髓鞘形成少突胶质细胞可促进动作电位的快速传导以及神经元的存活。本文描述了一种在脑片组织切片中实现少突胶质细胞特异性表达荧光蛋白的实验方案，并可进行后续的时间序列成像。此外，还介绍了一种简单的方法用于可视化未染色的髓鞘结构。
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方法文章
利用腺相关病毒和共聚焦显微镜对脑片培养中少突胶质细胞器的可视化与活体成像 腺相关病毒，共聚焦显微镜，脑片培养，少突胶质细胞，细胞器，活体成像，髓鞘
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摘要
摘要
神经元依赖于髓鞘化少突胶质细胞提供的电绝缘和营养支持。尽管少突胶质细胞具有重要意义，但目前用于研究神经元的先进工具在少突胶质细胞研究中仅得到部分应用。通过病毒转导实现细胞类型特异性标记是研究活细胞器动态的有效方法。本文介绍了一种利用腺相关病毒（AAV）转导技术在脑片器官型培养中可视化少突胶质细胞线粒体的实验方案，该病毒携带在髓鞘碱性蛋白启动子转录调控下的线粒体靶向荧光蛋白基因。文中包括制备小鼠冠状脑片器官型切片的详细步骤，随后介绍了线粒体延时成像的操作流程。这些方法可推广至其他细胞器，并可能特别适用于研究髓鞘中的细胞器。最后，我们介绍了一种易于实现的、通过共聚焦反射显微镜（CoRe）在活体脑片中直接观察未染色髓鞘的技术。CoRe技术无需额外设备，可在活体成像过程中有效识别髓鞘结构。
引言
大脑的白质由被髓鞘包裹的神经细胞轴突构成，髓鞘是由少突胶质细胞形成的特化延伸的质膜。髓鞘对于动作电位的快速可靠传导以及有髓轴突的长期存活至关重要，髓鞘的丧失可导致神经系统功能障碍。尽管少突胶质细胞具有重要功能，但其特性相较于神经元和星形胶质细胞仍了解较少，因此针对少突胶质细胞的研究工具也相对匮乏。
对线粒体、内质网（ER）或不同囊泡结构等细胞器进行活体成像，有助于研究细胞器随时间发生的动态变化。传统上，少突胶质细胞的活体成像通常在单细胞培养体系中进行1,2。然而，单层培养中的少突胶质细胞并不形成致密的髓鞘结构，因此在研究细胞器的定位与运动时，脑组织切片（包括器官型或急性切片）可能是更优的选择。由于有髓轴突与周围髓鞘之间的距离极短，在髓鞘中对小型细胞器和蛋白质进行精确定位具有挑战性。因此，仅依靠光学显微镜下的免疫染色方法，其空间分辨率不足以区分位于髓鞘内的细胞器与轴突内的细胞器。这一问题可通过病毒转导技术加以解决，即利用细胞类型特异性启动子驱动靶向特定细胞器的荧光蛋白基因表达。该方法的优势在于可实现细胞特异性且稀疏的表达，从而精确评估细胞器的定位与动态行为。转基因动物也可用于实现此类细胞器靶向的细胞特异性表达3。然而，转基因动物的制备与维持成本较高，且通常难以达到病毒方法所能实现的稀疏表达水平。
本文所述方法利用病毒转导技术，将由髓鞘碱性蛋白启动子驱动的线粒体靶向荧光蛋白（dsred 或绿色荧光蛋白 GFP）导入少突胶质细胞（MBP-mito-dsred 或 MBP-mito-GFP），以在脑组织切片中可视化少突胶质细胞的线粒体。此外，通过在细胞质中表达另一种荧光蛋白（将 GFP 与 mito-dsred 联用，或将 tdtomato 与 mito-GFP 联用），可实现对细胞形态的观察，包括髓鞘的细胞质区域。本实验方案包含制备脑组织切片的步骤（对 De Simoni 和 Yu 于 2006 年描述的方案4,5进行了改良）。随后，我们介绍了用于研究线粒体运动的延时成像流程。该流程使用直立式共聚焦显微镜，并持续更换成像介质，此设置便于在成像过程中施加药物或其他培养基变化。延时成像可在任意共聚焦显微镜上进行，但需配备如下文所述的额外设备以维持组织切片的活性。本方案还包含多项优化成像效果并降低光毒性的实用建议。
