基态耗尽超分辨率成像在哺乳动物细胞中的应用

摘要

本文概述了一种利用基态耗尽（GSD）超分辨率显微技术在哺乳动物细胞中检测一种或多种血浆和/或细胞内膜蛋白的实验方案。本文讨论了采用此类方法在细胞蛋白可视化与定量分析中的优势及注意事项。

摘要

荧光显微镜技术与细胞生物学的进步密切相关，可视化细胞事件能力的提升常常显著推动我们对细胞功能机制的理解。超分辨率显微镜的发展与普及已将光学分辨率的极限从约250 nm大幅提升至20 nm。如今，生物学家不再局限于在衍射极限范围内的共定位来描述分子相互作用，而是能够直接观察单个分子之间的动态相互作用。本文概述了一种利用基态耗尽显微镜 对固定细胞进行成像，以实现细胞蛋白可视化与定量的实验方案。我们以两种不同的膜蛋白为例进行说明：内质网转运子的一个组分sec61β，以及定位于质膜的电压门控L型Ca²⁺通道（Ca_V1.2）。文中讨论了具体的显微镜参数设置、固定方法、光切换缓冲液的配制，以及图像处理中的注意事项与挑战。

引言

细胞信号转导反应可将不断变化的内外环境转化为细胞响应。它们调控人体生理学的各个方面，是激素和神经递质释放、心跳、视觉、受精以及认知功能的基础。这些信号级联反应的紊乱可能导致严重的病理生理状况，例如癌症、帕金森病和阿尔茨海默病。数十年来，生物与医学研究者成功地将荧光蛋白、探针和生物传感器结合荧光显微镜，作为理解这些细胞信号精确时空组织的主要工具。

光学技术（如落射荧光、共聚焦或全内反射荧光（TIRF）显微镜）的优势在于其高灵敏度、快速成像以及与活细胞成像的良好兼容性，而其主要局限在于受衍射极限的分辨率限制，即无法分辨小于200–250 nm的结构或蛋白质复合物。随着确定性超分辨率技术在理论与实践上的发展例如，受激发射损耗显微镜（STED¹），结构照明显微镜（SIM）²）或随机超分辨率（例如，光激活定位显微技术（PALM³），或基态耗尽（GSD^4,5在荧光显微镜中，横向与轴向分辨率已突破衍射极限，达到数十纳米量级。因此，研究者现在能够以前所未有的能力在接近分子水平上观察并理解蛋白质动态行为与空间组织如何转化为生物学功能。

基态耗尽显....

方案

1. 清洗玻璃盖玻片

1. 样品处理前一天，将 #1.5 玻璃盖玻片置于 1 M KOH 溶液中进行超声处理 1 小时，以去除盖玻片上可能存在的任何荧光污染物。
   1. 用去离子水彻底冲洗盖玻片上的 KOH。
   2. 经 KOH 清洗后，将盖玻片保存在 70% 乙醇中，直至使用前。

2. 包被玻璃盖玻片

注意：本节步骤应在细胞培养罩内进行，以防止污染。

1. 使用镊子从70%乙醇溶液中取出单个盖玻片，并迅速过火以去除多余液体。将盖玻片放入6孔板中。若在培养罩内过火不可行，可考虑用去离子水冲洗盖玻片后进行高压灭菌，和/或在培养罩内通过紫外灯照射至少30分钟进行灭菌。
2. 为促进细胞贴附，于室温下用无菌的0.01%多聚赖氨酸（poly-L-lysine）处理盖玻片1小时。
3. 吸除多聚赖氨酸溶液，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗盖玻片。自然晾干后，置于冰箱中过夜。
4. 次日早晨，从冰箱中取出盖玻片，并加入300 µL浓度为50 µg/mL的层粘连蛋白（laminin），室温孵育至少30分钟。确保层粘连蛋白被小心地直接加在盖玻片表面。
   注意：此层粘连蛋白处理步骤对COS-7细胞或HEK293细胞并非必需，但分离的心室肌细胞需要....

结果

如引言中所述，目前存在多种不同的超分辨率显微成像模式。本实验方案重点介绍GSD超分辨率成像。代表性图像及定位图如图2和图3所示。

图2 显示一个转染了内质网蛋白mCherry-Sec61β的COS-7细胞，该细胞经上述方法处理。 图2A-2B 允许使用全内反射荧光（TIRF）模式下的超分辨率显微镜对内质网（ER）图像进行比较A）并使用GSD采集模式（B）。图像显示，在GSD模式下成像时，轴向分辨率得到改善。这一结果在随附的图像剖面图中进一步得到证实，该图可使用ImageJ生成，显示了感兴趣区域（黄线）归一化强度曲线分.......

