人脑脊液中内肽组学分析的样品制备

摘要

本文介绍了一种对人脑脊液（CSF）中内源性肽进行质谱分析的方法。通过采用分子量截断过滤、色谱预分离、质谱分析以及后续多种肽段鉴定策略的组合，与以往研究相比，已知的脑脊液肽组规模几乎扩展了十倍。

摘要

本方案描述了一种用于鉴定人脑脊液（CSF）中内源性肽段的方法。为此，将一种基于分子量截断（MWCO）过滤和质谱分析的既往方法，与一个离线的高pH反相高效液相色谱预分离步骤相结合。

脑脊液分泌是清除中枢神经系统细胞脱落分子的主要途径。因此，中枢神经系统的许多生理过程都会在脑脊液中有所反映，使其成为一种有价值的诊断性液体。脑脊液成分复杂，所含蛋白质的浓度范围跨越8至9个数量级。除蛋白质外，先前的研究还证实脑脊液中存在大量内源性肽段。尽管这些肽段的研究尚不如蛋白质深入，但它们也可能具有作为生物标志物的潜在价值。

通过分子量截留过滤（MWCO）将内源性肽从脑脊液（CSF）的蛋白质成分中分离出来。通过去除样品中大部分蛋白质成分，可增加被检测样品的体积，从而提高内源性肽的总检测量。为应对滤过后的肽混合物复杂性，在进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析之前，采用了在碱性pH条件下进行的反相（RP）高效液相色谱预分离步骤。该分离步骤结合了一种简单的合并策略，将60个组分合并为12个，从而在很大程度上避免共洗脱的同时显著减少了分析时间。

采用三种不同的多肽/蛋白质鉴定软件进行自动化多肽鉴定，并对结果进行整合。这些软件之间具有互补性而非可比性，三者之间的鉴定结果重叠部分不足15%。

引言

脑脊液（CSF）中的生物标志物目前正在改变神经退行性疾病的科研方向。在阿尔茨海默病——这种全球影响超过6000万人的最常见神经退行性疾病中^1,2由肽类物质β-淀粉样蛋白、微管稳定蛋白tau以及一种磷酸化tau形式组成的生物标志物三联组，能够以高灵敏度和特异性检测该疾病，并已被纳入诊断研究标准³在其他神经退行性疾病中，例如帕金森病和多发性硬化症，蛋白质组学研究已鉴定出大量生物标志物候选分子，其中部分分子目前正在临床研究中接受评估。^4,5,6.

除了蛋白质外，脑脊液（CSF）还含有大量内源性肽^{7,8,9,10,11,12}。这些肽是多种脑源性蛋....

方案

 以下所述方案是对先前研究中所用方法的优化版本，此前研究已从人脑脊液中鉴定出大量内源性肽段¹⁵。相较于原始方案，更新内容包括对脑脊液化学预处理步骤的微小调整，以及对离线高pH反相高效液相色谱预分离所用梯度的优化。

伦理考量

所有关于瑞典患者和对照材料的研究均已获得伦理委员会的批准：St. Göran（参考编号 2005-554-31/3）。阿姆斯特丹痴呆队列的脑脊液样本以及在伦敦国家神经病学和神经外科医院采集的样本，均在获得所有参与患者书面知情同意及地区伦理委员会批准后用于研究。本研究所使用的材料主要为出于诊断目的采集后剩余的脑脊液，且在纳入研究前已去标识化。无法追溯任何样本至特定个体或捐赠者群体。

1. 人脑脊液（CSF）的提取：

1. 采用标准化方案通过腰椎穿刺（必须由经过培训的医师操作）采集脑脊液²²。
2. 以 2,500 × g 离心 20 分钟，去除细胞碎片及其他不溶性物质。
3. 目视检查脑脊液样本是否变色，以判断是否存在穿刺出血导致的血液污染。血液中蛋白质浓度显著较高，且含有蛋白酶，可能对分析结果产生重大影响。

结果

此处所述方法在引入样品预分级之前，已在三项研究中得到应用与评估（表1）。第一项研究采用离线液相色谱法将脑脊液组分点样至MALDI靶板，共鉴定出730种内源性肽段¹¹在接下来的两项研究中，采用了等压标记法。主要应用于病例/对照研究，以同时鉴定和表征脑脊液内肽组和蛋白质组中潜在的生物标志物²⁴，在第二项研究中，采用等压标记法监测治疗效果 体内 γ-分泌酶抑制剂对脑脊液中肽表达在36小时内的影响¹⁶在病例/对照研究中，共鉴定出437种内源性肽，其中64种在阿尔茨海默病患者与健康对照个体之间的浓度存在显著差异。第三项治疗研究鉴定出1798种内源性肽，所监测的肽中有11种可显示出对治疗的响应。

在第四项研究中，目的是增加已鉴定脑脊液肽段的数量，特别是鉴定丰度较低的肽段。因此，研究中加入了HpH反相色谱法进行肽段预分离，并使用了10倍体积的脑脊液样本，最终鉴定出16,395个肽段。该研究未进行等重标记。除样本分馏外，最近的一项研究采用.......