最后，本文介绍了一种利用共聚焦反射显微镜（CoRe）快速、简便地观察未染色髓鞘的方法。该方法可用于活体成像过程中识别髓鞘结构。近年来，已开发出多种无需染色即可成像髓鞘的技术，但大多数技术需要特定的设备和专业知识6,7,8。此处描述的方法基于髓鞘的反射特性，是光谱共聚焦反射显微镜（SCoRe）的一种简化单激发波长版本（SCoRe通过组合多个激光波长来实现髓鞘成像）9。只要共聚焦显微镜配备488 nm激光器以及470–500 nm带通发射滤光片或可调发射滤光片，即可进行CoRe成像。
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方案
本文所述实验程序已获得挪威动物研究管理局批准。耗材及其他所需设备的供应商和目录编号详见文档末尾的材料清单。
1. 器官型切片的制备
注意：本实验方案使用出生后第7至9天（p7-9）的两只小鼠幼崽，可获得24个器官型脑片，分置于两个六孔培养板中。除非另有说明，所有操作均应在无菌操作台中进行，并佩戴腈类或乳胶手套。所有试剂均应为细胞培养级。
- 高压灭菌瓶、解剖工具（1 把大剪刀、1 把小剪刀、1 把大平头刮匙、1 把小圆头锐边刮匙和 1 把镊子，详见材料清单）、玻璃移液管、移液器吸头和用于切片制备的擦拭纸巾
- 由于一半的玻璃移液管需使用较大的开口，应将细端折断。
- 使用金刚石刻线笔（如有）在移液管上玻璃开始变窄处稍下方划痕。然后将移液管尖端插入腈类手套或类似材料中。在工作台面上一边施压一边弯曲移液管，小心折断其尖端。
- 然后用砂纸打磨断裂端使其变钝，或在本生灯上轻微熔化。断裂的移液管用于转移切割的脑片，使用时将断裂端插入橡胶头，较大的开口端接触溶液/脑片。
注意：此步骤无需在无菌操作台中进行，可提前数天完成。
- 准备培养皿。
注意：可在切片前一日或至少切片前2小时进行。- 灭菌聚四氟乙烯（PTFE）膜（"彩纸"使用两把无菌镊子将单个彩屑从周围的蓝色塑料碎片中取出，并将其浸入盛有96%乙醇（EtOH）的培养皿中两次以进行消毒。然后将彩屑平铺于无菌的大培养皿中晾干。
注意：彩屑为亲水性聚四氟乙烯（PTFE）膜，与培养插件中的膜类似。使用彩屑有助于活体成像，因为可用镊子夹起彩屑，将单个脑片轻松地从插件转移至显微镜装置（详见步骤4.8）。 alternatively，脑片也可在无彩屑的条件下培养（此时脑片将直接贴附于培养插件的膜上）。在此情况下，必须使用手术刀切割膜插件，以将脑片转移至显微镜灌流槽中。 - 向六孔培养板的每个孔中加入 1 mL 培养基（配方见试剂表）。
- 使用无菌镊子将一个细胞培养插件放入每个孔中。避免插件与培养基之间产生气泡。
注意：为了节约成本并保护环境，可以重复使用培养插件。方法是用蒸馏水彻底冲洗 H2O (dH2O 随后在70% EtOH中孵育至少24小时，直至再次使用。准备新培养时，在紫外光（UV）下将插入物于细胞培养板中干燥15–30分钟。 - 在每个培养插件上放置两片（已灭菌且干燥的）confetti。将confetti置于插件边缘，以尽量减少重叠。
- 将培养皿置于37 °C、5% CO₂的细胞培养孵箱中2.
