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通过自动双着丝粒染色体识别（ADCI）与剂量估算实现快速辐射生物剂量测定

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DOI：

10.3791/56245

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2017年9月4日

 ,  ,  , 
1CytoGnomix Inc., 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Western University, 3Department of Biochemistry, Western University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

细胞遗传学双着丝粒染色体（DC）检测法用于量化电离辐射暴露剂量。双着丝粒染色体自动识别与剂量估算软件能够准确、快速地根据中期细胞中的双着丝粒染色体估算生物剂量。该软件可区分单着丝粒染色体及其他结构与双着丝粒染色体，并根据双着丝粒染色体的出现频率估算生物辐射剂量。

摘要

可通过中期细胞中着丝粒染色体的频率来估算生物辐射剂量。传统的着丝粒染色体细胞遗传学检测方法通常依赖人工操作，劳动强度大，难以应对大规模伤亡事件后可能需要检测的大量样本。自动着丝粒染色体识别与剂量估算软件（ADCI）利用基于机器学习的图像处理技术，自动分析一系列中期图像，从而实现该过程的自动化。该软件通过剔除不合适的图像来筛选适合分析的图像，将每个目标对象分类为含着丝粒的染色体或非染色体结构，进一步将染色体区分为单着丝粒染色体（MCs）或双着丝粒染色体（DCs），计算样本中的双着丝粒染色体频率，并通过将样本的双着丝粒染色体频率与利用已知剂量校准样本生成的校准曲线进行比对，从而估算生物辐射剂量。本方案描述了ADCI软件的使用方法。通常，需导入已知剂量的校准样本和未知剂量的待测样本的中期图像，以实现准确的剂量估算。可通过预设的图像筛选条件自动查找最适合分析的图像，也可通过人工检查进行筛选。软件会对每个样本的图像进行处理，并采用机器学习方法，在不同严格程度下计算双着丝粒染色体的频率。根据已知物理剂量照射的校准样本中的双着丝粒染色体频率，生成线性-二次型校准曲线。对于暴露于未知辐射水平的待测样本，利用这些校准曲线根据其双着丝粒染色体频率估算剂量。可根据需要生成报告，汇总一个或多个样本的结果、一个或多个校准曲线的信息，或剂量估算结果。

引言

辐射生物剂量测定利用生物标志物（主要是染色体畸变，如双着丝粒染色体（DCs）和染色体易位）来测量个体所受的辐射剂量。由于个体之间的差异，生物吸收剂量可能与仪器测量的物理剂量不同。同样，特定的物理剂量辐射可能因个体生理或环境条件的不同而产生不同的生物学效应。了解生物剂量对于诊断和治疗均具有重要意义。

双着丝粒染色体（DC）检测法是世界卫生组织（WHO）和国际原子能机构（IAEA）用于评估人体生物辐射暴露的金标准。该方法是IAEA和WHO推荐的首个用于辐射剂量评估的检测手段。辐射暴露后，双着丝粒染色体的频率在大约4周内相对稳定1，且其与辐射剂量之间的定量相关性准确，因此双着丝粒染色体是理想的生物标志物。辐射剂量（以戈瑞[Gy]为单位）与双着丝粒染色体频率（以每细胞中双着丝粒染色体数量表示）之间的关系可用线性-二次函数表示。

染色体畸变试验作为细胞遗传学检测方法，约55年来一直是行业标准2。该方法需手动操作，分析单个血样显微镜数据需要1至2天。为准确估算辐射暴露剂量，根据实际剂量不同，需要采集数百至数千张图像3当剂量超过1 Gy时，国际原子能机构（IAEA）建议至少检测100个双着丝粒体（DCs）。在生物剂量学细胞遗传学实验室中，通常需分析250至500个中期相图像。对于受照样本 <由于染色体畸变（DC）形成概率较低，建议采集3,000至5,000张图像。无论何种情况，这都是一项劳动密集型任务。

细胞遗传学生物剂量测定实验室自行建立各自的 体外 在对测试样本进行生物剂量评估之前，需先建立辐射生物剂量校准曲线。采集正常对照个体的血液样本，经辐射照射后培养淋巴细胞，并制备用于中期染色体分析的样本。利用这些样本，将测得的生物剂量与标准辐射源已知的物理剂量进行校准。记录中期细胞图像后，由专业人员分析图像，计数双着丝粒染色体（DC）并计算各样本的DC频率。通过将各剂量点的DC频率拟合为线性二次曲线，建立校准曲线。随后，可通过将测试样本的DC频率与校准曲线上的剂量值进行比对，或代入相应的线性二次公式，推算出受试个体所受的辐射剂量。 关键词：辐射生物剂量学，校准曲线，双着丝粒染色体，中期染色体分析，淋巴细胞培养，线性二次模型

我们已通过软件实现了对双着丝粒染色体（DC）的检测和剂量确定的自动化，以加快该流程。自动化双着丝粒染色体识别与剂量估算系统（ADCI）采用基于机器学习的图像处理技术，能够检测并区分双着丝粒染色体（DCs）与单着丝粒染色体（MCs）及其他物体，并自动完成辐射剂量估算。该软件旨在通过自动化手段显著减少甚至消除对双着丝粒染色体计数进行人工复核的需求，从而加速剂量估算过程。该软件的研发过程中得到了加拿大卫生部（HC）和加拿大核实验室（CNL）下属参考生物剂量测定实验室的参与。这些机构的反馈将确保该软件的性能持续符合国际原子能机构（IAEA）对该检测方法的标准要求。

该软件具有以下功能：1）筛选双着丝粒染色体（DCs）并为分析选择最佳的中期细胞图像；2）染色体识别、双着丝粒染色体（DC）检测及双着丝粒染色体频率测定；3）基于已校准剂量的细胞遗传学辐射数据估算辐射剂量。该软件可处理来自同一名个体的一组中期图像（称为一个样本），利用图像处理技术对每幅图像中的双着丝粒染色体（DC）数量进行计数，并以戈瑞（Gy）为单位返回每个样本所受辐射剂量的估算值。

该软件旨在处理多种染色体结构、数量和密度。然而，算法在含有接近完整、分离良好且呈线性排列的染色体的中期图像中表现最佳4。若图像中存在高度重叠的染色体群、多个细胞、不完整的中期细胞、姐妹染色单体分离、细胞核、非染色体物体或其他缺陷，则可能降低算法的准确性。专用的图像筛选模型及其他物体分割阈值可过滤掉大多数非理想图像和假阳性的DCs。