讨论

在先前开发的通过分子量超滤回收内源性肽的方案中引入高pH反相高效液相色谱预分级步骤¹¹ 降低了相对样本复杂性，从而允许研究体积大5倍的样本。这进一步提高了每个组分中肽段亚群的浓度，进而增加了检测低丰度肽段的可能性。

通过采用三种蛋白质组学软件并行进行内源性肽段鉴定的策略，可将已知的脑脊液内肽组扩大十倍以上。在对一份混合脑脊液样本材料进行的初步试验中，共鉴定出16,395种内源性肽段。其中包含大量来源于先前在神经退行性疾病相关研究中被报道过的蛋白质的内源性肽段。上述研究中鉴定出的多个肽段目前正于本实验室被评估作为生物标志物的潜力。该过程包括多个步骤：通过向脑脊液中添加带有重同位素标记的合成类似物来验证肽段的身份，建立靶向质谱检测方法，评估肽段在储存及冻融循环过程中的稳定性，以及分析不同临床队列样本。

对原始方案进行了修改，以避免在MWCO过滤过程中由于样品中GdnHCl浓度过高而引入污染物（步骤2.5和3.5）。对预分离梯度（步骤6.3.1）进行了优化，延长了载样量，并采用线性梯度.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 M 三乙基碳酸氢铵	Fluka, Sigma-Aldrich	17902-100ML	TEAB
8 M 盐酸胍	Sigma-Aldrich	G7294-100ML	GdnHCl
三(2-羧乙基)膦盐酸盐	Pierce	20490	TCEP
碘乙酰胺	SIGMA	I1149-5G	IAA
羟胺 50% (w/w)	Sigma-Aldrich	457804-50ML
乙腈，远紫外级，HPLC梯度纯	Sigma-Aldrich	271004-2L	AcN
甲酸	Fluka, Sigma-Aldrich	56302-1mL-F	FA
三氟乙酸	Sigma-Aldrich	T6508-10AMP	TFA
氢氧化铵溶液	Sigma-Aldrich	30501-1L-1M	NH4OH
Amicon Ultra-15 离心过滤装置，含 Ultracel-30 膜	Merck Millipore	UFC903024	MWCO-过滤器
Sep-Pak C18，100 mg	Waters	WAT023590	SPE-柱
Resprep 12-通道固相萃取装置	Restek	26077	真空装置
TMT10plex 同重同位素标记试剂盒	Thermo Fisher Scientific	90110	TMT10plex
UltiMate 3000 RSLCnano 液相色谱系统	Dionex	5200.0356	在线样品分离
Ultimate 3000 RPLC 快速分离二元系统	Dionex	IQLAAAGABHFAPBMBEZ	离线高pH值分级分离
Orbitrap Fusion Tribrid 质谱仪	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBCX	样品分析用质谱仪
Proteome Discoverer 2.0	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGABSFAKJMAUH	蛋白质组学搜索平台
Mascot v2.4	Matrix Science	-	蛋白质组学搜索引擎
Sequest HT	Thermo	-	蛋白质组学搜索引擎
PEAKS v7.5	Bioinformatic Solutions Inc.)	-	蛋白质组学搜索引擎
Acclaim PepMap 100，75 µm × 2 cm，C18，100 Å 孔径，3 µm 粒径	Thermo Fisher Scientific	164535	捕获柱（纳米液相色谱）
Acclaim PepMap C18，75 µm × 500 mm，100Å 孔径， 2 µm 粒径	Thermo Fisher Scientific	164942	分离柱（纳米液相色谱）
Savant SpeedVac 高容量浓缩仪	Thermo Fisher Scientific	SC210A-230	SpeedVac/真空浓缩仪
XBridge 肽段 BEH C18 柱，130Å，3.5 µm，2.1 mm × 250 mm	Waters	186003566	分离柱（微米液相色谱）