- 灭菌聚四氟乙烯（PTFE）膜（"彩纸"使用两把无菌镊子将单个彩屑从周围的蓝色塑料碎片中取出，并将其浸入盛有96%乙醇（EtOH）的培养皿中两次以进行消毒。然后将彩屑平铺于无菌的大培养皿中晾干。
- 用二氧化碳气体（95% O₂）向气泡冷解离培养基（试剂表中的配方）中吹气2/5%CO₂2）为保持溶液无菌，将气瓶的管路连接至无菌注射式滤器（孔径0.22 µm）。
- 将注射器滤器的另一端连接至连接无菌玻璃移液管的无菌管。将玻璃移液管放入溶液中，用封口膜覆盖，并打开气体。将解剖液置于冰上保存。
- 准备解剖/切片区域。
注意：理想情况下，该操作应在无菌操作台中进行。若无法实现，可将振动切片机置于工作台面上。此时，建议佩戴发网和口罩。- 使用单边剃须刀片，从琼脂糖凝胶（试剂表中的配方）上切下一矩形小片（约 2 cm × 0.5 cm），并将该凝胶块粘附于振动切片机载物台上，使其长边正对振动切片机刀片。
- 用70%乙醇清洁所有表面和振动切片机部件，并用灭菌擦拭纸擦干。
注意：所有将与脑组织接触的器械必须完全干燥，因为乙醇可能对细胞造成损伤。 - 将无菌剃刀片安装到振动切片机上，并在振动切片机具备该功能时进行振动检测。
- 将灭菌的解剖工具与灭菌的组织擦拭纸、四个小型培养皿、一把圆头手术刀、两个带橡胶吸头的玻璃移液管、两个开口端玻璃移液管（见第1.1节）以及经乙醇喷洒消毒的超级胶水一同放入生物安全柜中。
- 将通入气泡的解剖液倒入振动切片机样品槽以及四个小培养皿中。
注意：此步骤仅可在解剖前立即进行，因为从此步骤开始，培养基不再通气且不置于冰上。
- 解剖并制备脑组织样本。
注意：为获得健康的切片，此步骤必须快速且准确地完成，需要一定的练习。- 根据当地准则通过颈椎脱位处死动物#1，随后用大剪刀断头。
- 使用小巧锋利的剪刀，从颈部向鼻部做矢状切口，迅速剪开皮肤并拨开，以暴露颅骨。
- 沿矢状缝剪开，随后在额骨内侧部分和人字缝（大脑与小脑的分界处）进行侧向切口。
- 使用镊子将颅骨两侧掰开。将圆头锐利的解剖刀片从脑腹侧下方插入，轻轻向外侧移动刀片，以切断颅神经与脑之间的连接。
- 使用单刃剃须刀片在小脑前方进行冠状切口。
注意：该切口将决定切片的切割角度，因此应以直角进行切割。 - 将脑组织从颅骨中翻出，放入盛有解剖液的小型培养皿中。
- 对动物#2重复步骤1.6.1–1.6.4，并将该脑组织置于第二个培养皿中。
注意：动物并非无菌。解剖操作应在生物安全柜的一侧进行，待脑组织从颅骨中取出后，再移至另一侧洁净区域。 - 更换手套。
- 将脑组织固定到振动切片机载物台上：在已固定的琼脂糖凝胶前方的载物台上涂抹一层薄薄的超级胶水。用一把宽平的铲刀夹持1号脑组织，使新切割的尾侧端紧贴铲刀，腹侧朝向琼脂糖凝胶，并尽可能贴近凝胶表面。
- 然后用镊子将脑组织从刮勺上轻轻推下，放置在胶上。注意为脑组织#2留出足够的空间。
注意：脑组织必须牢固地粘附在切片台上，但胶水不宜过多，以免阻碍切片。
- 然后用镊子将脑组织从刮勺上轻轻推下，放置在胶上。注意为脑组织#2留出足够的空间。
- 脑标本1固定后，立即使用大号刮铲在脑组织表面滴加数滴解剖液。此举可保持脑组织湿润，促进胶水硬化，并防止其黏附于脑组织侧壁。
- 重复步骤 1.6.7 和 1.6.8，用于脑组织 #2。
- 将载物台安装到振动切片机的样本舟上。
- 使用振幅为1 - 1.5 mm、频率为85 Hz、速度为0.2 mm/s的参数，切割230 µm厚的冠状切片。收集切片位置约为前囟前1.4 mm至前囟后2.1 mm之间。
