组装养殖罐（开槽内罐 + 实心外罐）并注入反渗透 （RO） 系统水。
   2. 将最多 3 只雌鱼和 3 只雄鱼转移到鱼缸的相对两侧，由隔板隔开;在一个繁殖鱼缸中最多可以成对繁殖 6 条鱼。
   3. 第二天早上，在饲养箱的灯亮起后不久，请拆除隔板。
      注意：在本研究中，灯是 14 小时灯（上午 9 点亮）和 10 小时暗灯（晚上 11 点关闭）周期。
   4. 让不受干扰的交配 20 分钟或直到产生足够数量的胚胎;胚胎将位于繁殖箱的底部。观察到鱼卵后，将开槽的内水箱与鱼一起提起，并迅速将它们（鱼和内水箱）放入装满 RO 水的干净固体外水箱中。
2. 每 1 L RO 水添加以下物质，制备标准 1X 胚胎培养基：0.287 g （4.9 mM） NaCl、0.127 g （0.17 mM） KCl、0.048 g （0.33 mM） CaCl_{2.2H 2}O、0.04 g （0.33 mM） MgSO₄（无水）。搅拌溶液，直到盐完全溶解。
   1. 加入 100 μL 0.1% 亚甲蓝作为杀菌剂。加入 0.25 g 碳酸氢钠，将 pH 值调节至 7.75。在室温下储存培养基。
3. 使用鸡蛋收集筛从外槽中收集鸡蛋，并将鸡蛋转移到含有 30 mL 1X 胚胎培养基的培养皿（每皿 ~50 个胚胎）中。将收集的鸡蛋在 28.5 °C 下孵育。
4. 胚胎准备
   1. Tg（sox10：EGFP） 胚胎。
      1. 对于 Tg（sox10：EGFP） 胚胎，在受精后 12 小时 （hpf） 去除死卵并评估胚胎的发育阶段。使用带有标准 460-490 nm 带通激发滤光片的解剖荧光立体显微镜筛选 GFP 阳性胚胎。使用镊子从 3-4 个表达 GFP 的胚胎中取出绒毛膜，并将这些胚胎转移到含有 30 mL 新鲜 1X 胚胎培养基的单独培养皿中。
   2. Tg（foxd3：GFP） 胚胎。
      1. 对于 Tg（foxd3：GFP） 胚胎，在 22-24 hpf 时，去除死卵并评估胚胎的发育阶段。使用带有标准 460-490 nm 带通激发滤光片的解剖荧光立体显微镜筛选阳性胚胎。使用镊子，从 3-4 个表达 GFP 的胚胎中取出绒毛膜。
      2. 将 0.75 g （3%） PTU 溶解在 25 mL 二甲基亚砜 （DMSO） 中，制备 1000X 苯硫脲 （PTU） 储备液。将储备液分装并储存在 4 °C 下。将 30 μL 1000X PTU （3%） 储备液添加到 30 mL 1X 胚胎培养基中，以生成 0.003% PTU 溶液。
      3. 将筛选和去绒毛膜的 GFP 阳性胚胎置于 0.003% PTU 溶液中以抑制色素沉着。不要在 20 hpf 之前开始用 PTU 处理胚胎，因为早期治疗（<20 hpf）会对神经嵴和神经上皮发育产生不利影响。²⁸
   3. 在进行延时实验之前，使用标准立体显微镜以 12-24 小时的间隔通过实时成像监测胚胎，作为年龄匹配比较的对照，作为温度漂移的对照。

