激光扫描与波长多光子荧光显微镜的先进光学技术组合的实施是为了捕获高分辨率的、 三维的、 实时成像中甘油三酯 (sox10:EGFP) 和甘油三酯 (foxd3:GFP) 斑马鱼胚胎神经嵴迁移。
方法文章
激光扫描与波长多光子荧光显微镜的先进光学技术组合的实施是为了捕获高分辨率的、 三维的、 实时成像中甘油三酯 (sox10:EGFP) 和甘油三酯 (foxd3:GFP) 斑马鱼胚胎神经嵴迁移。
先天性眼和颅颌面畸形反映神经嵴,流动人口的洄游的干细胞,导致整个身体的许多细胞类型的中断。了解神经嵴的生物学已经有限,反映出缺乏可以研究体内的转基因听话模型和实时。斑马鱼是特别重要的发展模式,为研究洄游的细胞群,如神经嵴。若要检查神经嵴迁移到眼睛发育,实施的结合激光扫描显微镜与长波长多光子荧光激发的先进光学技术是拍摄高分辨率的、 三维的、 实时的转基因斑马鱼胚胎,即甘油三酯 (sox10:EGFP) 和甘油三酯 (foxd3:GFP),在眼睛发育如sox10和foxd3已经在众多的动物模型,以调节早期神经嵴分化,他们可能代表神经嵴细胞的标记所示。多光子延时成像用来辨别的行为和早期眼发展作出贡献的两个神经嵴细胞群的迁徙模式。本议定书提供关于作为一个例子,斑马鱼神经嵴在迁移期间,生成的视频信息,并可进一步用于可视化斑马鱼和其他模式生物的很多建筑的早期发展。
先天性眼疾导致儿童失明,往往是由于异常的颅神经嵴。神经嵴细胞是瞬态的干细胞,起身从神经管形成许多机体全身。1,2,3,4,5前脑的两侧和中脑,神经嵴细胞,引起的骨和软骨的中部和额叶区和虹膜、 角膜、 小梁网和前段眼睛的巩膜。4,6,7,8神经嵴细胞从蛤蚧形式咽弓、 下巴和心脏流出道。1,3,4,9,10研究强调了贡献于眼部神经嵴和眼周发展,强调这些细胞在脊椎动物眼睛发育的重要性。事实上,中断的神经嵴细胞迁移和分化导致颅面部、 眼部异常如在阿克森费尔德丽格综合征和彼得斯加综合征。11,12,13,14,15,16,17因此,全面了解迁移、 增殖和分化的这些神经嵴细胞将提供洞察潜在先天性眼疾的复杂性。
斑马鱼是强大的模式生物研究眼发展,斑马鱼眼的结构类似于哺乳动物同行,以及许多基因进化保守斑马鱼和哺乳动物之间。18,19,20此外,斑马鱼胚胎是透明和卵生,促进眼发育的实时可视化。
扩大以前发表的作品,6,,720神经嵴细胞的迁移模式描述了使用多光子荧光延时成像上带有 SRY (性别决定区 Y) 的转录控制下的绿色荧光蛋白 (GFP) 的转基因斑马鱼线-框 10 (sox10) 或叉头框 D3 (foxd3) 基因调控区域。21,22,23,24.多光子荧光延时成像是一项强大的技术,结合先进的光学技术的激光扫描显微镜与长波长多光子荧光激发来捕获的标本,用荧光标记的高分辨率的三维图像。25,26,27多光子激光的使用已经超过标准的共焦显微镜,包括增加的组织的渗透和减少的荧光漂白明显的优势。
使用此方法,两个不同种群的神经嵴细胞迁移和洄游通道的时间变了可区分,即 foxd3 阳性神经嵴细胞在眼周间质和眼睛发育和颅面间质 sox10 阳性神经嵴细胞。使用此方法,介绍了可视化的斑马鱼的眼部和面部神经嵴迁移迁移方法,使其易于观察发展过程中实时调节的神经嵴迁移。
此协议提供信息以便在早期眼发育的甘油三酯 (sox10:EGFP) 和甘油三酯 (foxd3:GFP) 转基因斑马鱼作为示例生成定时视频。此协议可进一步用于任何来自神经嵴细胞在斑马鱼的眼部和面部结构的早期发展的高分辨率的、 三维的、 实时可视化。此外,这种方法进一步可以用于发展的其它组织和器官在斑马鱼和其他动物的模型可视化。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
此处描述的方案是根据密歇根大学动物使用和护理委员会 (UCUCA) 制定的实验动物人道待遇指南执行的。
1. 用于延时成像的胚胎采集
2. 用于延时成像的胚胎安装
3. 用于延时成像的显微镜设置
4. 延时采集期间
5. 采集后处理
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
多光子荧光延时成像产生一系列的视频显示斑马鱼线到眼前段中的甘油三酯 (sox10:EGFP) 和甘油三酯 (foxd3:GFP) 与颅面结构引起的颅神经嵴细胞的迁移模式。作为一个例子, sox10-12 和 30 hpf 之间的积极的神经嵴细胞迁移从神经管的边缘到颅面地区 (视频 1, 图 2)。来自前脑的两侧和中脑细胞迁移的背、 腹面的发展中国家的眼睛来填充眼周间质。此外,这些sox10阳性细胞形成鼻过程。蛤蚧神经嵴细胞迁移腹侧和引起咽拱门。延时成像的foxd3-30-60 之间的积极的神经嵴细胞 hpf 表明这些细胞迁移视杯和表面外胚层之间,通过眼裂(视频 2、图 3)。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