- 使用开口玻璃移液管（步骤1.1）在每片切片切割完成后进行收集。将切片转移至含有解剖液的培养皿中。使用圆头手术刀将切片切成两部分，分离两个半球。
- 当所有切片完成后，将切片放入培养皿中。
- 将培养皿（一次一个）从培养箱中取出。
- 使用敞口玻璃移液管，小心地将一片组织转移到每一份confetti中。
注意：切片应平整地置于confetti的中央，这需要一定的技巧。然而，若某些切片不够理想，与其花费时间调整移动，不如保留原位，因为尽快将所有切片放入培养箱至关重要。 - 使用玻璃移液管（尖端）轻轻吸除多余培养基，避免接触脑片。
注意：孵育期间切片不应浸入液体中。因此，必须吸去多余培养基，使切片暴露于空气中（切片表面仍保留一层薄薄的液体膜）。若切片持续浸没在液体中，通常会导致切片状态不良或死亡（4 及我们观察结果）。 - 当所有彩屑均切为一片后，将培养皿移回培养箱中。
- 对培养皿 #2 重复步骤 1.7.8 至 1.8.4。
- 更换培养基。
注意：应在切片后的第二天（体外培养第1天，DIV1）进行，之后每隔2-3天一次。- 将培养基在水浴或培养箱中预热。
- 在无菌操作台中，使用真空抽吸装置或带有无菌吸头的普通移液器，从每个孔中吸取培养基。操作时，将培养皿轻轻倾斜约30度，将移液器吸头置于培养插件的边缘进行吸取。
- 从每个孔中移除约 800 µL 培养基（保留足够液体以维持插入物底部被培养基覆盖）。然后，使用洁净的移液器向每个孔中加入 800 µL 预热的培养基。随后将培养皿放回细胞培养箱中。
2. 病毒转导
- 购买或制备携带目的质粒的腺相关病毒（AAV），具体方法如前所述10,11。
注：本实验方案描述了使用血清型为2/8的腺相关病毒（AAV 2/8），其携带在线粒体靶向的dsred或GFP报告基因，并由髓鞘碱性蛋白启动子（myelin basic protein promoter）驱动表达12（即AAV2/8 MBP_mito_dsred 或 AAV2/8 MBP_mito_GFP），用于可视化少突胶质细胞中的线粒体。同时使用由通用CAG启动子驱动表达GFP或tdtomato报告基因的AAV 2/8（AAV 2/8 CAG_GFP 或 AAV 2/8 CAG_tdtomato）来可视化少突胶质细胞的细胞质。因此，将AAV2/8 MBP_mito_dsred与AAV 2/8 CAG_GFP联合使用可在少突胶质细胞中实现红色线粒体和绿色细胞质的标记，而将AAV2/8 MBP_mito_GFP与AAV 2/8 CAG_tdtomato联合使用则可实现绿色线粒体和红色细胞质的标记。这些载体的详细信息在其他文献中有更详细的描述13。 - 在体外培养第7天（DIV7）对少突胶质细胞进行AAV转导。
注意：操作AAV时应遵守相关的生物安全规定。确保已接受适当培训并获得相应的生物安全等级许可。以下所有步骤均应在II级生物安全柜中进行，并佩戴手套和实验服。此处描述的是将AAV应用于脑片皮层区域的方法，因为该区域的恢复效果最佳。- 将AAV用预热至37 °C的培养基稀释。建议稀释至约2 × 109 基因组拷贝/mL（GC/mL），以实现少突胶质细胞的稀疏转导，从而便于对脑片内单个细胞进行成像。然而，应通过预实验测试不同滴度，以确保转导的少突胶质细胞密度适合具体的实验需求。若使用两种不同的AAV，应将其混合于同一溶液中，并同时加入脑片。
- 向每片脑片加入约1.3 µL稀释后的AAV：确保移液枪吸头外壁干燥。吸取1.3 µL稀释后的AAV，将枪头置于皮层上方，尽可能靠近但不接触脑片（距离约1 mm）。