2. 用于延时成像的胚胎安装

1. 延时胚胎培养基的制备
   1. 通过将 0.004 g 三卡因添加到 100 mL RO 水中来制备标准的 0.4% 三卡因储备液。将储备液分装 （~1 mL） 到新鲜的 1.5 mL 离心管中，并储存在 -20 °C 下。
   2. 向 48 mL 1X 胚胎培养基中加入 2 mL 0.4% 三卡因溶液，制备延时胚胎培养基（50 mL 1X 胚胎培养基，0.016% 三卡因）。如果使用 >22 hpf 的胚胎，则还要向胚胎培养基中加入 50 μL 3% PTU 储备溶液（终浓度.003% PTU）。
2. 2% 低熔点琼脂糖的制备
   1. 将 0.4 g 低熔点琼脂糖粉添加到 20 mL 1X 胚胎培养基中。加热 1-2 分钟或直到溶液澄清且所有颗粒溶解。
      注：增加琼脂糖凝胶的百分比会降低基质的孔隙率，这可能会物理阻碍胚胎的生长和发育。因此，可以将琼脂糖溶液降低到 1.5% 以尽量减少这些影响。然而，当激发光束在激光扫描显微镜期间保持静止时，可能会发生更大的加热，与时间呈对数关系迅速增加。在该方案中，由于荧光团吸收引起的加热高度局限于局灶区域。因此，在感兴趣的区域中，温度可以升高到足够高的值 （≥ 30 °C），以熔化以低于 1.5 的百分比制成的琼脂糖溶液，从而直接将胚胎暴露在激光下或使胚胎漂浮出焦平面的有利条件。因此，不建议使用低于 1.5% 的琼脂糖溶液。
   2. 将琼脂糖溶液分装 （~1 mL） 到新鲜的 1.5 mL 离心管中储存。将过量的琼脂糖溶液以液体形式储存在加热块 （60-70 °C） 上 2-3 周。
3. 挂载 Embryo
   1. 要设置开放式桑拿房，请在开放式桑拿房的底部放置少量高真空润滑脂。将圆形玻璃盖玻片放在底座上，然后将打开的浴池的顶部拧到底座上直至拧紧（图 1A、B）。
   2. 将 （~500-700 μL） 2% 琼脂糖溶液 （60-70 °C） 移液到打开的浴池中，直到底座充满 ~3/4（图 1C）。请注意，一旦琼脂糖溶液在实验室工作台上的开放浴池中，溶液的温度就会降低约 1 °C/s。
   3. 等待 30 秒，让琼脂糖略微冷却（~30-40°C），不要完全聚合，然后将单个胚胎转移到碱基的中心（图 1D，E）。
   4. 在荧光立体显微镜下，使用 1-10 μL 微量移液器吸头定位胚胎，确保胚胎放置在琼脂糖底部附近，因为如果胚胎培养基放置得太靠近琼脂糖表面，胚胎在被胚胎培养基覆盖时可能会漂浮走><。 注意：在展示的视频（视频 1-3）中，胚胎是横向的，但根据感兴趣的区域，胚胎可以向腹侧或背侧方向。
   5. 监测并重新定位胚胎，直到琼脂糖凝固。琼脂糖凝固后，使用移液管将组装好的开放腔室完全装满延时胚胎培养基（图 1F）。
   6. 将打开的浴室放在适合载物台适配器的快速交换平台中（图 1G）。将整个设置（胚胎、开放式浴室、快速交换平台和载物台适配器）放在聚光镜正上方的显微镜载物台上（图 1H）。

