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方法文章

利用近红外荧光标记DNA并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可视化的DNA聚合酶活性检测

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DOI：

10.3791/56228

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2017年10月6日

 , 
1Department of Chemistry, W.M. Keck Science Department of Claremont Mckenna, Pitzer, and Scripps College

本文内容

摘要

本方案通过凝胶电泳和凝胶成像观察近红外荧光标记DNA的变化，描述了DNA聚合酶合成修饰DNA的表征方法。丙烯酰胺凝胶可用于高分辨率成像短核酸片段的分离，这些片段根据大小不同而以不同速率迁移。

摘要

对于任何酶而言，均需要可靠的定量方法来表征天然酶和工程酶的性质。对于DNA聚合酶，DNA合成活性可通过以下方法进行表征： 体外 DNA合成测定结合聚丙烯酰胺凝胶电泳。该实验的目的是定量检测天然DNA和修饰DNA（M-DNA）的合成情况。这些方法特别适用于分辨具有单核苷酸分辨率的寡核苷酸，从而能够观察酶促寡核苷酸合成过程中的各个独立步骤。这些技术已被应用于评估多种生物化学与生物物理特性，例如测定DNA合成各步骤的稳态速率常数、DNA合成错误率以及DNA结合亲和力。通过使用包括但不限于修饰核苷三磷酸（NTP）、M-DNA和/或突变型DNA聚合酶在内的修饰组分，可有效评估底物-DNA聚合酶配对的相对效能。本文详细描述了该测定方法本身，包括为适应非传统引物DNA标记策略（如近红外荧光标记DNA）所需进行的调整。此外，我们还详述了聚丙烯酰胺凝胶灌制与电泳过程中的关键技术步骤，这些步骤通常具有较高的技术难度。

引言

DNA聚合酶能够准确高效地进行DNA合成，对维持基因组完整性至关重要。in vivo条件下，DNA聚合酶每秒可合成数百个核苷酸且几乎不发生错误，这一特性也使其成为分子生物学和生物技术中不可或缺的工具。然而，这些特性也限制了其在M-DNA底物中的应用；通常而言，天然DNA聚合酶无法合成许多具有潜在价值的M-DNA底物，这可能是由于生物体内对非标准底物的使用存在强烈的选择压力。许多研究团队已开发出定向进化方法，以获得能够合成M-DNA的突变型DNA聚合酶1a,2,3,4,5；这些研究显著拓展了DNA在生物技术中的应用范围6,7,8。

为了评估突变型DNA聚合酶合成M-DNA的能力，我们9,10以及其他11,12,13 通常使用 体外 DNA聚合酶活性的测定方法在本文中有详细描述。在这些实验中，将DNA聚合酶与标记的引物/模板双链以及核苷三磷酸底物共同孵育，反应产物通过凝胶电泳进行分析。根据具体实验目的，可使用突变型DNA聚合酶、修饰的引物、修饰的模板或修饰的核苷三磷酸，从而实现对突变酶活性的系统性生化评估。

传统上，这些检测方法依赖于5'端放射性标记来追踪DNA合成；最常用的是32P和33P；通常通过T4多核苷酸激酶实现标记11。然而，由于放射性标记物的半衰期有限、成本相对较高，且需要安全处理和处置，我们课题组转而采用合成的5'端近红外荧光染料标记DNA。使用一种成本相对较低的近红外凝胶成像系统，我们观察到其检测灵敏度与先前使用放射性标记的研究相当（未发表结果）。我们成功重现了以往的研究结果9，且未发现所测得的反应速率常数在定量上有显著差异（未发表结果）。

为了分析DNA的大小，从而评估DNA合成的程度，我们采用最初为桑格测序法开发的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法14，该方法早于毛细管电泳技术的出现15。迁移距离或迁移率可用于测定分子量；大尺寸垂直聚丙烯酰胺凝胶可实现单核苷酸分辨率，从而能够对不同长度的DNA寡核苷酸进行定量观察。

总体而言，这些实验是聚合酶表征的可靠方法。由于反应对时间敏感，必须充分准备并谨慎操作，才能获得可重复的结果。此外，尽管聚丙烯酰胺凝胶能够以单核苷酸分辨率高效检测DNA合成以及多种其他DNA修饰反应，但其技术难度较高。本方案有望帮助使用者开展这些实验，并避免最常见的错误。

