量化人单核细胞趋化性 体外 和小鼠淋巴细胞迁移 体内

摘要

用于定量评估淋巴细胞趋化性和迁移性的实验方案是免疫学研究中的重要工具。此处，一个 体外 该方案可实现对细胞迁移进行实时、多重评估，以及一种互补的 体内 可实现对天然细胞向脾脏迁移的追踪技术。

摘要

趋化性是沿特定化学梯度的迁移¹趋化因子是一类具有趋化作用的细胞因子，可促进细胞以解剖学和时间特异性的方式进行迁移²趋化性是淋巴细胞及其他免疫细胞的关键功能，可通过定量方法进行评估 体外. 本文描述了可用于评估趋化性的方法 体外 和 体内，适用于多种细胞类型，包括细胞系和原代细胞。 体外基于平板的实验格式可在实时条件下同时比较多种情况，且可在1-4小时内完成。 体外 可以通过调整检测条件来引入激动剂和拮抗剂，并区分趋化性与化学动能，后者为随机运动。对于 体内 迁移能力评估中，可使用多种荧光染料标记免疫细胞，并用于过继性转移。对细胞进行差异性标记可将混合细胞群引入同一只动物体内，从而降低实验变异度，并减少为达到足够统计效能所需使用的动物数量。细胞迁移至淋巴组织的过程可在短至1小时的时间内发生，且可同时取样多个组织区室。在组织收获后通过流式细胞术进行分析，可快速、定量地评估多种细胞类型的迁移模式。

引言

强大的免疫反应需要多种细胞类型在时间和空间上的复杂协调，以恰当地应对损伤、感染并建立对自身抗原的耐受。目前已发现并鉴定了数十种趋化因子受体及其相应的配体，揭示了特定细胞在特定时间被引导至特定组织的分子机制。因此，研究趋化作用与细胞迁移是免疫学研究中不可或缺的组成部分。事实上，所描述的 体外 该检测方法最近被用作筛选工具，以鉴定一种趋化共因子，该因子可加速T细胞向C-C趋化因子19和21的趋化迁移³本文所述方法的目的是实现对免疫细胞趋化作用的定量评估 体外 和 体内.

Boyden小室（细胞迁移与侵袭）实验是一种经济、可重复且快速的细胞迁移评估方法^4,5在标准实验中，将细胞接种于上室，通过多孔插件与下室分隔，细胞可从中迁移至下室。在预定时间点，可对迁移至插件底面的细胞进行固定和染色，随后通过光学显微镜进行定量分析。然而，此类检测方法仅能获取单一终点数据，限制了动态数据的采集，且往往需要大量优化以确定最佳分析时间点。本文描述了多种改进方法，可实现趋化作用的实时、定量及多重检测。 体外.

对于 体内 研究中采用功能性终点指标，即细胞在特定组织区域的特异性聚集。通过过继转移将预先标记的供体细胞引入受体动物体内，随后在收获受体组织后，可通过流式细胞术鉴定这些供体细胞。本文还介绍了一种共标记策略，可在单个受体动物体内同时检测不同类型细胞的迁移行为。该方法消除了细胞注射过程中个体间差异，并校正了生理状态下的个体间变异。