- 然后缓慢将溶液推出枪头。当溶液接触到脑片时，缓慢移动枪头覆盖整个皮层区域，使溶液均匀分布。
注：此操作应尽快完成，以避免脑片在安全柜外暴露时间过长。每次操作一个培养皿，完成第一个后立即将其放回培养箱，再开始处理第二个培养皿。要实现AAV的良好分布且不损伤组织，需要一定的练习和稳定的操作手法。
- 如果细胞实验室配有直立式荧光显微镜，可在培养期间将培养皿置于显微镜下检测蛋白表达情况。
注：培养皿在培养箱外停留时间不应超过2 - 5分钟。
3. 时间序列成像
注意：当荧光标记的表达水平足够且切片状态良好时（通常为 DIV11-14），即可进行成像。
- 确保显微镜、灌流系统和加热装置正确设置，使通入气泡的成像溶液被加热后可流入并流出浴槽。
注意：浴槽装置有多种解决方案，此处展示一种简易版本。- 使用钝化的注射器针头（在约45°处弯曲）作为灌流槽的进液口和出液口，并用蓝丁胶/趣味橡皮泥将其固定在槽壁两侧。
- 确保管路从装有持续通气成像溶液的瓶子出发，经由蠕动泵，穿过加热装置的加热管，最后连接至浴槽中的进液注射器针头。
- 将另一根导管连接至注射器针头出口，该导管经由蠕动泵后返回成像溶液瓶（或废液瓶）。
- 用二氧化物气体对气泡成像溶液（配方见试剂表）进行鼓泡。
注意：应在成像开始至少15分钟前启动，并在整个实验过程中持续进行。 - 打开蠕动泵和加热器，使溶液流经浴槽以达到最佳浴槽温度（37 ± 0.5 °C）。确保连接至温度控制单元的温度计传感器浸没在浴槽溶液中。
- 打开显微镜、荧光灯和相应的激光器。
- 为样品设置合适的光路。
注意：具体参数将根据显微镜配置和探针的不同而有所变化。使用者需具备共聚焦显微镜操作的基本知识，相关内容此处不予详述。 - 使用合适放大倍数和数值孔径（n.a.）的水浸物镜。我们采用40倍水浸平场复消色差物镜（n.a. 1.0）。
- 打开针孔，以获得约2 - 2.5 µm的光学切片厚度用于延时视频。这可减少延时过程中线粒体移出焦平面的情况。
- 将器官型脑片转移至灌流槽中：
- 在小型塑料培养皿中加入一滴成像溶液或培养基。
- 在无菌操作台中，使用无菌镊子将一个器官型脑片从膜插件转移至液滴中。镊子仅可接触彩屑部分，不得接触脑片。
- 将培养皿盖上盖子。
- 立即将含有剩余切片的培养皿放回培养箱中。
- 将含有切片的培养皿移至显微镜下。
- 关闭蠕动泵，然后将脑片转移至显微镜浴槽中。首先，用镊子将带有脑片的碎屑从培养皿转移至浴槽顶部（碎屑会漂浮在液面）。随后，将镊子的两个尖端分别置于碎屑两侧，使其接触碎屑但不接触脑片，推动碎屑穿过溶液沉降至浴槽底部。将碎屑居中放置于浴槽中央。
- 使用镊子将固定锚（harp）放置在confetti上方，注意不要触碰脑片。
注意：Harp 是一种马蹄形的铂金锚定装置，用于防止脑片在浴槽中漂浮或移动。对于急性脑片，harp 上有细丝从一侧延伸至另一侧（形似音乐竖琴）。对于器官型脑片，harp 应无细丝，并且尺寸需与 confetti 相匹配，使其能够覆盖在 confetti 上方而不接触脑片。 - 重新启动蠕动泵。
- 将物镜降至样品位置。
- 选择要成像的细胞和区域。
注意：避免细胞过度暴露于激光照射下，因为这可能导致细胞毒性（参见下文提示中的建议）。- 使用目镜和荧光灯寻找形态健康且表达正确的少突胶质细胞。通常，荧光蛋白过表达较强的少突胶质细胞会呈现不健康状态。不健康的少突胶质细胞其突起呈团块状，线粒体则表现为断裂状。健康的少突胶质细胞胞体和突起形态平滑，线粒体长度各异（尽管通常远短于神经元和星形胶质细胞中的线粒体）13,14,15).