在图像处理过程中进行双着丝粒染色体检测。该算法首先尝试确定图像中哪些对象为染色体，然后定位每条染色体上最可能为着丝粒的两个区域。随后，一系列不同的支持向量机（SVM）学习模型将染色体区分为双着丝粒染色体（DC）或正常的单着丝粒染色体。这些SVM模型在双着丝粒染色体检测的灵敏度和特异性方面有所不同（见下文步骤3.1.4），这可能影响样本中所测定的双着丝粒染色体频率。

ADCI 软件可处理一个或多个样本的吉姆萨（或 DAPI）染色中期数字图像（TIFF 或 JPG 格式）。该软件对校准样本和测试样本中的双着丝粒染色体（DCs）进行分析。校准样本的物理剂量（单位：Gy）已知，用于生成校准曲线。对于暴露剂量未知的个体，软件会根据仪器生成的校准曲线推断其物理剂量和生物剂量。尽管各实验室采用的技术相似，但不同实验室的校准曲线常存在差异3。为了准确估算测试样本的剂量，校准曲线和测试样本应来自同一实验室并进行统一处理。

该软件具有快速、准确和可扩展的特点，能够满足在需要同时对大量人员进行检测的事件中所要求的处理效率。该软件于2008年至2017年间开发完成4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。利用当前的计算机硬件，该台式机软件可在10至20分钟内完成对含有500个中期细胞基因组当量的患者样本的处理和辐射剂量估算4。该程序基于一套专有的图像分割和机器学习算法，用于染色体分析。针对每个暴露于3 Gy辐射下的染色体进行专家分析时，其准确性与ADCI结果相当。在一组此前用于国际能力验证试验的6个未知剂量暴露样本中，该软件估算的剂量值与HC和CNL通过人工审阅相同数据所得结果的偏差在0.5 Gy以内，符合国际原子能机构（IAEA）对分类生物剂量测定的要求。此外，采用统一的自动化双着丝粒染色体（DC）评分算法，有助于实现不同实验室之间的标准化，并最终提高剂量估算结果的可重复性。尽管如此，该软件仍允许自定义图像滤波和选择标准，从而能够兼顾不同实验室在染色体制备方法和辐射校准源方面的差异。

该软件是一个基于图形用户界面（GUI）的系统，用于分析包含经吉姆萨（或DAPI）染色的中期细胞的染色体图像集，以检测因暴露于电离辐射而引起的异常。图像集通过光学显微镜（或落射荧光显微镜）系统进行数字拍摄，每组图像对应一个不同的样本。该软件利用图像处理技术来识别并区分双着丝粒染色体（DCs）与中期细胞（MCs）及其他物体。通过经验推导的分割滤波器，可自动消除假阳性双着丝粒染色体，同时不影响真实的双着丝粒染色体。最后，软件根据预先计算（或用户指定）的图像选择模型，基于多种图像属性自动过滤掉质量不佳的图像。这些低质量图像包括含有过多或过少“噪声”物体、多个重叠染色体、缺乏中期染色体或含有过多姐妹染色单体的图像4。经过自动筛选的图像数据可用于已知辐射剂量样本的剂量校准曲线生成，并用于估计暴露于未知剂量下的待测样本的辐射暴露水平。

软件的输出结果可以以下列形式查看和保存：1）在控制台中查看的基于文本的输出，2）可保存为图像的图表，以及3）HTML格式的报告。软件的许多方面均可自定义，以满足不同实验室的特定需求。各实验室通常会同时提供根据本实验室已验证的细胞遗传学方案制备和采集的校准样本与测试样本。这可确保样本制备的一致性，并允许将校准样本生成的校准曲线有意义地应用于采用相同方案获得的测试样本。校准曲线也可根据已知剂量下的曲线系数或双着丝粒染色体（DC）频率来建立。通过过滤掉质量较低的图像和假阳性双着丝粒染色体（FPs），可以获得最准确的剂量估算结果。通过使用“图像选择模型”，可在每个样本中选择最优的图像子集，从而剔除质量较差、易导致假阳性的图像。软件中已包含一系列经过预先验证的模型，用户也可创建并保存具有自定义阈值和过滤条件的额外模型。

软件成功加载后，将显示主图形用户界面（GUI）（见图1）。通过该界面，可选择并处理样本（每个样本由一组中期细胞图像文件夹组成），以识别双着丝粒染色体（DCs），创建并比较校准曲线，并确定样本的辐射暴露剂量。

ACDI 数据分析软件；直方图；频率分布；样本详情；算法输出。
图 1： 图形用户界面的主要组成部分包括： 样本列表 (1)、校准曲线列表 (2)、处理队列 (3)（用于监控每个样本各组图像中直流信号检测的状态）、绘图显示区 (4)（用于汇总样本或校准曲线中图像组的统计学或其他定量特性），以及控制台 (5)（包含程序执行每项操作后输出的描述性文本）。请点击此处查看此图的放大版本。

方案

1. 导入并处理样本

  1. 点击 样本 在菜单栏中选择 新样本. 浏览至包含一组中期图像的适当目录，然后单击 选择文件夹.
  2. 为样本输入一个唯一的 ID 为新样本指定一个唯一的 ID 文本字段。此 ID 将用于在工作区中标识样本。样本 ID 只能包含字母数字字符、“_”或“-”。已知样本 ID 中可包含来源实验室和物理剂量（针对校准样本）。
  3. （可选）如有需要，可在此提供样本的描述 样本描述（可选） 文本区域。
  4. 点击 好的 将新样本添加到工作区。
  5. 重复步骤 1.1 至 1.4 以添加更多样品。至少创建 3 个校准样品（建议七个或以上）3不同暴露条件下的样本以及至少一个用于剂量估算的测试样本。
  6. 高亮显示在步骤1.1至1.5中创建的所有样本 样本 列表并点击 将样本添加到处理队列 (全内反射，斯涅尔定律方程，光路图，光折射过程示意图) 图标。
  7. 点击 处理队列中的所有样本 (静态平衡，ΣFx=0 方程，示意图，受力平衡分析，物理教育，矢量力）图标以在队列中依次处理所有样本 - 一个 ADCI 处理 对话框出现，其中包含队列中的所有样本以及一个进度条。
  8. 当所有样本完成处理后，单击 色谱过程，ΣFx=0，示意图；用于化学纯化的分离方法及数据分析。保存样本，或点击 将处理后的样本保存至ADCI样本文件 (静态平衡，ΣFx=0，ΣFy=0，示意图，物理概念，受力分析，力的平衡) 图标，以便稍后保存处理后的样本。