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方案

1. 活性测定

注意：使用此处所述方法表征DNA聚合酶时，通常会进行两种典型类型的实验。它们的区别在于，是定性地表征整体合成过程（涵盖DNA合成的多个步骤），还是定量地聚焦于单个步骤。我们将在下文分别描述每种实验所需的步骤。
注意：由于材料的配制相对复杂，对于时间敏感的实验，我们建议预先配制好所有材料。实验中所有关键组分的配方均列于下文。各组分的商业供应商见材料表。

  1. 10x SF 缓冲液配方（10x SFB）
    注意：在我们的实验中，通常使用水生栖热菌（Thermus aquaticus）DNA 聚合酶 I 的 N 端截短形式，通常称为 Stoffel 片段（SF）16,17。此处提供的配方是 SF 的首选缓冲液3,13。根据具体的 DNA 聚合酶，也可使用其他缓冲液。
    注意：10x SF 缓冲液各组分的终浓度为 500 mM Tris（pH 8.5）、65 mM MgCl2、0.5 mg/mL BSA、500 mM KCl（s）以及超纯水。所列用量适用于配制 1 mL SF 缓冲液，可满足 100–200 次实验，具体用量视实验规模而定。该缓冲液可在 -20 °C 长期保存。
    1. 在 1.5 mL 离心管中加入 0.5 mL 1 M Tris、65 µL 1 M MgCl2、50 µL 10 mg/mL BSA 和 0.0373 g KCl（s），再加入 385 µL 超纯水，定容至 1 mL。
  2. 1x 储存缓冲液配方（1x SB）
    注意：1x 缓冲液各组分的终浓度为 50 mM Tris（pH 7.5）、1 mM DTT、0.6 mM EDTA 和 50% 甘油。该配方可配制 20 mL 1x SB。
    1. 在 50 mL 锥形管中加入 0.012 g DTT、100 µL 0.5 M EDTA，并加入 40 mL 100 mM Tris（pH 7.5）以配制 2xSB。通过涡旋混合均匀。
    2. 将 10 mL 2x SB 转移至新的 50 mL 锥形管中，再加入 10 mL 甘油进行稀释。
  3. 橙色淬灭缓冲液配方（QBO）
    注意：当使用放射性标记时，使用者通常会采用溴酚蓝和/或二甲苯青作为电泳进程的示踪染料。然而，这些染料在近红外区域会产生微弱荧光，干扰 DNA 信号。因此，我们在所有含样品的反应中使用橙黄 G（Orange G）替代上述染料。尽管我们发现橙黄 G 适用于凝胶加样过程的示踪，但其在追踪电泳进程方面的一致性较差；因此，我们在不含样品的凝胶外侧泳道中设置仅含溴酚蓝的空白泳道，以监测电泳进程。
    1. 将 950 µL 95% 甲酰胺与 25 µL 0.5 M EDTA 和 25 µL 超纯水混合，加入 1 勺橙黄 G 染料（约 10 mg）。通过涡旋混合均匀。
      警告：甲酰胺具有毒性；操作时应穿戴个人防护装备（PPE），如手套、护目镜和实验服，并按危险废物处理。