多光子延时成像使体内追踪的瞬态和洄游的细胞群体。这个强大的技术可用于研究胚胎过程在真正的时间,并在本研究中,这种方法的结果加强的神经嵴细胞迁移和发展的当前知识。以前的延时成像研究通常利用共聚焦激光扫描显微镜。29,30,31,32在这里,我们目前使用的多光子技术,相比传统的共焦显微镜有着许多优点。多光子显微镜的基础是两个较长的红外波长的光子用于激发荧光。因此,有较少的散射和因而降低的背景下,启用更深层次的组织渗透,实现成像深度超过 1 毫米更有效率比共聚焦显微镜检测生物组织中。这些属性也会减小光毒性的检测,是重要的考虑因素与重复和频繁的图像采集。25,26,27从这些属性,双光子显...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
这项工作提供了通过视觉研究的核心 (P30 EY007003) 与美国国立卫生研究院 (K08EY022912-01) 国家眼科研究所的赠款资助。
作者感谢托马斯 · 席林请送礼的甘油三酯 (sox10:eGFP) 鱼和玛丽哈洛伦的慈祥礼物甘油三酯(foxd3:GFP)鱼。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 带隔板的饲养罐 | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0 L) 带盖和插件的透明聚碳酸酯 |
| M205 FA 组合望远镜 | Leica Microsystems CMS GmbH | 立体荧光显微镜 - FusionOptics 和 TripleBeam | |
| Sodium chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | 双 PE 袋。CAS 编号 7647-14-5,EC 编号 231-598-3 |
| 氯化钾 | Millipore (EMD) | 1049380500 | 氯化钾 99.999 Suprapur。CAS 号 7447-40-7,EC 号 231-211-8。 |
| 水氯化钙 | Fisher Scientific | C79-500 | 聚乙烯瓶;500 克 CAS 编号 10035-04-8 |
| 硫酸镁(无水) | 米利波尔 (EMD) | MX0075-1 | 聚合物瓶;500 克 CAS 编号 7487-88-9,EC 编号 231-298-2 |
| 亚甲蓝 | 米利波尔 (EMD) | 284-12 | 玻璃瓶;25 克粉末,经认证的生物染色 |
| 氢钠 | 米利波尔 (EMD) | SX0320-1 | 聚乙烯瓶;500 克粉末,GR ACS。CAS 编号 144-55-8,EC 编号 205-633-8 |
| N-苯硫脲 | Sigma | P7629-25G | >98%。CAS 号 103-85-5,EC 号 203-151-2 |
| 二甲基亚砜 | Sigma | D8418-500ML | 分子生物学级。CAS 号 67-68-5,EC 号 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | 三卡因-S |
| 低熔点琼脂糖 | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate 筛 GQA 低熔点琼脂糖,25 g |
| 开浴室 | Warner Instruments | RC-40HP | 高型 |
| 玻璃盖玻片 | Fisher Scientific | 12-545-102 | 圆形盖玻片。25 mm 直径 |
| 高真空润滑脂 | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0 磅管。道康宁公司 1658832 |
| 快速交换平台 | 华纳仪器 | QE-1 | 35 毫米 |
| 载物台适配器 | 华纳仪器 | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 厘米 |
| TC SP5 MP 多光子显微镜 | 徕卡显微系统 CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee 钛蓝宝石激光 | 光谱物理 | ||
| 激光安全箱 | 徕卡显微系统 CMS GmbH | ||
| 徕卡应用程序套件 X (LAS X) 软件 | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 版本 13.0 x64 软件 | Adobe | ||
| iMovie 版本 10.1.4 软件 | Apple |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表
申请许可