3. 用于延时成像的显微镜设置

1. 确定激光设置
   1. 确定要使用的激光波长。使用的波长是目标荧光团激发波长的两倍（例如，GFP 的波长在 880 到 940 nm 之间><）。 注意：在本研究中，GFP 的波长设置在 880 到 940 nm 之间。波长越高，激光器的输出功率越低。
   2. 确定激光传输。高百分比的激光透射会杀死胚胎，使用最低的透射率（推荐）。对于 24 至 48 小时的延时研究，如本文所述，将透射率保持在 5% 以下。
   3. 确定显微镜检测系统，并确保为荧光基团安装了正确的滤光片。
      注意：对于多光子显微镜，有多个检测系统对发射的荧光具有不同的灵敏度。通常，内部检测系统的灵敏度低于外部检测系统。对于 GFP 表达水平高的转基因品系，内部检测系统就足够了。对于 GFP 表达水平低或具有其他荧光团（例如红色荧光蛋白）的转基因品系，可能需要外部检测系统以将激光透射率保持在合理水平。无论使用何种检测系统，都必须为荧光基团配备正确的滤光片。
2. 调整多光子显微镜上的软件设置
   1. 使用 5X 物镜，找到胚胎。手动将载物台升高到最高位置，并使用精细聚焦将胚胎定位在显微镜范围的中间。
   2. 手动降低载物台，将 5 倍物镜更改为 25 倍水浸物镜（数值孔径 NA，0.95）。小心地抬高载物台，使胚胎重新聚焦。
   3. 在软件中，单击 "xyzt" 模式，在 "z" 深度的 x-y 平面上以时间间隔 （t） 获取多个图像。使用落射荧光或明场视图找到感兴趣区域中的焦深，这将划分 Z 堆栈。
      1. 在软件中，单击"开始"按钮;对于这些实验，眼睛的外侧边缘是 Z 堆栈的起点。点击"结束"按钮;胚胎的中线是 Z 堆栈的末端。
         注：步长为 0.3-0.6 μm，对于 60 至 120 μm 的 z 堆栈大小，总共有 ~200 个步骤）。
   4. 单击菜单以调整采集时间和成像频率。对于目前的系统，每次 z 堆栈采集大约需要 5 分钟 ~200 个步骤。为了充分恢复荧光团和胚胎的存活，允许 z 堆栈采集（激光开机）和恢复时间（激光关机）之间的比率至少为 1：3><。 注意：例如，每 20 分钟采集一次 z 堆栈，其中 z 堆栈采集 5 分钟，恢复 15 分钟。对于此协议，可以获得更大的 z 堆栈，但会适当增加 z 堆栈采集之间的时间，从而导致在延时过程中的图像更少。
      1. 在胚胎恢复的适当时间下，在指定窗口中设置 z 堆栈之间的时间。在相应的窗口中设置实验的总时间长度。
   5. 最终软件、激光和胚胎调整。
      1. 打开实时图像设置以对激光设置进行最终调整。在软件中调整激光透射（参见 3.1.2）、增益和偏移滑块以优化荧光图像。此外，根据需要调整胚胎的方向，具体取决于实验的长度、胚胎的预期生长等。确保感兴趣区域在整个实验期间保持在帧内。
      2. 关闭落射荧光光源，因为在延时采集过程中不再需要它。用激光安全箱（图 1I）覆盖载物台。使用内部检测系统时，激光安全箱足以抵御背景光。按"开始".
         注意：然而，对于更灵敏的外部检测系统，激光安全盒不会阻挡足够的背景光，需要额外的盖子来防止图像采集的中断。

4. 延时采集期间

1. 在延时采集期间，通过激光安全箱上的滑动门（图 1I）每 8-12 小时（每天至少 2 次）用延时胚胎培养基重新填充敞开的浴室。
2. 在打开激光安全箱的门之前，请确保显微镜没有主动采集图像。
   注意：对于持续 24 至 48 小时的延时成像实验，不需要使用加热器和循环介质系统。事实上，载物台和在线加热器的温度都难以控制，并且在图像采集过程中，胚胎在 25-28 °C 的温度范围内表现出足够的发育速度。此外，循环介质系统容易溢出并可能损坏设备。因此，所有胚胎在获得后都定期分期。

5. 采集后处理

1. 在软件中，单击"文件"菜单并选择"保存"。
2. 在图像处理软件中打开文件（参见材料表）。突出显示正确的图像序列。在软件中，选择 "Process" 菜单。单击 3D Deconvolution 和 "Apply" 以对每个 z 堆栈进行反卷积><。 注意：文件很大;因此，此步骤可能需要很多小时。
3. 在软件的"Process"（处理）菜单下，单击"maximum projection"（最大投影）。单击"Apply"（应用）以启动最大投影，以每个 z 堆栈生成 1 张图像。将每个最大投影文件（每个 z 堆栈 1 个图像）导出为 tiff。
4. 将单个 tiff 文件导入视频处理软件。选择所有 tiff 文件并将它们拖到视频编辑器中。将视频中每张图片的长度调整为 0.1 秒。将视频导出为 mov 或 mp4 文件。