- 将目标细胞置于视野中央。
- 使用 "活体" 使用软件中的功能（适用于徕卡和蔡司显微镜）在屏幕上识别细胞并选择感兴趣区域， 例如， 含有多个初级突起或髓鞘，或单个突起或髓鞘的细胞部分。
注意：为了尽可能成像更多的突起/鞘结构，应选择在 x-y 方向上相对平坦延伸的突起区域。 - 放大至目标区域（通常生成图像的像素尺寸为 0.14 - 0.30 µm）。
- 使用 "区域" 工具，在该区域周围绘制一个矩形，然后选择仅扫描选定区域的选项。通过仅扫描选定区域，可缩短扫描时间，从而减少激光暴露。
注意：由于水平矩形区域所需的扫描线数量较少，其扫描速度将快于垂直矩形区域。若需扫描垂直矩形区域，可通过旋转工具将扫描视野旋转90度，以缩短扫描时间。
- 调节激光功率和增益，以获得线粒体的良好视野。
注意：使用所需的最低激光功率。如果可能，应优先调高增益而非增加激光功率。过高的激光功率不仅可能导致细胞毒性，还会随时间推移漂白成像目标，从而在扫描过程中需要进一步提高激光功率或增益。所需的激光功率和增益取决于荧光蛋白表达水平及所用显微镜型号。在 LSM700 共聚焦显微镜上，我们使用 555 nm 激光（功率 20–40 µW）成像 dsred 或 tdtomato，使用 488 nm 激光（功率 20–30 µW）成像 GFP（激光功率在物镜后孔径处测得）。活细胞成像时增益设置较高，GFP 通常为 700–800，dsred 和 tdtomato 通常为 850–980。较高的增益可能引入更多背景噪声，可通过提高数字偏移量来消除（偏移值通常在 0 至 15 之间）。根据我们的经验，MBP_mito_GFP 的信噪比优于 MBP_mito_dsred。 - 选择扫描速度。
注意：通过使用快速扫描速度和绘制较小的扫描区域（见下文第4.10.5点），可尽量缩短扫描时间。也可通过执行双向扫描来节省扫描时间，但由于图像质量较差，不推荐此方法。 - 设置延时成像的频率和持续时间， 例如 每2秒采集一次图像，持续20分钟，用于少突胶质细胞的线粒体成像。
注意：频率和持续时间应根据目标物体的移动性进行设置。较高的频率会使样本暴露于更多的激光照射下，但移动较快的物体也需要更短的延时视频总时长例如 神经元中的线粒体比少突胶质细胞中的线粒体移动更频繁且速度更快，通常以每秒一次的频率成像，持续2分钟16). - 开始延时录像。
注意：在记录过程中，线粒体可能会移出焦平面和/或漂出成像区域。为尽量减少振动和移动，应调整灌流液的进液口和出液口，并在必要时降低泵速。通常仍会出现轻微的焦距变化，因此在成像期间需持续监控屏幕，并在记录过程中对焦距进行微调。 - 拍摄整个细胞的z轴层扫图像，用于后续对细胞及其成像过程的识别。
注意：为了获得更好的分辨率，应在z轴扫描时将针孔重置为1个艾里单位。 - 可选：观察未染色的髓鞘。
注意：在转导了（胞质）GFP的少突胶质细胞中，髓鞘通常可被识别为与主要突起相连的胞质直线结构（即胞质嵴）（参见 图2 A 和 B）。然而，如果 GFP 表达过弱或未使用细胞质标记物，则可以通过共聚焦反射显微镜（CoRe）来观察髓鞘结构，具体方法如下所述。- 在软件中设置新的光路，采用 488 nm 激光激发，并采集波长附近发射的光信号。 例如 470-500 nm
- 调节激光功率和增益，直至髓鞘可见（参见示例） 图3）。使用 LSM 510 Meta 显微镜时，我们通常采用 7 - 12 µW（在物镜后孔径处测得）。
- 可选：制备切片用于免疫染色。
- 如果需要在免疫染色后识别成像细胞，应拍摄该细胞的低倍率图像（10×），并通过绘制箭头或类似标记在图像中标示其位置。为便于后续定位该细胞，建议同时绘制整个切片的手工示意图，标出该细胞的位置。
- 在室温下，将切片置于4%多聚甲醛（PFA）中，在摇床上固定1小时。
警告：PFA 有害。请穿戴防护装备，并仅在通风橱中使用。 - 将固定剂用 PBS 稀释至 1:10，于 4°C 保存，直至按其他部分所述开始免疫组织化学实验17.
注意：尽管切片可在稀释的固定液中保存数周，但荧光信号可能逐渐减弱。建议在固定后10天内进行免疫组织化学实验。
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结果
按照上述方法培养和转导的脑组织切片显示，表达 mito_dsred 和 GFP 的皮层少突胶质细胞呈稀疏分布。使用针对 Olig2 和 MBP 的抗体进行免疫染色证实，该表达特异性地存在于少突胶质细胞中（图1）。