2. 图像的查看与选择（可选，推荐步骤）

注意：此步骤描述了中期图像查看器的使用方法以及图像选择模型的创建过程。软件中已包含一些经过验证的图像选择模型，可用于校准曲线生成和剂量估算。因此，此步骤并非必需，但可根据需要将其作为指导，了解完成此类操作所需的步骤。

  1. 在 “样本” 列表中高亮选择一个样本，点击菜单栏中的 “样本”，然后选择 “图像视图”，以打开 “中期图像查看器”。
  2. 在图像间导航
    1. 从下拉框中选择一幅图像以查看特定图像。点击左、右箭头图标可逐幅浏览图像。
    2. 从下拉框中选择一个 SVM Sigma 值，以查看该 Sigma 值下的 DC 检测结果。从下拉框中选择“未处理”以查看无染色体轮廓的原始图像。
    3. 勾选 “反相” 复选框，以反转图像中每个像素的颜色和亮度值。
  3. 勾选 “图像加入观察列表” 复选框，将当前可见图像添加至 “观察列表”。点击 “将观察列表保存为文本文件” (静力平衡示意图；ΣFx=0, MA=0；力矢量、力臂、平衡概念。) 图标，将观察列表中所有图像的名称保存为一个文本文件。
  4. 图像选择模型
    1. 点击 “查看所有图像”（默认选项），以在图像选择下拉框中包含所有图像。观察 “包含的图像” 旁边的文本，以了解当前应用的图像选择模型所选图像的比例。
    2. 点击 “仅查看已包含图像”，以仅在下拉框中包含未被图像选择模型排除的图像。
    3. 点击 “查看被排除图像”，以在下拉框中包含已被当前图像选择模型排除的图像。
    4. 勾选 “排除” 复选框，以手动排除单幅图像。
      注：若后续应用了图像选择模型，手动排除的图像将被重新纳入所选图像集合中。
    5. 点击 “保存选择” 按钮以保存当前图像选择。提示时输入保存选择的文件名。点击 “加载选择” 以应用先前保存的选择。
    6. 点击 “应用图像筛选”，打开 “对当前样本应用基于滤镜的图像选择模型” 对话框，用于创建、保存或应用选择中期图像的标准。
    7. 从预设列表中选择一个图像选择模型。点击 “确定” 以应用当前模型。
    8. 输入所需新模型的描述，定义 “图像排除滤镜”，定义 “图像排序与纳入”，然后点击 “保存选择模型” 以创建图像选择模型。
      注：“图像排序与纳入” 方法及各项 “图像排除滤镜” 的定义详见软件在线文档14。

3. 曲线生成

  1. （推荐的可选步骤）曲线校准向导
    1. 在继续操作前，确保工作区中至少存在三个校准样品。点击 巫师 在菜单栏中选择 曲线校准 打开曲线校准向导。
      注意：尽管从数学角度拟合和计算校准曲线仅需三个样本，但仍建议使用七份或更多样本，其照射剂量范围应覆盖0至5 Gy。额外的样本对于将校准曲线拟合为线性二次剂量-响应关系是必要的；然而，为了获得适用于低剂量估算的曲线，最佳的Sigma值可能需要更低。< 1 Gy）；高于此阈值的剂量，其最佳Sigma值有所不同（参见步骤3.1.4）。
    2. 通过介绍性向导界面，在每个所需的校准样品旁打勾。对于以这种方式选择的每个校准样品，在其相邻的文本字段中指定该样品所接受的物理剂量（单位：Gy）。然后继续进入下一个向导界面。
    3. 如有需要，可从软件内置的预设图像选择模型列表中选择一个图像选择模型，该列表包含软件附带的预设图像选择模型以及任何手动创建的模型。继续进入下一个向导界面。
    4. 从下拉框中选择一个SVM Sigma值。继续进入下一个向导界面.
      注意：建议使用 SVM Sigma 值 1.4 或 1.5 进行剂量估算 > 1 Gy，以及对于低于1 Gy的估计值取为1.0（图2).
    5. 在摘要页面上查看所有先前的选择，然后单击 完成 完成向导，导致预填充 绘制曲线 对话框将出现。

SVM sigma值范围示意图，包含PPV和TPR公式，选择最优σ以平衡各项指标。
图2：SVM算法中sigma值变化对真阳性（TP）和假阳性（FP）树突状细胞计数、阳性预测值（PPV）以及真阳性率（TPR）影响的可视化图示。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 创建曲线对话框。
    1. （如果使用了向导，请跳过此步骤）点击菜单栏中的 “曲线”，然后选择 “新建曲线”。在弹出的对话框中，从下拉框中选择 “拟合剂量-反应数据曲线”，然后点击 “确定”。
    2. 在 “创建曲线” 对话框的 “为新曲线指定唯一标识” 文本框中，输入一个唯一的曲线标识。
    3. （可选）在 “为要创建的曲线添加简短描述” 文本框中输入新曲线的描述信息。
    4. （如果使用曲线向导创建了校准曲线，请跳过以下步骤）设置曲线参数。
      注：第 3.1 步中描述的曲线校准向导会自动填充 “创建曲线” 对话框中的字段。以下步骤说明如何手动填写这些字段。如果已使用向导，仍可根据需要执行以下部分步骤，以添加或删除额外数据。
      1. 从 “SVM” 下拉框的选项中选择一个 SVM Sigma 值——强烈建议此处选择的 Sigma 值与使用该曲线进行剂量估算时所选的 Sigma 值保持一致。
      2. （可选）点击 “指定文件” 按钮，以指定一个图像选择模型。
      3. 点击 “输入” 按钮，向标题为 “输入响应-剂量数据以创建曲线” 的剂量-反应列表中添加一条新的空白条目。
      4. 在 “剂量” 标题下，输入校准样品的剂量（单位：Gy）。
      5. 在 “响应值（DC/细胞）” 字段中，输入当样品被选中时控制台输出的响应值。在控制台中或从相应的样品报告（如第 5.1 步，若有）中，查找与先前选定的 SVM Sigma 值对应的 DC/细胞值，并将该值填入此字段。
      6. 重复前三个步骤，直到所有校准样品均已添加。
    5. 点击 “验证数据”，以确保响应-剂量列表中的内容格式正确——确认响应-剂量列表中的所有字段均显示为绿色高亮，表示数据有效。
    6. 点击 “确定”，完成曲线的创建。若要保存新曲线，可在点击 “确定” 后弹出的 “保存曲线？” 对话框中进行保存。或者，稍后可在 “曲线” 列表中点击 “将曲线保存为 ADCI 曲线文件” 图标（静态平衡图，ΣFx=0，受力体示意图，教育用物理概念，研究学习）进行保存。