方案

所有实验程序均经洛克菲勒大学机构动物护理和使用委员会批准。所有动物均饲养于特定病原体阴性条件下。

1. 体外 趋化性

1. 在补充有10%胎牛血清（FBS）和4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES；25 mM）的Roswell Park Memorial Institute 1640（RPMI 1640）培养基（完全培养基）中培养THP-1细胞⁶，维持细胞密度在0.5–1.0 × 10⁶ 个细胞/mL之间。
2. 在35 mm细胞培养皿中，将每种条件下3.5 × 10⁵个THP-1细胞用乙酰氧甲基钙黄绿素（calcein-AM；2.5 µM）或其他合适的荧光染料在完全培养基中于37 °C孵育30分钟进行标记。
   注：染料必须具有细胞膜通透性，并适用于活细胞标记。
3. 将酶标仪预热至37 °C。
   注：除温度控制外，还需具备底部读数功能。参见步骤1.10.2中用于定量迁移细胞的酶标仪替代方法。
4. 在细胞标记的同时，准备检测板和下室。
   1. 使用24孔组织培养板，每孔对应一个条件。每个条件设三个重复。
   2. 向24孔板中加入750 µL含25 mM HEPES和0.1%牛血清白蛋白（BSA）的Hank's平衡盐溶液（HBSS）。此作为基础对照条件。
      1. 其他孔用于设置对照条件，始终维持下室总体积为750 µL。
         注：本示例中，人单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）作为趋化作用的阳性对照⁷。
         1. 通过将HBSS与25 mM HEPES、BSA（0.1%）和MCP-1（75 ng/mL）混合配制试剂混合液。使用含MCP-1的成人牛血清（2.7% v/v）作为额外的阳性对照。
            注：趋化因子及其浓度取决于所研究的趋化轴。冻干MCP-1用含BSA（0.1%）的蒸馏水重悬，配制成终浓度为50 μg/mL的储存液。该储存液可进一步用水稀释成10 μg/mL的工作液。取5.6 μL该工作液加入下室。
   3. 当下室溶液配制完成后，将多孔插入式小室放入各孔中，确保插入小室的卡舌与板上的凹槽对齐。
      注：选择合适孔径的插入小室。对于单核细胞和淋巴细胞，3 μm孔径效果良好。某些细胞类型和/或趋化因子系统可能需要基质包被表面以实现最佳迁移。例如，在检测THP-1单核细胞向MCP-1趋化时，推荐使用纤维连接蛋白或胶原蛋白包被的插入小室。若使用酶标仪进行定量，插入小室必须具有不透光涂层（如聚对苯二甲酸乙二醇酯），以防止检测到上室中未迁移的细胞⁸。
5. 将细胞与calcein-AM孵育30分钟后，转移细胞悬液至15 mL锥形管中。在1,000 × g离心2分钟。肉眼观察细胞以确认calcein-AM的摄取情况（图1）。
6. 使用真空抽吸装置小心去除上清液。用含25 mM HEPES的无血清RPMI 1640培养基洗涤标记后的细胞。在1,000 × g离心2分钟，弃去上清液。
7. 将细胞重悬于含25 mM HEPES的无血清RPMI 1640培养基中。计数细胞并调整体积，使细胞终浓度为1.0–1.5 × 10⁶ 个细胞/mL。
8. 向插入小室（上室）中加入250 μL细胞悬液。
9. 所有上室加样完毕后，轻轻提起培养板，检查底部是否存在可能干扰细胞迁移和检测的气泡。若发现气泡，可先尝试取出并重新放置插入小室；若无效，可用27 G针头刺破气泡后再重新放置插入小室。
10. 将培养板放入已预热至37 °C的酶标仪中。
    1. 以1–3分钟间隔从底部采集荧光读数。使用calcein-AM时，设定荧光激发波长为485 nm，发射波长为520 nm。根据细胞类型和趋化因子系统的不同，趋化作用通常在1–4小时内完成（图2A）。
    2. 作为酶标仪连续测量的替代方法，可使用倒置荧光显微镜（图2B）对各孔成像，显微镜需具备485 nm激发和520 nm检测能力。使用低倍镜捕获插入小室底面的大部分区域。通过ImageJ或类似软件处理图像以定量细胞数量⁹。