2. 检测运行

  1. 整体活性的定性表征
    注意：在此实验中，我们通常保持 M-NTPs 浓度恒定，而改变反应时间。目的是评估蛋白质的整体特性，而非测定任何单个步骤。为准备一次反应，需分别配制等体积的两种组分——双链混合物（见步骤 2.1.1）和 dNTP 混合物（见步骤 2.1.2），然后混合，得到终体积为 49 µL 的反应体系。加入 1 µL 50 倍浓度的酶后即启动反应。可设置多个不同的反应时间点；通常我们在 0、5、15 和 60 分钟时终止反应。
    1. DNA双链混合物的制备
      注意：双链混合液由10x SF缓冲液、引物寡核苷酸、模板寡核苷酸和超纯水组成。每项反应中加入的总体积为25 µL。在实验启动前，立即向总混合液中加入1 µL酶。
      注意：在我们的实验中，通常使用45碱基的模板和18碱基或23碱基的引物。尽管可使用多种不同长度的引物和模板，但我们倾向于采用这种长度，因为产物（长度范围为18至45个核苷酸）可通过所述的凝胶电泳方案在单核苷酸水平上实现清晰分辨。随着寡核苷酸产物长度的增加，可能难以在单核苷酸分辨率下有效分辨产物。
      注意：在我们的实验中，我们在引物链上使用5'近红外荧光染料标记以观察引物产物。我们采购经过该修饰的定制合成寡核苷酸；然而，也可通过多种合成后标记策略引入此标记。模板寡核苷酸未作标记，因此在凝胶成像仪中无法观察到。对于这两种寡核苷酸，均以100 µM浓度储存于10 mM Tris（pH 8）、1 mM EDTA溶液中。
      注意：由于我们仅观察引物，因此使用两倍过量的模板，以确保所有引物（被观测的DNA物种）均与模板退火。本反应中双链的最终浓度为40 nM。
      注意：近红外荧光染料通常对光较为敏感；在可能的情况下，我们用铝箔包裹引物（以及含有引物的任何溶液），包括在聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中也应将其覆盖。
      注意：以下是2'F M-DNA合成的一个代表性示例。
      1. 稀释引物1和模板1（参见 材料表 将序列（for sequence）在超纯水中稀释至各1 µM。
      2. 在适用于PCR仪的离心管中，为每个检测反应分别加入5 µL 10x SF缓冲液、2 µL 1 µM引物1、4 µL 1 µM模板1以及13 µL超纯水。
      3. 在热循环仪中退火双链，程序如下：98 °C 2分钟，70 °C 5分钟，50 °C 5分钟，40 °C 5分钟，保持在25 °C。具体程序可能因引物/模板双链的退火温度而异。通常，我们倾向于在退火温度下至少进行一个5分钟的步骤，随后在比退火温度低5–10 °C的温度下再进行一个5分钟的步骤。
    2. 2x dNTP 混合液的制备
      注意：根据实验的不同，可使用不同种类和浓度的dNTP。通常，我们在反应中使用50 - 200 µM的dNTP。
      1. 配制25 µL溶液，其中每种2'F-NTP的浓度为100 µM。将M-NTPs储存于100 mM浓度下。
    3. 50倍蛋白稀释液的配制
      注意：酶应保存在 -20 °C 的 1xSB 缓冲液中以用于长期储存。从 -20 °C 冰箱取出后，酶在加入主混合液之前应始终置于冰上。酶的稀释液应每天使用时从浓缩母液新鲜配制。浓缩酶母液在使用后应立即放回 -20 °C 冰箱。
      注意：由于我们主要评估突变型DNA聚合酶，因此仅使用通过本实验室已建立的方法进行表达和纯化的酶9,10对于商业购买的聚合酶，使用者应注意不同蛋白质的最佳缓冲液及其与本文所述缓冲液的兼容性。
      注意：每项实验的酶浓度可能有所不同。此处以2'F-DNA合成为例，展示一个代表性实例。
      1. 配制10 nM酶溶液时，将1 µL酶加入1x SB缓冲液中，得到终浓度为50倍的酶溶液。该50倍浓缩液的酶浓度应为500 nM。例如，若酶的储存液浓度为50 µM，则取1 µL储存液加入99 µL的1x SB缓冲液中。
        注意：由于酶通常保存在50%甘油中，溶液较为黏稠。即使使用高精度移液器，考虑到酶稀释过程中准确性和精密度的重要性，也不建议移取小于0.5 µL的体积。
    4. 启动检测
      1. 将干浴器的温度设置为 50 °C。
      2. 将24 µL退火双链混合物（见步骤2.1.1）加入25 µL的2x dNTPs中（见步骤2.1.2）。
      3. 从步骤 2.1.4.2 的混合物中取出 9.8 µL，加入 20 µL QBO 中（配方见第 1.3 节）。此份 aliquot 作为 "无酶" 对照组应在每次实验运行中获取。
      4. 加入0.8 µL的50倍酶（见步骤2.1.3.1）至双链/dNTP混合物中。使用大容量移液器反复吹打，充分混匀。
      5. 在5、15和60分钟时，取10 µL各反应溶液，加入含20 µL QBO（见第1.3节描述）的微量离心管中，以终止反应。
      6. 淬灭后，反应液可用铝箔包裹并在4 °C或-20 °C长期保存。
        注意：为了对M-DNA合成的各个步骤进行定量表征，可采用一种非常相似的实验方法，以定量获得米氏动力学参数。该实验使用完全相同的材料。米氏动力学参数可用于测定dNTP的反应特性；在此情况下，最主要的区别在于，不是将双链混合物加入dNTP混合物中，而是将含有酶的双链混合物加入一系列2倍浓度的dNTP溶液中。类似地，也可针对DNA双链体测定米氏动力学参数。为满足使用米氏方程所需的前提假设，必须满足特定实验条件。这些条件以及该实验的基本操作原理在之前发表的方法学文章中有详细说明。11.