4. 剂量估算

  1. （推荐的可选步骤）剂量估算向导
    1. 在菜单栏中点击 “向导”，然后选择 “剂量估算”。
    2. 浏览向导介绍页面，从下拉框中选择先前创建的校准曲线——其属性将显示在下方。继续进入下一个向导页面。
    3. 在未知暴露剂量的测试样本旁打勾，以将其包含在剂量估算中。继续进入下一个向导页面。
    4. 查看在校准曲线生成过程中所应用的图像选择模型的描述和属性。确认相同的图像选择模型将应用于所选的测试样本。继续进入下一个向导页面。
      注意：在图像选择模型描述下方，系统已预填入相同的模型，并将应用于所选测试样本。请对校准样本和测试样本使用相同的图像选择模型。尽管可通过下拉菜单选择不同的模型来应用不同模型，但不推荐此操作。
    5. 从下拉菜单中选择一个SVM Sigma值。继续进入下一个向导页面。
      注意：校准曲线生成过程中使用的SVM Sigma值已被预填入，建议保持该值不变。
    6. 在摘要页面上检查之前的选项，点击 “完成” 以结束向导——将弹出一个已预填信息的 “剂量计算器” 对话框。
  2. 剂量计算器
    1. （若已使用向导，则跳过此步骤）在“曲线”标题下的曲线列表中高亮选择一条校准曲线，点击菜单栏中的 “曲线”，然后选择 “计算剂量”，以打开 “剂量计算器” 对话框。
    2. （若已使用向导，则跳过这些步骤）设置剂量估算的相关参数。
      注意：第4.1步中描述的剂量估算向导会自动预填 “剂量计算器” 对话框中的字段。以下步骤说明如何手动填写这些字段。如果已使用向导，仍可根据需要执行以下部分步骤，以添加或删除额外数据。
      1. 点击 “使用工作区中的样本填充DC频率”（Quantum mechanics equations; Schrödinger equation; vector field diagram; wavefunction analysis.）图标，并在 “ADCI工作区中的已处理样本” 列表中高亮选择测试样本，以将所选样本添加至 “用于剂量估算的DC频率” 列表中。
      2. 从下拉框中为这些样本选择SVM Sigma值和图像选择模型。
        注意：为实现准确的剂量估算，所用SVM Sigma值必须与校准曲线生成时使用的Sigma值一致。与校准曲线相关的Sigma值列在“剂量计算器”对话框底部。
      3. （可选）通过重复前两个步骤添加更多测试样本。或者，也可在 “工作区中的已处理样本” 列表中同时高亮多个样本，以批量添加。
      4. （可选）点击 “输入DC频率值”（Static equilibrium, ΣFx=0, body diagram; educational vector and force analysis method.）图标，手动输入一个不关联任何样本的DC频率值——新输入的DC频率将被添加到 “用于剂量估算的DC畸变” 列表中。
      5. （可选）双击手动输入的DC频率的 “名称” 字段，以修改其名称。
      6. （可选）高亮选中相关样本，然后点击 “移除DC频率”（Microscopy analysis; DNA sequencing setup; electrophoresis results diagram; gene expression data.）图标，以移除误添加至 “用于剂量估算的DC畸变” 列表中的样本。
    3. 点击 “确定” 关闭 “剂量计算器” 并执行剂量估算——结果将以表格形式输出至控制台。
    4. 当剂量估算结果以表格形式在控制台中为每个测试样本显示时，请查看 “DC频率”、“SVM”、“估算剂量”（包含测试样本的估算生物剂量，单位为Gy）以及 “应用的图像选择模型” 字段。

5. 报告

注意：报告的命名方法以及选择其保存目录的方式适用于所有类型的报告。“报告名称”必须提供。生成报告时，系统将自动使用该名称创建一个包含报告文件的目录。此目录将被放置在“报告文件夹”内。默认情况下，“报告文件夹”是安装过程中指定的数据目录下的一个名为'Reports'的目录。

  1. 样本报告
    1. 点击 报告 在菜单栏中选择 样本报告 打开 生成样本报告 对话。
    2. 为报告输入一个名称 报告名称 文本框。点击“浏览”以修改 报告文件夹 如需要。
    3. 选择至少一个已处理的样本，通过在相应样本旁打勾将其包含在报告中 选择样本 列表
    4. 指定支持向量机（SVM）Sigma值的范围，以生成DC分布图，方法是选择其中的数值 最小 和 Max 下拉框内 样本中DCs的分布 区域。如不需要，可通过取消勾选从报告中排除直流分布图 包括 复选框中的 样本中DCs的分布 区域。
    5. 指定要在报告中包含哪些带有过滤统计信息的图表，方法是在相应图表旁打勾 选择图示 区域。点击 好的 生成报告。
  2. 曲线报告
    1. 点击 报告 在菜单栏中选择 曲线报告 打开 生成曲线报告 对话。
    2. 为报告输入一个名称 报告名称 文本框。单击 浏览 以修饰 报告文件夹 如需要。
    3. 在相应的曲线旁打勾，选择至少一条曲线包含在报告中 选择要包含在报告中的曲线 列表。点击 好的 生成报告。
  3. 剂量估算报告
    1. 执行第4节中描述的剂量估算步骤。
      注意：剂量估算报告是根据图表区域和控制台区域中显示的结果生成的。因此，在生成报告时，图表区域中必须存在剂量估算图。
    2. 点击 报告 在菜单栏中选择 剂量估算报告 打开 生成剂量估算报告 对话。
    3. 为报告输入一个名称 报告名称 文本框。单击 浏览 以修饰 报告文件夹 如需要。
    4. 点击 好的 生成报告。