进行活体成像时，通过其多个平行排列的髓鞘特征性形态可识别出被转导的少突胶质细胞（图1 和 图2A）。对转导的少突胶质细胞进行延时成像，可监测线粒体在初级突起和髓鞘中的运动（图2B–D）。
在GFP表达水平较低的细胞中，可通过在488 nm波长下激发样本并...
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讨论
本文所述的类器官培养方案是De Simoni和Yu（2006）5所描述方案的一种改良版本18。最重要的修改内容如下：在培养基中添加了Tris缓冲液，这可改善脑片在孵育箱外进行病毒转导和更换培养基期间的存活状态。此外，对confetti（载片）的灭菌程序也进行了调整。虽然其他方案采用高压灭菌法对confetti进行灭菌，但我们不推荐此方法，因为它会导致部分confetti发生卷曲。应避免使用卷曲的confetti，因为在这些载片上培养的脑片通常健康状况较差。本方案使用小鼠而非大鼠，并针对大脑皮层而非海马体进行培养，我们发现该调整适用于更薄的脑片（230 µm vs 300 µm）。由于小鼠和大鼠出生后第10至20天左右髓鞘化达到高峰19，因此使用出生后第7至9天（p7-9）的小鼠制备培养物，并继续培养11至14天，是研究成髓鞘少突胶质细胞的最佳选择。在体外培养11至14天后，培养物中包含多个具有致密髓鞘结构的成熟少突胶质细胞13。使用更年轻小鼠制备的...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢Linda Hildegard Bergersen和Magnar Bjørås提供细胞实验室及设备的使用权限，感谢Janelia分子生物学共享资源团队在质粒和病毒制备方面的支持，以及Koen Vervaeke在激光功率测量方面的协助。本工作由挪威健康协会、挪威研究理事会资助，显微镜设备由Norbrain资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖 | Sigma | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | 用于灌流槽进出液的针头 |
| 二氧化碳气体 | AGA | 105701 | |
| Brand 移液球 | Sigma-Aldrich | Z615927 | 移液球 |
| 本生灯（液态丙烷燃烧器） | VWR | 89038-530 | |
| 加热器控制器用电缆组件 | Warner Instruments | 64-0106 | 温度控制器—温度计部分 |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | 用于培养箱的CO2 |
| 盖玻片，方形 Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | 用于灌流槽下方活体成像。用胶水或凡士林密封。 |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma | G7021 | |
| 精细镊子 | Finescience | 11063-07 | 用于解剖 |
| 钻石刻划笔 | Ted Pella Inc. | 54463 | |
| 一次性玻璃巴斯德移液管 230 mm | VWR | 612-1702 | 玻璃移液管 |
| 双刃不锈钢剃刀刀片 | Electron Microscopy Sciences | #7200 | 用于振动切片机的刀片 |
| Earle's 平衡盐溶液 (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| 滤纸圆片 | Schleicher & Schuell | 300,220 | 用于PFA过滤的滤纸 |
| 可塑性粘土 | Loctite | 1270884 | 用于连接/调节灌流槽中进出液管的位置 |
| C型折叠手巾 2 | Katrin | 344388 | |
| RC-41 型灌流槽用平网架 | Warner Instruments | 64-1418 | 用于固定灌流槽中的组织样本。在用于器官型切片前需剪断网线。1.5 mm，13 mm，SHD-41/15 |
| HEPES，分子量：260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir，型号 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | 层流罩 |