结果

多光子荧光延时成像产生一系列的视频显示斑马鱼线到眼前段中的甘油三酯 (sox10:EGFP) 和甘油三酯 (foxd3:GFP) 与颅面结构引起的颅神经嵴细胞的迁移模式。作为一个例子， sox10-12 和 30 hpf 之间的积极的神经嵴细胞迁移从神经管的边缘到颅面地区 (视频 1， 图 2)。来自前脑的两侧和中脑细胞迁移的背、 腹面的发展中国家的眼睛来填充眼周间质。此外，这些sox10阳性细胞形成鼻过程。蛤蚧神经嵴细胞迁移腹侧和引起咽拱门。延时成像的foxd3-30-60 之间的积极的神经嵴细胞 hpf 表明这些细胞迁移视杯和表面外胚层之间，通过眼裂（视频 2、图 3）。

讨论

多光子延时成像使体内追踪的瞬态和洄游的细胞群体。这个强大的技术可用于研究胚胎过程在真正的时间，并在本研究中，这种方法的结果加强的神经嵴细胞迁移和发展的当前知识。以前的延时成像研究通常利用共聚焦激光扫描显微镜。^29,30,31,32在这里，我们目前使用的多光子技术，相比传统的共焦显微镜有着许多优点。多光子显微镜的基础是两个较长的红外波长的光子用于激发荧光。因此，有较少的散射和因而降低的背景下，启用更深层次的组织渗透，实现成像深度超过 1 毫米更有效率比共聚焦显微镜检测生物组织中。这些属性也会减小光毒性的检测，是重要的考虑因素与重复和频繁的图像采集。^25,26,27从这些属性，双光子显...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带隔板的饲养罐	Aquaneering	ZHCT100	Crossing Tank Set （1.0 L） 带盖和插件的透明聚碳酸酯
M205 FA 组合望远镜	Leica Microsystems CMS GmbH		立体荧光显微镜 - FusionOptics 和 TripleBeam
Sodium chloride	Millipore （EMD）	7760-5KG	双 PE 袋。CAS 编号 7647-14-5，EC 编号 231-598-3
氯化钾	Millipore （EMD）	1049380500	氯化钾 99.999 Suprapur。CAS 号 7447-40-7，EC 号 231-211-8。
水氯化钙	Fisher Scientific	C79-500	聚乙烯瓶;500 克 CAS 编号 10035-04-8
硫酸镁（无水）	米利波尔 （EMD）	MX0075-1	聚合物瓶;500 克 CAS 编号 7487-88-9，EC 编号 231-298-2
亚甲蓝	米利波尔 （EMD）	284-12	玻璃瓶;25 克粉末，经认证的生物染色
氢钠	米利波尔 （EMD）	SX0320-1	聚乙烯瓶;500 克粉末，GR ACS。CAS 编号 144-55-8，EC 编号 205-633-8
N-苯硫脲	Sigma	P7629-25G	>98%。CAS 号 103-85-5，EC 号 203-151-2
二甲基亚砜	Sigma	D8418-500ML	分子生物学级。CAS 号 67-68-5，EC 号 200-664-3
Tricaine Methanesulfonate	Western Chemical Inc.	MS222	三卡因-S
低熔点琼脂糖	ISC Bioexpress	E-3112-25	GeneMate 筛 GQA 低熔点琼脂糖，25 g
开浴室	Warner Instruments	RC-40HP	高型
玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-545-102	圆形盖玻片。25 mm 直径
高真空润滑脂	Fisher Scientific	14-635-5C	2.0 磅管。道康宁公司 1658832
快速交换平台	华纳仪器	QE-1	35 毫米
载物台适配器	华纳仪器	SA-20LZ-AL	16.5 x 10 厘米
TC SP5 MP 多光子显微镜	徕卡显微系统 CMS GmbH
Mai Tai DeepSee 钛蓝宝石激光	光谱物理
激光安全箱	徕卡显微系统 CMS GmbH
徕卡应用程序套件 X （LAS X） 软件	Leica Microsystems CMS GmbH
Photoshop CS 6 版本 13.0 x64 软件	Adobe
iMovie 版本 10.1.4 软件	Apple