6. 审计功能

注意：该软件会将一次会话期间执行的所有操作记录在日志文件中。程序提供了一个辅助软件应用程序，可用于查看和搜索日志文件，评估分析的完整性，并在某些情况下，从不完整或提前终止的会话中恢复样本数据。

  1. 点击 帮助 在菜单栏中选择 查看日志 打开日志文件查看器附加软件。
  2. 确保日志文件显示在窗口左侧的侧边栏中。如果未显示任何文件，请单击 文件，选择 选择日志文件目录，并浏览至包含日志文件的目录。
  3. 在侧边栏中双击日志文件的名称，即可在“查看器”选项卡中查看日志文件内容。
  4. 选择“搜索”选项卡，输入搜索关键词以搜索一个或多个日志文件。
    1. 如需，可输入搜索参数 从, 到, 用户, 许可, 操作，以及 参数 领域。
    2. 使用滑块进行选择 每个文件的最大搜索结果数.
      注意：某些搜索参数（如用户名）将在每个匹配的日志文件中返回大量结果。此参数用于限制每个日志文件中显示的搜索结果数量。
    3. 在...处打勾 仅搜索高亮文件 复选框（默认搜索所有日志文件），并在侧边栏中高亮显示日志文件，以仅搜索部分日志文件。
    4. 检查 执行完整性检查 复选框（默认启用），用于检查每个符合条件的日志文件，以查找与软件意外终止相关的错误。
    5. 点击 搜索 在窗口右侧搜索日志文件并查看搜索结果。
    6. 点击 查看日志文件 按钮，以突出显示并查看搜索结果中指定的行 观众 表。
  5. 日志文件完整性问题
    1. 单击“完整性”标签，以查看完整性检查过程中发现的错误（如果已请求执行该检查）。
      注意：必须执行搜索以检查日志文件的完整性问题。若要在不针对任何搜索词搜索日志文件的情况下执行完整性检查，只需将所有搜索参数字段留空即可 搜索 标签，确保 执行完整性检查 已检查，并单击 搜索. 如果发现完整性问题，应 完整性 标签背景色将变为红色。
    2. 尽可能按日志文件分组解决完整性问题。
      注意：有关解决完整性问题的更多步骤信息，请参阅在线文档14.

7. 曲线和剂量估算统计选项

  1. 点击 设置 在菜单栏中并选择 统计选项 打开 统计选项 对话。
  2. 从下拉框中选择校准曲线拟合方法（最小二乘法或最大似然法）。
  3. 在旁边打勾 如适用，显示校准曲线的95%置信区间 绘制校准曲线时显示95%置信区间。
  4. 在旁边打勾 剂量估算因泊松分布计算95%置信区间 基于染色体畸变（DC）产额的泊松特性，计算剂量估计值的95%置信限。
  5. 在旁边打上勾选标记 由于曲线原因，剂量估算会计算95%置信区间（如适用） 基于校准曲线相关的不确定性，计算剂量估计值的95%置信限。

结果

使用来自HC和CNL的中期染色体图像数据对软件进行了测试。血液样本由HC校准的XRAD-320装置（250 kV X射线，12.5 mA，2mm Al滤波，剂量率：0.92 或 1.7 Gy/min）进行照射，并在两个实验室中进行处理。外周血淋巴细胞样本在各实验室根据既定方案进行培养、固定和染色3,15。各实验室使用自动化显微镜系统独立采集吉姆萨染色玻片上的中期图像。各实验室的专家手动分析了其中若干样本中的双着丝粒染色体（DC），构建各自的校准曲线，并对暴露史未知的测试样本进行剂量估算。这些数据集的详细描述见表1。

物理剂量用途HC 制备CNL 制备
所用名称图像数量所用名称图像数量
0 Gy校准HC0Gy731CNL0Gy798
0.1 Gy校准HC01Gy2162NANA
0.25 Gy校准HC025Gy1826NANA
0.5 Gy校准HC05Gy1054CNL05Gy1532
0.75 Gy校准HC075Gy1233NANA
1 Gy校准HC1Gy1566CNL1Gy841
2 Gy校准HC2Gy1147CNL2Gy996
3 Gy校准HC3Gy1212CNL3Gy1188
4 Gy校准HC4Gy909CNL4Gy1635
5 Gy校准HC5Gy1019NANA
3.1 Gy测试HCS01540CNLS01500
2.3 Gy测试HCS08637CNLS08500
1.4 Gy测试HCS10708NANA
1.8 Gy测试HCS04600CNLS04957
2.8 Gy测试HCS051136CNLS051527
3.4 Gy测试HCS07477CNLS07735

表1： HC和CNL为软件评估提供的图像数据来源。
脚注：修改自Rogan 等，20164中的表1。此前我们仅能从CNL获得手动预筛选的图像。现已有未经过滤的图像，图像数量已相应更新。此外，本文还展示了新获取的HC样本（0.25 Gy、0.75 Gy和5 Gy）。

样本中的自动图像选择

图像质量对于染色体畸变分析中正确检测染色体畸变（DC）至关重要。在传统的染色体畸变分析中，细胞遗传学专家通常手动选择图像。ADCI 采用定量的图像标准，在计算染色体畸变频率前自动筛选图像16。用户既可根据特定的染色体形态过滤图像，也可根据已知正常人类核型中细胞遗传学定义的染色体组相对长度比例对细胞进行排序（称为组-箱距离法）。可用的形态学滤波器采用尺度不变的阈值，排除染色体数目不完整、含多个中期分裂相、存在早中期染色体、姐妹染色单体明显分离、染色体高度弯曲或扭曲、含有轮廓平滑且具有完整细胞核特征的物体，以及被识别为染色体的物体数量过少的细胞图像。图3（a）和（b）展示了被选中的图像示例，而图3（c）和（d）则是被软件过滤掉的图像示例。这些图像来源于样本 HCS05（见表1），并由预定义的图像选择模型筛选得出；该模型根据组-箱距离对所有图像进行排序，并选取排名前250的图像。图3（a）和（b）中的染色体分离良好，形态满意。图3（c）包含大量重叠的染色体簇。图3（d）显示严重的姐妹染色单体分离现象，至少有8条染色体的姐妹染色单体完全分离，且大多数其他染色体的着丝粒缩窄区域模糊不清。