讨论

近年来，一系列突破光学衍射极限的成像技术迅猛发展，为深入理解哺乳动物细胞信号转导在空间与时间上的复杂性提供了全新的视角。这些技术包括STORM、STED、PALM、GSD、SIM及其各种变体（例如，dSTORM、FPALM）。这些技术背后科学家的创造性工作使我们得以绕过光衍射物理规律所带来的限制。尽管取得了巨大进展，但每种技术在实现超分辨率成像时都需在某些方面做出权衡，因而各自存在局限性。细胞生物学家和生物物理学家所追求的理想状态是：具备最佳灵敏度、高分辨率和快速图像采集能力，同时完全避免光漂白现象。此外，我们还应意识到，将细胞从生物体内分离出来本身就会改变其状态，进而可能影响分子动态行为。因此，开发一种能够在活体、呼吸状态的动物中实现动态、活细胞、单分子成像的超分辨率技术，仍是当前持续探索的目标。目前，我们已拥有可在横向和轴向分辨率上分别达到20 nm和50 nm、较衍射极限提升10倍的成像工具。本文将讨论实现GSD超分辨率成像的样本制备、图像采集及分析方法。

尽管本实验方案的重点是 Sec61β 和 Ca_V1.2 L 型 Ca^2.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
KOH	Thermo Scientific	P250-500	用于清洁盖玻片
#1.5 盖玻片 18 x 18 mm	Marienfeld Superior	0107032)	用于细胞培养/处理/成像
10x PBS	Thermo Scientific	BP3994	用去离子水稀释至1x
聚-L-赖氨酸	Sigma	P4832	促进细胞在盖玻片上的黏附
层粘连蛋白	Sigma	114956-81-9	促进细胞在盖玻片上的黏附
Medium 199	Thermo Scientific	11150-059	心室肌细胞培养基
DMEM 11995	Gibco	11995	细胞培养基
胎牛血清 (FBS)	Thermo Scientific	10437028	培养基添加剂
青霉素/链霉素	Sigma	P4333	培养基添加剂
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Corning	25-052-CL	细胞培养溶液
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	瞬时转染试剂
无 Ca²⁺ PBS	Gibco	1419-144	细胞培养
100% 甲醇	Thermo Fisher Scientific	A414-4	细胞固定
多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15710	细胞固定
戊二醛	Sigma Aldrich	SLBR6504V	细胞固定
SEAblock	Thermo Scientific	37527	可使用 BSA 或其他封闭溶液替代
Triton-X 100	Sigma	T8787	用于细胞透化的去垢剂
兔抗 CaV1.2 (FP1)	赠品	N/A	市面上存在商业化的抗 CaV1.2 抗体，例如 Alomone Labs 的兔抗 CaV1.2 (ACC-003)
小鼠单克隆抗 RFP	Rockland Inc.	200-301-379	一抗
Alexa Fluor 647 驴抗兔 IgG (H+L)	Invitrogen (Thermo Scientific)	A31573	二抗
Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠 IgG (H+L)	Invitrogen (Thermo Scientific)	A11031	二抗
叠氮化钠	Sigma	S2002	防止微生物生长，用于样品长期保存
过氧化氢酶	Sigma	C40	光转换缓冲液组分
葡萄糖氧化酶	Sigma	G2133	光转换缓冲液组分
Tris	Sigma	T6066	光转换缓冲液组分
β-巯基乙胺盐酸盐	Fisher	BP2664100	光转换缓冲液组分
β-巯基乙醇	Sigma	63689	光转换缓冲液组分
NaCl	Fisher	S271-3	光转换缓冲液组分
葡萄糖	Fisher	D14-212	光转换缓冲液组分
凹面载玻片	Neolab	1 – 6293	用于样品封片
Twinsil	Picodent	13001000	用于密封盖玻片
sec61β-mCherry 质粒	Addgene	49155
Leica SR GSD 3D 显微镜	Leica
ImageJ
洗涤封闭溶液			含 20% SEAblock 的 PBS
一抗孵育溶液			含 0.5% Triton-X100 和 20% SEAblock 的 PBS
二抗孵育溶液			用 PBS 1:1000 稀释