3. 凝胶电泳

注意：由于灌胶步骤对时间敏感，所有材料需预先准备就绪。以下列出了实验关键组分的配方；试剂供应商见材料表。

  1. 制备用于20%丙烯酰胺凝胶的丙烯酰胺溶液。
    注意：该配方可制备1 L丙烯酰胺混合液；每块凝胶约使用120 mL此溶液。将该溶液在室温下避光保存，可稳定存放长达一年。
    警告：聚丙烯酰胺具有神经毒性。在凝胶灌注的所有步骤中，必须佩戴手套和实验服。若聚丙烯酰胺污染手套，应立即更换手套。若丙烯酰胺未聚合，需将受污染材料放入标有“聚丙烯酰胺废弃物”的专用垃圾袋中。
    注意：本实验方案使用预混的40%丙烯酰胺溶液，其中含38.67%丙烯酰胺和1.33%双丙烯酰胺，单体与交联剂比例为29:1。
    1. 称取17 g预混TBE粉末。分别称取六份70 g尿素（共420 g）。
      注意：尿素必须分批加入。我们发现将其分为六份效果最佳。
    2. 将一个2 L塑料烧杯置于磁力搅拌器上，在烧杯中放入一根较大的搅拌子。混合过程中用铝箔覆盖烧杯，以防止液体飞溅。
    3. 向烧杯中加入500 mL 40%丙烯酰胺溶液。确保溶液正在搅拌。
    4. 加入先前称量好的TBE粉末。加入一份尿素，让溶液充分混合。尿素溶解较慢，初加入时溶液可能呈浑浊白色。在接下来的一小时内，缓慢地将剩余的尿素分批加入混合液中。持续搅拌，直至溶液完全澄清无色。
      注意：通常建议搅拌过夜。若尿素仍未完全溶解，可加入少量水并等待其溶解。
    5. 加入尿素后，溶液体积接近1 L。加水将体积精确调整至1 L。
    6. 将溶液储存于1 L棕色玻璃瓶中，或用铝箔包裹玻璃瓶避光保存。
  2. 灌注丙烯酰胺凝胶。
    注意：操作玻璃板时，应避免其与任何硬物表面接触。这一点尤为重要，因为粗暴操作可能导致玻璃出现微小裂纹；这些裂纹在高温运行凝胶前可能无法察觉。我们使用软木环来防止此类意外接触。
    1. 清洗玻璃板
      1. 取两块33 cm × 42 cm的凝胶玻璃板，一块带缺口，一块无缺口。将玻璃板分别放置在软木环上。
      2. 用肥皂和水彻底冲洗玻璃板，确保无肥皂残留或凝胶斑点。
      3. 注意观察玻璃板哪一侧水珠更少，该侧即为凝胶面。
        注意：若在玻璃板的另一侧进行电泳，可能导致凝胶转膜困难。
    2. 干燥玻璃板
      1. 用纸巾擦干每块玻璃板的两面。
      2. 使用精细擦拭纸巾擦干其余区域，特别注意将要贴胶带的边缘部分。
      3. 用约70%乙醇冲洗玻璃板，并用擦拭纸巾擦拭。
      4. 确保无纸巾纤维或水滴残留，这些杂质在灌胶时可能产生气泡。
    3. 添加垫片
      1. 取0.75 mm厚的垫片。将戴着手套的手指浸入去离子水中，轻轻润湿垫片。
      2. 将垫片沿带缺口玻璃板的长边放置。清理溅到玻璃板其他区域的水滴。确保垫片与玻璃板对齐，不超出边缘。
    4. 密封凝胶模具
      1. 戴上干燥手套，再次用精细擦拭纸巾擦干玻璃板边缘。
      2. 将无缺口玻璃板对准带缺口玻璃板上方，缓慢下压使两块玻璃板紧密贴合。再次检查所有边缘是否对齐。
      3. 使用凝胶胶带将除顶部外的所有边缘密封。确保胶带均匀对齐且紧密贴合。胶带可一次性贴好，也可逐边粘贴。用刀片裁剪胶带末端。
      4. 在凝胶模具底部再加一层胶带。胶带贴得越紧，灌胶时越不易泄漏。
      5. 用白色夹子夹紧玻璃板夹层结构。每侧加3个夹子，底部加4个夹子。