染色体核型分析；中期分裂相，显微镜图像，细胞遗传学分析。
图3：样本HCS05的中期图像示例（放大倍数：63X），包括模型“组间距离法，前250张图像”筛选出的和未筛选出的图像。 (A) 和 (B) 为被选中的图像。(C) 和 (D) 为模型排除的图像。(C) 因染色体重叠过多而被排除，(D) 因存在过多分离的姐妹染色单体而被排除。请点击此处查看该图的高清版本。

通过分析样本中DC检测的置信水平，可以明显看出应用这些图像筛选模型的效果。在照射样本的细胞群体中，DC出现的频率符合泊松分布。卡方拟合优度检验将观察到的DC频率分布与预期的泊松分布拟合情况进行比较。能够有效过滤样本数据的模型，其DC频率与预期泊松分布值之间无显著差异（通常显著性水平 >0.01）。图4展示了全部图像与仅由“组箱距离，前250张图像”模型筛选出的图像所对应的HC4Gy样本中DC出现情况及其对泊松分布的拟合结果。图4（b）显示了更优的泊松分布拟合效果。经过筛选的图像组的p值（0.36）显著高于图4（a）中未筛选DC分布的p值。在5%或1%的显著性水平下，图4（a）中的未筛选样本可靠性较低，因为其中包含质量较差的DC数据，导致DC服从泊松分布的零假设被拒绝。

中期频率与符合泊松分布的DC数量的直方图，统计分析图表。
图4： 软件中样本HC4Gy的成比例DC频率拟合至泊松分布的截图。 (A) 包含所有图像，(B) 仅包含模型筛选的图像（按组箱距离排序，前250张图像）。图例（右上角）显示了拟合至泊松分布的统计结果（离散指数、Mu检验和Lambda值）以及卡方拟合优度检验（p值）请点击此处查看该图的放大版本。

双着丝粒染色体（DC）检测

准确的双着丝粒染色体（DC）检测是双着丝粒染色体分析法（ADCI）的关键先决条件。被软件正确检测到的DC和被遗漏的DC分别定义为真阳性（TP）和假阴性（FN）。并非DC却被错误识别为DC的结构被称为假阳性（FP）。FP包括单着丝粒染色体、染色体片段、分离的姐妹染色单体、重叠的染色体簇以及非染色体结构。图5展示了在两幅中期图像中DC检测的结果。对象1和对象3为TP，而对象4是一个FP，由两条短臂相连的独立单着丝粒染色体组成。在图5（a）中，对象2最初为FP，但随后被软件中的FP滤波器校正。在图5（b）中的对象5和对象6可能是FN的典型示例。

染色体分析；显微镜视野中的有丝分裂中期染色体片段，荧光显微镜结果。
图5： 截图显示潜在双着丝粒染色体（DCs）的中期染色体分类。（A） 样本 CNL1Gy 的图像（放大倍数：63X），显示1个真阳性（TP），对象“1”；以及1个经校正的假阳性（FP），对象“2”。（B） 样本 CNL4Gy 的图像（放大倍数：63X），显示1个真阳性（TP），对象“3”；1个假阳性（FP），对象“4”；以及2个潜在的假阴性（FN），对象“5”和“6”。真阳性（TP）、经校正的假阳性、正常的单着丝粒染色体以及未分类染色体分别用红色、黄色、绿色和蓝色轮廓标出。请点击此处查看该图的放大版本。

测试样品的剂量估算

ADCI分析的最终结果是根据校准曲线推断出的样品剂量估计值。软件对测试样品所作的剂量估计在 表1 如图所示 表 2 和 3作为对比，列出了HC专家对样本HCS01、HCS08和HCS10所测定的物理辐射剂量及人工评分剂量；同样，CNL专家对样本CNLS04、CNLS05和CNLS07的物理剂量和人工评分剂量也予以展示。

图6展示了加拿大卫生部生物剂量学实验室样本HCS01、HCS08、HCS10、HCS04、HCS05和HCS07的辐射剂量估计校准曲线。校准曲线使用样本HC0Gy、HC1Gy、HC2Gy、HC3Gy和HC4Gy生成。所有样本均应用了包含3个基于Z分数的滤波器以及“组箱距离，前250张图像”的图像筛选模型。剂量估计结果及相关统计分析见表2。

带有 DCS/中期细胞与 Gv 关系的平衡图；包含离散数据点的图表。
图 6： HC 测试样本剂量估算截图。 黑色方块代表校准样本。测试样本和校准样本中的图像由模型选定（3 个假阳性滤波器 + 组箱距离，前 250 张图像）。粗虚线表示通过校准曲线将双着丝粒细胞/中期细胞（DCs/中期细胞）映射至估算剂量。细虚线表示双着丝粒细胞/中期细胞的 95% 置信区间的上下限。测试样本的颜色编码：亮红色，HC S01（物理剂量：3.1Gy，HC 推断剂量：3.4Gy，ADCI：3Gy）；深绿色，HC S04（物理剂量：1.8Gy，ADCI：1.85Gy）；亮蓝色，HC S05（物理剂量：2.8Gy，ADCI：2.95Gy）；深蓝色，HC S07（物理剂量：3.4Gy，ADCI：2.35Gy）；深红色，HC S08（物理剂量：2.3Gy，HC 推断剂量：2.5Gy，ADCI：2Gy）；亮绿色，HC S10（物理剂量：1.4Gy，HC 推断剂量：1.4Gy，ADCI：0.95Gy）。 请点击此处查看此图的放大版本。

样本物理剂量HC 推断剂量ADCI 估算剂量估算剂量 LCL估算剂量 UCLP 值*
HCS013.13.432.33.80.117
HCS082.32.521.42.70.815
HCS101.41.40.950.51.550.211
HCS041.8NA1.851.252.550.0293
HCS052.8NA2.952.253.750.00354
HCS073.4NA2.351.73.10.0002