| 马血清，热灭活 | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCR 膜，PTFE | Millipore | FHLC0130 | Confetti |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | 振动切片机 |
| 含 HEPES 的 MEM-Glutamax | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Heyman B 型微型勺 | Electron Microscopy Sciences | 62411-B | 小型圆头刮铲，末端锋利，用于解剖 |
| Millex-GP 滤器单元 | Millipore | SLGPM33RA | 注射器滤器单元 |
| Millicell 细胞培养插件，30 mm | Millipore | PICM03050 | 细胞培养插件 |
| Minipuls 3 调速控制模块 | GILSON | F155001 | 用于活体成像的蠕动泵—控制模块部分（需连接双通道泵头） |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta 表面 | Thermo Fischer Scientific | 140675 | 培养板 |
| 制霉菌素混悬液 | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| 物镜 W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | 用于活体成像的水浸物镜（工作距离=2.5 mm），可见光-红外光 |
| Parafilm 封口膜 | VWR | 291-1211 | |
| 多聚甲醛，颗粒状 | Electron Microscopy Sciences | #19208 | |
| PC-R 灌流室 | SiSkiYou | 15280000E | 用于活体成像的灌流槽 |
| 青霉素-链霉素溶液，液体 | Invitrogen | 15070-063 | |
| 培养皿 140 mm | Heger | 1075 | 大培养皿 |
| 培养皿 92x16 mm | Sarstedt | 82.1473 | 中等培养皿 |
| 培养皿 55x14.2 mm | VWR | 391-0868 | 小培养皿 |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Sigma | P4417 | PBS 片剂 |
| R2 双通道泵头 | GILSON | F117800 | 用于活体成像的蠕动泵—双通道泵头部分（需配合控制模块使用） |
| 不锈钢圆头/平头刮铲 | VWR | 82027-528 | 用于解剖的大刮铲 |
| 砂纸 | VWR | MMMA63119 | 可选，用于打磨断裂的玻璃移液管 |
| 剪刀， 17.5 cm | Finescience | 14130-17 | 用于解剖的大剪刀 |
| 剪刀，8.5 cm | Finescience | 14084-08 | 用于解剖的小型锋利剪刀 |
| 单刃宝石刀片 | Electron Microscopy Sciences | #71972 | 单刃剃刀刀片 |
| SH-27B 单通道溶液加热器 | Warner Instruments | 64-0102 | 温度控制器—加热部分 |
| Steritop-GP 滤器单元，500 ml，45 mm | Millipore | SCGPT05RE | 用于溶液灭菌的滤器 |
| 精密瞬间胶 | Loctite | 1577386 | |
| 手术刀片 22 号 | Swann Morton Ltd. | 209 | 圆头手术刀片 |
| 温度控制器 TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | 用于活体成像的温度控制器（需配合溶液加热器和电缆组件） |
| Trizma 基础 | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| II 型水套式培养箱 | Forma Scientific | 78653-2882 | 培养箱 |
参考文献
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