    5. 灌注凝胶
      1. 通过将0.3 g过硫酸铵溶于超纯水中并定容至3 mL，配制3 mL 10%过硫酸铵（APS）溶液。
        注意：每块凝胶需使用1.2 mL APS溶液。配制后标注日期。APS溶液有效期为2周，应保存于4 °C。
      2. 将125 µL四甲基乙二胺（TEMED）转移至另一微量离心管中。
        注意：TEMED有毒，操作时应穿戴个人防护装备（如手套、护目镜和实验服）。
      3. 取一个挤压瓶，移除尖嘴漏斗。用量筒量取125 mL水加入瓶中，并用记号笔在瓶外标记水位线。倒掉水。此改装后的挤压瓶经适当清洗后可无限次重复使用（见下文）。
      4. 将软木环置于水槽旁，以便灌胶后放置凝胶。将玻璃板夹层结构放于此处。在水槽中放置一块软木，以便灌胶时支撑玻璃板。灌胶时需倾斜倒入玻璃板夹层，底部靠在软木上，顶部靠在水槽边缘。在这些区域下方应垫好防护垫，以防聚丙烯酰胺溢出。
      5. 将APS溶液和TEMED溶液与空挤压瓶一起放在水槽另一侧。将所需孔数的梳子放在靠近玻璃板的水槽边。将4个夹子放在附近。
        注意：下一步操作时间非常关键，需准备迅速完成各步骤。在混合液聚合前，必须尽快将其注入玻璃板之间。所有组件（已预设体积的移液器、溶液、玻璃板）应有序摆放，以便快速灌胶。若希望减缓聚合速度，可将APS和TEMED浓度减半；但此操作将延长聚合时间。
      6. 将20%丙烯酰胺凝胶溶液倒入挤压瓶至标记线处。可略高于标记线，以防少量泄漏导致溶液不足。此用量约为120 mL凝胶溶液。
      7. 同时向挤压瓶中的聚丙烯酰胺凝胶溶液中加入120 µL TEMED和600 µL APS。迅速再加入600 µL APS。
      8. 快速盖紧挤压瓶并轻轻旋转混匀。将玻璃板夹层结构放入水槽中。
      9. 开始灌胶。整个过程应在1–2分钟内完成，以避免过早聚合。缓慢而稳定地挤压瓶子，使凝胶溶液均匀流出。若溶液从瓶口不规则喷溅，应松开压力使瓶子重新充气，然后继续灌注。注意观察凝胶是否覆盖所有区域，是否有泄漏。为消除气泡，可调整玻璃板角度。气泡会在顶部破裂，角度越陡，气泡移动越快。持续灌注直至溶液到达缺口区域顶部并略微溢出缺口边缘。彻底清除所有气泡。
        注意：若玻璃板夹层泄漏，或凝胶溶液不足未能到达玻璃板顶部，则该凝胶不可用。需等待凝胶完全聚合后妥善清理。
      10. 将梳子插入玻璃板夹层中。在梳子上放置4个夹子，向下压紧，以确保加样孔分布均匀。
      11. 迅速将挤压瓶中剩余的凝胶溶液倒入标有“聚丙烯酰胺废弃物”的容器中。用去离子水通过喷嘴冲洗挤压瓶2– 3次。
        注意：必须迅速完成清洗，以防聚丙烯酰胺堵塞挤压瓶。若喷嘴内发生轻微聚合，下次灌胶将过慢且无法成功。一旦发生聚合，应丢弃挤压瓶。
  3. 运行丙烯酰胺凝胶电泳
    1. 在凝胶聚合的同时，配制1×TBE电泳缓冲液。将17 g预混TBE固体溶解于1 L超纯水中，摇动至完全溶解。
    2. 移除玻璃板夹层上的所有夹子。
    3. 用刀片割开胶带，并从玻璃板夹层的所有边缘去除胶带。
    4. 清除玻璃表面所有已聚合的凝胶。用刀片沿边缘刮除残留凝胶。用纸巾和水擦拭玻璃板，尽可能去除聚丙烯酰胺残留物。多余的丙烯酰胺和/或胶带在电泳过程中可能烧焦。
    5. 从两侧均匀推出梳子，将其移除。
    6. 用刀片切除玻璃板夹层顶部多余的凝胶，沿玻璃板缺口边缘切割。