表2： HC测试样本的剂量估算结果。
注释：改编自Rogan 等，2016年4中的表3。先前报道的ADCI剂量估算基于未滤波的图像，且采用最小二乘法进行曲线拟合。本研究中，校准曲线采用最大似然法拟合，并在剂量估算前应用了包含3个FP滤波器及“组箱距离，前250张图像”的图像筛选模型。估算剂量的UCL和LCL分别指基于DC产额的泊松特性的剂量估算值的95%置信上限和下限。* 卡方拟合优度检验与理论泊松分布的比较；NA：未提供手动推断剂量的结果。

加拿大核实验室样品 CNLS04、CNLS05、CNLS07、CNLS01 和 CNLS08 的辐射剂量估计值如图7所示。校准曲线使用样品 CNL0Gy、CNL0.5Gy、CNL1Gy、CNL2Gy、CNL3Gy 和 CNL4Gy 生成。我们对所有样品应用了包含6个FP滤光片的图像筛选模型。统计分析结果见表3。

显示绘制数据集的剂量-反应曲线图；分析辐射对细胞周期时相的影响。
图7： CNL测试样本剂量估算截图。 黑色方块代表校准样本。测试样本和校准样本中的图像使用6个FP滤光片进行选择。粗虚线表示通过校准曲线将双着丝粒细胞/中期细胞（DCs/Metaphase）映射至估算剂量。细虚线表示双着丝粒细胞/中期细胞的95%置信区间的上下限。测试样本的颜色编码如下：亮红色，CNL S04（物理剂量：1.8Gy，CNL推断剂量：1.7Gy，ADCI：1.95Gy）；深红色，CNL S05（物理剂量：2.8Gy，CNL推断剂量：2.7Gy，ADCI：3.05Gy）；亮绿色，CNL S07（物理剂量：3.4Gy，CNL推断剂量：3.1Gy，ADCI：3.4Gy）；深绿色，CNL S01（物理剂量：3.1Gy，ADCI：3.75Gy）；蓝色，CNL S08（物理剂量：2.3Gy，ADCI：2.8Gy）。请点击此处查看该图的放大版本。

样本物理剂量CNL 推断剂量ADCI 估算剂量估算剂量 LCL估算剂量 UCLP 值*
CNLS041.81.71.951.252.450.0545
CNLS052.82.73.052.753.350.325
CNLS073.43.13.433.750.473
CNLS013.1NA3.753.35>47.63E-11
CNLS082.3NA2.82.253.30.777

表3： CNL测试样本的剂量估算结果。
脚注：改编自Rogan 等，2016年4的表3。先前报道的ADCI剂量估算基于未过滤（HC）或手动筛选（CNL）的图像，并采用最小二乘法进行曲线拟合。本研究中，校准曲线采用最大似然法拟合，并在剂量估算前应用了包含3个假阳性过滤器及“组箱距离前250张图像”的图像筛选模型。估算剂量的UCL和LCL分别指基于双着丝粒产额的泊松分布特性计算得到的95%置信上限和下限。
* 卡方检验用于评估与理论泊松分布的拟合优度；NA：手动推断剂量的结果不可用。

在软件中可对校准曲线线性范围内（<1 Gy）的辐射剂量进行估算，但建议采用1.0的Sigma值，以进一步降低双核细胞（DCs）分类错误的发生频率（图8）。


染色体损伤分析；两张比较不同辐射剂量（Gy）下双着丝粒染色体/中期细胞比率的图表
图8： 在不同Sigma值下由HC校准样本生成的两条校准曲线的截图。（A） HC校准样本：0 Gy、2 Gy、3 Gy、4 Gy和5 Gy，Sigma = 1.5。（B） HC校准样本：0 Gy、0.25 Gy、0.5 Gy、0.75 Gy、1 Gy、2 Gy、3 Gy、4 Gy和5 Gy，采用SVM方法，Sigma = 1.0。请点击此处查看该图的放大版本。

这些分析表明，专家与软件在解读物理剂量与生物学推断剂量时，存在微小但可接受的差异。将手动或软件估算结果与物理剂量之间的差异称为“误差”。由HC和CNL手动评分的样本推断剂量误差均≤0.3 Gy。软件的自动化处理准确性低于专家，但总体仍在国际原子能机构（IAEA）规定的±0.5 Gy分诊限值范围内3。对于表2和表3中的大多数测试样本，软件在此阈值范围内给出了正确结果。然而，HCS07和CNLS01的泊松分布拟合优度较差，提示这些样本在图像和双着丝粒（DC）质量方面可能存在潜在问题，而图像与荧光点（FP）选择模型的应用未能解决这些问题。在HCS05样本中，p值显著性阈值显得过于严格，尽管软件准确地确定了正确的剂量。

讨论

软件的功能与局限性

本文所述方案介绍了在ADCI中导入和处理细胞遗传学中期图像、建立辐射校准曲线以及估算暴露于未知辐射水平的个体或样品的生物剂量时常用的逐步操作流程。然而，这些步骤无需严格按照顺序执行。例如，可使用同一条预先计算好的校准曲线来处理和分析多个未知剂量的待测样品。此外，在完成处理后，用户可对图像筛选和双着丝粒染色体（DC）过滤模型进行迭代优化。合适的图像筛选模型的应用取决于中期图像数据的特征与质量，而后者又与用于细胞制备的实验室方案以及使用自动化中期细胞捕获系统时所采用的筛选严格性标准密切相关。不同生物剂量估算和细胞遗传学实验室之间的染色体形态可能存在差异，因此用户应评估软件提供的预设图像筛选模型是否足以产生准确的剂量估算结果，或是否需要创建具有自定义阈值的个性化模型。根据我们的经验，图像筛选模型的有效性受细胞图像来源和质量的影响。用户可利用不同滤波器的组合来自行设计图像筛选标准，以消除假阳性的DC，并结合相应的阈值选择理想的图像。在校准曲线输入和剂量估算方面具有灵活性，线性-二次曲线的系数以及DC频率可被修改或手动输入。

尽管该软件完全自动化，但仍可手动查看和选择图像。通过主图形用户界面中的显微镜查看器功能，可使用此功能来包含或排除单独处理的图像。然而，由于实现了自动化，该软件在处理中期图像和计数双着丝粒染色体（DCs）方面，效率显著高于人工评分。在多核高性能工作站上，包含1000张图像的样本可在20分钟（tif格式）至40分钟（jpg格式）内完成处理。该软件在时间紧迫或劳动密集型场景中尤为有用，例如多人已暴露或疑似暴露于辐射的情况下，或需要及时做出诊断和治疗决策的场合。