2. 小鼠淋巴细胞的过继转移

1. 供体细胞的制备
   1. 使用异氟烷麻醉剂（1–3%）通过蒸发器对8–12周龄的C57BL/6J雄性供体小鼠进行麻醉。通过脚趾夹捏法确认麻醉深度是否合适。
   2. 将小鼠置于仰卧位，用手术刀做正中切口，在左上腹腔区域定位脾脏。完整切除脾脏并放入冰上预冷的完全培养基中（RPMI添加10%胎牛血清和25 mM HEPES；每只脾脏1 mL）。通过断头法处死已麻醉的供体动物。
   3. 用注射器活塞末端将脾组织轻轻研磨通过40 µm尼龙筛网，加入完全培养基（每只脾脏1 mL）以制备单细胞悬液，并转移至15 mL锥形管中。
   4. 加入4倍体积的氯化铵-钾（ACK）裂解缓冲液，在室温下孵育5分钟以裂解红细胞。
   5. 在室温下以1,000 × g离心2分钟，弃去上清液。若沉淀中仍有红细胞残留，用ACK裂解缓冲液重悬，室温孵育5分钟，再以1,000 × g离心2分钟，弃去上清液。
   6. 将细胞重悬于完全培养基中，浓度为2–5×10⁷ 个细胞/mL，然后将细胞悬液通过40 µm尼龙筛网过滤，以去除细胞碎片。
   7. 每只受体小鼠使用1×10⁷ 个细胞，用一种适用于活细胞且固定后仍可保留荧光的染料进行标记，例如5-氯甲基荧光素二乙酸酯（终浓度2 μM）¹⁰。在37 °C孵育30分钟。
      注：若需追踪多个细胞群体，可对不同细胞群体使用其他荧光染料。例如，部分供体细胞可用5-(和-6)-(((4-氯甲基)苯甲酰)氨基)四甲基罗丹明（终浓度2 μM）进行标记¹¹。
   8. 加入4倍体积的HBSS（含25 mM HEPES），在1,000 × g下离心2分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于含25 mM HEPES的HBSS中，最终浓度为1×10⁸ 个细胞/mL。
      1. 若使用多种荧光染料，应将不同细胞群体分开保存，直至注射前即刻混合。
      2. 取每种颜色细胞的小量等分试样（10 μL）加入固定液（1 mL）中，用于后续流式细胞术补偿调节。
2. 淋巴细胞转移
   1. 使用异氟烷（1–3%）通过蒸发器对8–12周龄的C57BL/6J雄性受体小鼠进行麻醉；通过脚趾夹捏法确认麻醉深度。在动物眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。
   2. 短暂涡旋供体细胞（1秒），转移至带有27 G、0.5英寸针头的1 mL注射器中；如适用，可在此时混合不同标记的细胞群体。
      1. 取少量混合细胞（10 μL）加入固定液（1 mL）中，用于后续流式细胞术分析。
   3. 将受体小鼠置于俯卧位，在眼球背侧皮肤施加轻度尾向压力，使眼球轻微突出。
   4. 将针头朝向内侧，每只受体小鼠经眶后静脉注射100 µL供体细胞悬液。也可通过尾静脉注射细胞。
   5. 缓慢拔出注射针头，将小鼠单独放入恢复笼中。监测动物直至其恢复意识；完全恢复后将其放回群养笼具中。
3. 样本采集与分析
   1. 注射1小时后，使用异氟烷麻醉剂（1–3%）通过蒸发器对受体小鼠进行麻醉；通过脚趾夹捏法确认麻醉深度。从每只受体小鼠中取出脾脏（或其他目标组织）（操作同步骤2.1.2），放入完全培养基中（每只受体1 mL）。通过断头法处死已麻醉动物。
      注：延长组织采集前的时间间隔可增加组织中细胞的积累，至少可持续至24小时。
   2. 用注射器活塞末端将脾组织轻轻研磨通过40 µm尼龙筛网，加入完全培养基以制备单细胞悬液，并转移至15 mL锥形管中。
   3. 加入4倍体积的ACK裂解缓冲液，在室温下孵育5分钟。将细胞悬液在室温下以1,000 × g离心2分钟，弃去上清液。
   4. 将细胞重悬于染色缓冲液（含1% FBS的磷酸盐缓冲液）中。计数细胞并调整至终浓度为3×10⁷ 个细胞/mL。取100 µL细胞悬液加入96孔圆底板中。
   5. 根据流式细胞术分析需求，对细胞进行目标标志物染色（参见材料表）。加入针对目标标志物的荧光素偶联抗体（参见材料表），在4 °C避光孵育20分钟。加入100 µL染色缓冲液，以1,000 × g离心3分钟，弃去上清液。
   6. 将沉淀重悬于200 µL染色缓冲液中，以1,000 × g离心3分钟，弃去上清液。
   7. 将沉淀重悬于125 µL染色缓冲液中，按照标准操作流程使用流式细胞仪获取数据。
      注：绿色荧光染料由488 nm激光激发，发射光通过505和530/30二向色滤光片检测。橙色荧光染料由561 nm激光激发，发射光通过582/15二向色滤光片检测。
      1. 使用步骤2.1.8.2中保存的细胞对每种荧光染料进行补偿调节。
         注：若使用与标记染料激发和发射光谱相匹配的荧光微球进行补偿，可能导致补偿效果不理想。
      2. 使用步骤2.2.2.1中保存的输入细胞样本，准确确定不同标记输入细胞的比例（当使用多个标记细胞群体时）（图3）。根据标记细胞与未标记细胞的比例计算组织特异性迁移情况（图4）。