    7. 使用注射器和去离子水冲洗加样孔，清除孔内碎屑。确保每个加样孔均可注满水，且未被聚合凝胶堵塞。
    8. 将玻璃板夹层放入电泳装置中，使较长的玻璃板朝外，缺口侧朝内。
    9. 使用夹子将玻璃板夹层与铝板固定在装置上。夹子应加在外部，以促进均匀电泳。
    10. 加入TBE缓冲液，覆盖底部缺口，并刚好浸没顶部加样孔。TBE缓冲液可过滤后重复使用，约可支持5次电泳。
    11. 以50 W功率运行电泳20分钟，预热玻璃板。
    12. 预热后清洗加样孔。使用注射器和槽中的TBE缓冲液冲洗加样孔，去除残留盐分。重复多次以确保加样孔清洁。若加样孔不洁净，条带将模糊，图像无法解析。尽管此步骤耗时，但我们发现其对获得高质量数据至关重要。
    13. 在两侧最外侧泳道中各加入5 µL含溴酚蓝的95%甲酰胺溶液。该溶液与QBO相同，但以溴酚蓝替代橙G。这可提供可视化参考，指示成像时切胶位置及DNA迁移距离。
    14. 对每个待分析样品（由第2.1.1节制备），向凝胶的一个加样孔中加入3 µL。加样完成后，静置1分钟使样品沉降。
    15. 盖上上下两个塑料电泳槽的盖子。连接导线至装置。红色表示正极，应连接至底部，使DNA向下迁移。
    16. 将导线连接至电源，设置为50–55 W。运行凝胶约3小时，或直至溴酚蓝染料前沿迁移至凝胶长度的2/3以上。
  4. 凝胶成像
    注意：该凝胶极薄，操作困难。必须格外小心，以防撕裂或整块凝胶丢失。
    注意：根据DNA标记类型，可能需要使用不同的凝胶成像仪。本方案使用近红外荧光染料，样品成像在凝胶成像仪上进行（见材料表）。本方案专为此成像仪编写。
    1. 当溴酚蓝染料前沿迁移至凝胶长度的2/3以上（约28 cm）时，可关闭电源停止电泳。将凝胶从装置中取出，放置于软木环上。
    2. 使用小型楔形板分离器分离玻璃板。将分离器插入缺口内角处向上撬动。操作需谨慎，避免用力过猛；若压力过大，缺口可能断裂。
    3. 当玻璃板间吸附力释放后，小心抬起上层玻璃板，判断凝胶附着在哪一块板上。若凝胶粘附于下层板，将上层板取下并放于软木环上。若凝胶随上层板被抬起，应缓慢移动，凝胶可能自行落回下层板。若凝胶未脱落，仍需缓慢操作，将凝胶从下层板上完全剥离，并将带凝胶的上层板置于另一软木环上。
    4. 玻璃板分离后，观察染料在凝胶上的位置，切除凝胶顶部和底部多余部分。通常情况下，使用18或23个核苷酸引物与45个核苷酸模板构建时，溴酚蓝染料前沿与凝胶底部之间无DNA。从染料位置垂直向上切割至凝胶顶部。染料与凝胶边缘之间的区域也无DNA。最后，在加样孔下方约几英寸处切割凝胶。凝胶最顶部无核酸存在。
      注意：将凝胶切割至尽可能小的尺寸，可显著简化其向成像设备的转移过程。若凝胶过大，在转移过程中更易撕裂。尽管我们常在成像前修剪凝胶，但仍建议极度谨慎操作，以免因疏忽丢失关键数据。为确认切除部分是否含有额外数据，我们通常会对切除部分进行额外扫描，以确保无数据丢失。
    5. 用水覆盖凝胶表面，防止干燥。
    6. 清洁成像仪表面。使用擦拭纸巾依次以水和乙醇擦拭表面，并在放置凝胶的区域涂一层薄水膜。
    7. 将所需凝胶片段转移至Li-Cor湿润表面。
    8. 轻轻按压排出气泡，并用擦拭纸巾擦拭。操作需谨慎，因用力过猛极易撕裂凝胶。
    9. 根据仪器制造商的操作规程对凝胶成像。使用成像仪配套软件进行数据分析。
    10. 在凝胶成像过程中，清理工作区：清除多余的丙烯酰胺凝胶，清洗玻璃板，并过滤TBE缓冲液以备重复使用。