精确且准确的高通量检测双着丝粒染色体（DCs）以及剂量估算，对于无人值守的辐射评估至关重要。目前其他可用的软件替代方案均无法同时满足这两项要求。一种由用户辅助的基于图像的细胞遗传学分析方法（DCScore，Metasystems）17系统由于染色体未校正重叠导致的高错误率，需要对候选双着丝粒体（DCs）进行人工验证，且该系统无法确定辐射剂量。在涉及大量潜在受照人群的辐射事件中，DCScore 的效果不如自动双着丝粒体识别指数（ADCI）。大孔径显微镜系统能够采集多个中期细胞的图像18然而，它们并不分析这些内容。 "CABAS"19 和 "剂量估算"20 软件可生成校准曲线并估算剂量，但无法对双链断裂焦点（DCs）进行计分。其他不基于DC分析的生物剂量测定方法包括H2AX荧光、荧光 原位 使用针对特定染色体的DNA探针进行杂交、基因表达分析、微核试验以及尿液和呼吸生物标志物检测。这些方法对电离辐射的特异性和敏感性较低，某些情况下成本更高、耗时更长，且尚未在多个参考实验室之间实现标准化。大多数此类技术无法检测稳定的辐射反应，因此不能用于长期评估。>暴露后7天）的辐射剂量。相比之下，该方法可评估暴露后长达90天的个体，并可处理来自任何细胞遗传学实验室显微镜成像系统的数据。然而，如果样本被采集 >暴露后4周，由于双着丝粒畸变的衰减，敏感性降低1,2,3 目前该软件未对采样暴露个体时的延迟校正直流频率。

该软件存在一些局限性。现有的图像筛选模型大多能够选出可接受的中期相图像，但在某些情况下仍无法完全排除不满意的图像，这可能降低双着丝粒染色体（DC）检测的准确性。如何设计一个能够剔除所有不合格中期相细胞的满意图像筛选模型，目前仍是一个未解决的问题。该软件对接受较高辐射剂量（≥ 2 Gy）的样本可提供准确的估算结果。尽管在减少假阳性DC数量方面已取得显著进展16，但这些假阳性对象尚未被完全消除。在低辐射剂量下（特别是< 1 Gy），质量较差的中期相细胞更容易产生假阳性DC检测结果。因此，在生成用于HC测试样本剂量估算的校准曲线时，未包含低剂量样本。然而，如果需要包含低剂量样本的曲线，降低SVM的Sigma值可减少低剂量样本中的假阳性计数，但可能导致高剂量样本中的DC检出率降低。图8比较了用于剂量估算的HC曲线（Sigma = 1.5）与在较低SVM Sigma值（1.0）下拟合并包含额外低剂量样本的校准曲线。对于中期相细胞数量不足和/或中期相图像质量较差的样本，可能无法精确估算低剂量下的生物学暴露水平，导致估算结果与物理剂量的偏差超过0.5 Gy。

如果辐射类型的剂量-反应曲线最适合线性或近线性模型，该软件可能无法准确评估此类辐射。迄今为止，该软件仅在暴露于X射线和γ射线的样本上进行过测试。若需检测其他辐射源，用户必须确保校准样本和测试样本均暴露于同一种类型的辐射。软件采用最大似然法或最小二乘法拟合，基于线性-二次模型构建剂量-反应曲线。目前尚无选项可强制进行严格的线性曲线拟合（适用于高能粒子照射），但该功能将在未来版本中提供。

未来发展

我们目前的工作重点是改进图像选择模型和精确的剂量测量，特别是针对暴露于低辐射剂量的样本。后续的软件版本将提供剂量估计的标准误差测量以及校准曲线的置信区间。此外，正在为蓝基因（Blue Gene，BG/Q，IBM）超级计算机开发该软件的高性能计算版本，以便及时评估在大规模伤亡辐射事件中暴露的个体。该平台已测试并部署了软件的部分组件11。

披露

PKR 和 JHMK 共同创立了 CytoGnomix 公司，该公司正在将 ADCI 技术商业化，并拥有相关专利。YL 和 BCS 是 CytoGnomix 公司的员工。ADCI 受版权保护，其包含的着丝粒定位方法已获得专利（美国专利号 8,605,981；德国专利号 112011103687）。

致谢

我们感谢加拿大卫生部辐射生物学与防护部门的 Ruth Wilkins 博士、加拿大核实验室的 Farrah Flegal 及其实验室工作人员，允许我们使用其细胞遗传生物剂量学实验室的中期图像数据。本文得到了加拿大创新建设项目的合同支持（编号：EN579-172270/001/SC），受助单位为 CytoGnomix 公司。ADCI 的初始版本及算法开发得到了西部创新基金、加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC 发现基金 371758-2009）、美国公共卫生服务（DART-DOSE CMCR，5U01AI091173-0）、加拿大创新基金会、加拿大研究席位以及 CytoGnomix 公司的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
自动化双着丝粒染色体识别与剂量估算系统（ADCI）CytoGnomixNAADCI 软件以适用于 Microsoft Windows 7、8、8.1 和 10 的二进制安装包形式发布；典型安装需要 235 Mb 的磁盘存储空间。该软件已在 Intel 或 AMD x86-64 处理器上进行测试；建议至少配备 1 Gb 内存。分析性能基准测试在配置 Intel I7 处理器和 16 Gb 内存的计算机上完成。ADCI 的运行需要有效的许可证和基于 USB 的硬件加密狗，且在软件执行期间该加密狗必须保持插入状态。加密狗中编码了软件的过期日期。每次启动软件时，系统会读取此日期；若当前日期和时间早于过期时间戳，则允许访问程序。已过期的软件许可证可通过获取新的加密狗，或在启动时使用更新的密钥续订许可证来延长使用期限。
中期细胞核的数字图像示例：Metasystems、Leica MicrosystemsM-Search（Metasystems）、Cytovision（Leica）软件高分辨率 TIFF 格式；通常由显微镜成像采集系统生成 >250 张数字图像（物镜放大倍数至少 63X，目镜放大倍数 10X）。
MSI Leopard Pro（推荐，可选）Micro-Star InternationalMSI GP62 6QF 480CA Leopard Pro多核性能工作站。

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