结果

使用钙黄绿素-AM（calcein-AM）染料时，通过显微镜观察细胞可确认染料的摄取情况（图1）。通过自动荧光检测，可追踪细胞随时间迁移至小室膜下表面的过程。这些数据清晰地显示，单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）可诱导细胞迁移，且血清可增强该反应（图2A）。根据趋化刺激的强度不同，在荧光信号增加之前通常存在至少15分钟的延迟。荧光信号可能达到峰值后逐渐下降，这表明由于细胞从上室迁移至下室的速度快于其附着在膜下表面的速度，导致附着在小室下表面的细胞数量净减少。较强的趋化刺激通常会导致：a）荧光值上升的起始时间更早；b）荧光值上升速率更快；c）荧光峰值更高。同时提供了倒置荧光显微镜拍摄的代表性图像（图2B），以及细胞计数的定量结果（图2C）。

讨论

免疫细胞迁移的定量可通过简单且快速的实验方法实现 体外 和 体内我们展示了 体外 人单核细胞对MCP-1浓度梯度的趋化反应及血清的增强作用 体内供体小鼠脾细胞经差异标记后，通过过继性转移，并从受体动物中回收。

使用酶标仪的优势在于可以采集多个时间点的数据（频率可高达每30秒一次），并自动定量迁移的细胞，从而避免了仅选择单一时间点进行评估的局限性，也无需采用耗时费力的手动计数各孔细胞的方法。此外，该方法能够提供比显微镜观察更为动态的信息。在分析过程中需要注意，部分细胞会从插件上脱落并进入下室，这些细胞不会对荧光强度产生贡献。因此，插件底部所检测到的细胞数量（以相对荧光强度表示）取决于细胞迁移速率以及细胞从插件上脱落的速率。

较大的细胞可能需要使用孔径更大的小室，目前可提供孔径为 8 μm 的小室。较小的细胞（包括天然淋巴细胞）发出的荧光可能过弱，无法被荧光计可靠检测，可能需要通过显微镜进行评估，尤其是在趋化性发生微小变化时。某些细胞类型可能迅速进入下室溶液中...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI-1640	赛默飞世尔科技	11875-093
HEPES	赛默飞世尔科技	15630-080
胎牛血清	美国典型培养物保藏中心（ATCC）	30-2020
细胞培养瓶	康宁公司	353136
Calcein AM	赛默飞世尔科技	C1430	激发波长：485nm，发射波长：520nm
细胞培养皿	康宁公司	1007
24孔板	康宁公司	353504
Fluoroblok 纤连蛋白插入式培养小室	康宁公司	CB354597
15 mL 圆锥形离心管	康宁公司	352097
牛血清白蛋白	Cell Signaling Technology	9998S
人重组MCP-1	Peprotech	300-04
成年牛血清	西格玛（Sigma）	B9433
含钙和镁、不含酚红的HBSS	赛默飞世尔科技	14025-092
SpectraMax M2e 酶标仪	分子器件公司（Molecular Devices）
奥林巴斯IX71 倒置荧光显微镜	奥林巴斯
Isothesia	亨利·谢恩动物健康公司（Henry Schein animal health）	11695-6776-2	异氟烷麻醉剂
40 µm 尼龙细胞滤筛	康宁法尔肯（Falcon Corning）	352340
ACK 溶血缓冲液	Quality Biological	118-156-101
CellTracker Orange CMTMR 荧光染料	赛默飞世尔科技	C2927	激发波长：541nm，发射波长：565nm
CellTracker Green CMFDA 荧光染料	赛默飞世尔科技	C2925	激发波长：485nm，发射波长：520nm
5 ml 注射器	BD 注射器	309646
1 ml TB 注射器	BD 注射器	309625
THP-1 细胞系	美国典型培养物保藏中心（ATCC）	TIB-202
Brilliant Violet 421 抗小鼠 CD3 抗体	Biolegend	100228	激发波长：405nm，发射波长：421nm
Brilliant Violet 605 抗小鼠 CD19 抗体	Biolegend	115540	激发波长：405nm，发射波长：603nm
96孔圆底板	康宁公司	353077
LSRII	BD 生物科学		流式细胞仪