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结果

成功的聚丙烯酰胺凝胶分析结果如图所示，包括对总体活性的定性表征（见第2.1节，图1）和稳态动力学分析（见第2.1节末尾注释，图2）。同时展示了一个不成功的聚丙烯酰胺凝胶分析结果（图3）。

请注意，不使用任何 commercially available ladder 或分子标记物。偶尔我们会使用已知的聚合酶-底物组合来制备分子标记物；但需要注意的是，不同的修饰核苷酸具有截然不同的电泳迁移率，因此对长度相同但核苷酸结构不同的寡核苷酸进行比较是不恰当的。

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讨论

本文描述了一种用于表征DNA聚合酶介导的M-DNA合成的实验方法。通过使用近红外标记的DNA引物，并结合变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同长度的寡核苷酸，可实现对寡核苷酸的单核苷酸分辨率，从而精确测量合成产物。这些方法可用于测定酶的总体活性（第2.1节），或测定各个反应步骤的米氏动力学参数（见第2.1步之后的注释）。本实验室近期已应用这些方法，对先前进化获得的酶9以及理性设计改造的酶10进行了表征。

本文所述的检测方法与以往方法的不同之处在于采用了非放射性DNA标记。传统上，由于使用放射性磷标记物可获得高灵敏度，放射性同位素一直被用于追踪DNA合成11,18。然而，放射性标记物的处理成本高昂，且有效期较短，这使得其应用受到限制。本文介绍了使用近红外荧光染料标记DNA的方法，该方法避免了上述缺点。值得注意的是，使用近红外荧光染料时，我们观察到其检测限与放射性标记DNA相当（未发...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了科学进步研究公司（Cottrell College Scholar Award #22548）和TriLink Biotechnologies公司（ResearchReward Grant #G139）的支持。 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Tris HClPromegaH5123
Tris 碱PromegaH5131
MgCl2赛默飞世尔科技BP214-500
乙酰化牛血清白蛋白PromegaPR-R3961
KClSigmaP4504
二硫苏糖醇（即 DTT）Research Products InternationalD11000
乙二胺四乙酸（即 EDTA）（0.5 M 溶液）Sigma03690-100mL
甘油SigmaG5516
甲酰胺AcrosAC42374-5000
橙色 GSigma AldrichO3756
溴酚蓝赛默飞世尔科技50-701-6973
dNTPs赛默飞世尔科技FERR0191
M-dNTPs（核糖核苷三磷酸）赛默飞世尔科技45-001-341 (343, 345, 347)
M-dNTPs（其他所有修饰核苷三磷酸）TriLink Biotechnologies多种
引物 1IDT DNA / TriLink Biotechnologies定制合成我们使用 IR700 染料，可通过定制合成获得。我们通常采购经 HPLC 纯化的寡核苷酸。序列为 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA
模板 1IDT DNA / TriLink Biotechnologies定制合成我们通常采购经 HPLC 纯化的寡核苷酸。序列为 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA
丙烯酰胺Research Products InternationalA11405含 38.67% 丙烯酰胺和 1.33% 双丙烯酰胺
Tris/硼酸/EDTA（TBE）固体Research Products InternationalT22020
超纯尿素Research Products InternationalU20200
凝胶封边胶带CBS ScientificGT-72-10
大号白色弹簧夹（聚丙烯材质）CBS ScientificGPC-0001
过硫酸铵（APS）赛默飞世尔科技BP179
四甲基乙二胺（TEMED）赛默飞世尔科技BP15020
0.75 mm 间隔垫片CBS ScientificSGS-20-0740A
33×42 带缺口玻璃板组件CBS ScientificSGP33-040A
楔形板分离器CBS ScientificWPS-100
凝胶电泳用梳子CBS ScientificSG33-0734
凝胶电泳装置CBS ScientificSG-400-33
超纯水我们使用默克 Millipore 公司的 Milli-Q 系统制备
DNA 聚合酶我们实验室依据已发表的方案自行制备

参考文献

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DNA DNA DNA TBE
利用近红外荧光标记DNA并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可视化的DNA聚合酶活性检测
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